Yöntem makalesi

Osteoartrit için otofaji modülatörlerinin tanımlanması için akı bazlı test

DOI:

10.3791/61078

⸱

8 Temmuz 2020

 ,  ,  ,  , 
1Grupo de Biología del Cartílago, Servicio de Reumatología, Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña (INIBIC), Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña, 2Biofarma Research Group, Center for Research in Molecular Medicine and Chronic Diseases (CIMUS), Universidad de Santiago de Compostela

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, hücre bazlı görüntüleme taraması ile yeni molekülleri tanımlamak için otofaji akışının izlenmesini detaylandırmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otofaji, homeostazı düzenlemek için merkezi bir mekanizmadır. Otofaji değişiklikleri yaşlanmaya bağlı hastalıklara katkıda bulunur. Otofaji düzenleyicilerini tanımlamak için fenotipik yöntemler, yeni terapötiklerin tanımlanması için kullanılabilir. Bu makale, insan kondrositlerinde otofajik akı (mCherry-EGFP-LC3B) raportörü olarak LC3 kullanarak otofajik akıyı izlemek için geliştirilen hücre tabanlı bir görüntüleme tarama iş akışını açıklamaktadır. Veri toplama, otomatik bir Yüksek İçerikli Görüntüleme Tarama Sistemi mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilir. Otofajik akıyı aktive eden molekülleri tanımlamak için algoritma tabanlı bir otomatik görüntü analiz protokolü geliştirildi ve doğrulandı. Mevcut otofaji izleme protokolleri üzerindeki kritik adımlar, açıklayıcı notlar ve iyileştirmeler rapor edilmektedir. Yaşlanmanın ayırt edici özelliklerini hedeflemek için fizyolojik olarak ilgili fenotipik tarama yaklaşımları, yaşa bağlı kas-iskelet sistemi hastalıkları için daha etkili ilaç keşif stratejilerini kolaylaştırabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok kronik hastalık, kusurlu otofaji1 dahil olmak üzere yaşlanmanın ayırt edici özellikleri ile ilişkilidir. Osteoartrit (OA) en yaygın eklem hastalığıdır ve yaşlanan popülasyonda günlük aktiviteleri kısıtlamada önemli bir etkiye sahiptir, ancak ne önleyici tedbirler ne de hastalık modifiye edici tedaviler henüz mevcut değildir2.

Eklem yaşlanması ve OA, kusurlu otofaji ve yaşlanma dahil olmak üzere kıkırdak dejenerasyonunun ilerlemesini tanımlayan ayırt edici özelliklerle ilişkilidir 3,4. Kas-iskelet sistemi dokularında otofajiyi hedeflemek, romatolojik hastalıklar için terapötik yeniliklerin bulunmasına yardımcı olabilir 5,6. Otofajinin farmakolojik modülasyonu, klinik öncesi hastalık modellerine müdahale için umut verici, ilgili bir mekanizmadır7. OA'da, eklem disfonksiyonunu önlemek için otofaji aktivasyonu kullanılmıştır8. Kantitatif analize izin veren sağlam, tekrarlanabilir protokollere dayalı otofajiyi izleme yöntemleri, yeni ajanları tanımlamak ve yaşlanmanın hastalıkla ilgili ayırt edici özelliklerinin farmakolojik hedeflemesini kolaylaştırmak için kullanılabilir.

Otofaji akısı, bozunma aktivitesini yansıtır ve otofajiyi aktive eden yeni molekülleri tanımlamak için ilgili bir ölçümdür9. Bu çalışma, insan kondrositlerinde (TC28a2) bir otofaji raportör hücre hattı kullanarak otofajik bozunma aktivitesini ölçerek otofajik akıyı belirlemek için geliştirilen bir yöntemi açıklamaktadır. mCherry-EGFP-LC3- geçici ekspresyon, canlı hücrelerin lizozomlarındaki GFP ve mCherry LC3 sinyalleri arasındaki pH duyarlılığındaki farklılıkları ölçerek otolizozom oluşumu ve bozunma olaylarının eşzamanlı olarak izlenmesine izin verir10.

Flow sitometri ile bildirilen bu yöntemin canlı kondrositlerde stabil ekspresyon görüntüleme izleme sistemine uyarlanması, kıkırdak biyolojisi bağlamında otofajik akıyı aktive eden moleküllerin tanımlanmasına olanak sağlayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ölümsüzleştirilmiş insan kondrositlerinin otofaji raportör hücre hattının oluşturulması

NOT: Bir akış sitometrisi kantitatif okuması oluşturarak pBABE-mCherry-GFP-LC3'ün stabil transfeksiyonu ile bir otofaji raportör hücre hattının oluşturulması daha önce açıklanmıştır11. Retroviral transfeksiyonda iki hücre hattı kullanıldı: kotransfeksiyon işlemi sırasında HEK 293-T17 ve enfeksiyon basamağında T/C28a2.

  1. Kotransfeksiyon süreci
    1. HEK 293-T17 hücreleri için büyüme ortamını hazırlayın: 500 mL Eagle'ın minimum esansiyel ortamı (EMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin (P / S). Büyüme ortamını 4 °C'de saklayın ve her kullanımdan önce 37 °C'ye kadar ısıtın.
    2. 1 x 106 HEK 293-T17 hücresini 100 mm'lik hücre kültürü plakalarına oyuk başına tohumlayın, 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin ve kotransfeksiyon işlemine başlamadan önce ~% 75 birleşim noktasında olduklarından emin olun.
    3. Kültür ortamını çıkarın, Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile durulayın ve% 2 FBS ve% 1 P / S ile 8 mL EMEM ekleyin.
    4. Konik bir tüpe 10 μg, 3 μg ve 7 μg pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B, VSV ekleyin. Sırasıyla G ve pCL-Eco plazmitleri. Daha sonra 200 μL 1x indirgenmiş serum ortamı ekleyin (Malzeme Tablosu). 1: 3 oranına (1 μg DNA: 3 μg transfeksiyon reaktifi; nihai hacim = 60 μL) sahip olmak için lipozomal olmayan bir lipit karışımı olarak transfeksiyon reaktifi (Malzeme Tablosu) ekleyin.
      NOT: Transfekte edilecek her 10 cm'lik hücre plakası için toplam 20 μg karışım hazırlanır.
    5. Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Transfeksiyon karışımını HEK 293-T17 paketleme hücrelerine damla damla dikkatlice aktarın. Floresan mikroskobu ile yeşil ve kırmızı protein ekspresyonunu kontrol etmeden önce hücreleri en az 48 saat 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
      NOT: Bu koşullar altında, hücrelerin %75'inden fazlası floresan için pozitif olmalıdır. Transfeksiyon verimliliğinin yüksek olduğundan emin olun (örneğin, hücrelerin %75'inden fazlası pozitiftir). Yüksek kaliteli plazmid DNA (örneğin, ağırlıklı olarak süper sarmal ve genomik DNA, RNA ve protein içermez; yüksek konsantrasyonlu; endotoksin ve tuz içermez) ve yüksek kaliteli hücre kültürleri (örneğin, homojen, düşük geçişli, tek katmanlı, üstel büyüme fazında transfekte edilmiş, mikoplazma içermez) kullanın.
  2. Kotransfeksiyonun aynı gününde, T / C28a2 kondrositlerini hazırlayın.
    1. T / C28a2 hücre büyüme ortamını hazırlayın: 500 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM),% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve% 1 P / S. Büyüme ortamını 4 ° C'de saklayın ve her kullanımdan önce 37 ° C'ye ısıtın.
    2. 2 x 105 T / C28a2 kondrositlerini iki 6 kuyulu çoklu plakaya tohumlayın ve 37 ° C ve% 5 CO2'de 48 saat inkübe edin.
  3. Retroviral enfeksiyon süreci
    1. Adım 1.1.5'ten elde edilen HEK 293-T17 retroviral paketleme hücrelerinden aspirat kültürü ortamı. 1x'i 4 mL HBSS ile durulayın ve HBSS'yi aspire edin.
    2. 2 mL tripsin ekleyin ve 37 °C'de 2 dakika bekleyin. 15 mL konik tüplere 6 mL HEK 293-T17 kültür ortamı ve transfer hücreleri ve ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin.
    3. Hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatantı 0.45 μm'lik bir membrandan steril bir filtreye aktarın.
    4. T / C28a2 kondrosit kültür ortamını 6 kuyulu çoklu plakadan aspire edin. T / C28a2 hücrelerini, 6 kuyucuklu çoklu plakaya kuyucuk başına 2 mL viral süspansiyon (adım 1.3.3) ekleyerek enfekte edin. Kontrol için bir kuyucuk kullanın (ör., transfekte edilmemiş hücreler), viral süspansiyon yerine 2 mL T / C28a2 hücre büyüme ortamı ekleyin.
    5. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 48 saat inkübe edin.
  4. Seçim işlemini gerçekleştirmek için, transfekte edilmemiş hücreleri ortadan kaldırmak ve homojen bir hücre popülasyonu elde etmek için transfekte edilmiş hücreler üzerinde bir antibiyotik seçimi kullanın.
    NOT: pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B retroviral vektörü, viral transfeksiyondan sonra stabil bir hücre kültürünün seçilmesini sağlayan puromisine karşı memeli antibiyotik direnci sağlar. T / C28a2 kondrositlerinin optimal puromisin konsantrasyonu için öldürme eğrileri, yüksek ekspresyon seviyelerine sahip transgeni taşıyan hücre klonlarını seçmek için uygun koşulları oluşturmak için önceden ayarlanmalıdır.
    1. T / C28a2-pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B kararlı hücre hattı büyüme ortamını hazırlayın: 500 mL DMEM,% 10 FCS,% 1 P / S ve 2.5 μL / mL puromisin. Ortamı 4 °C'de saklayın ve her kullanımdan önce 37 °C'ye kadar ısıtın.
    2. Ortamı değiştirin. Her 6 kuyucuklu çoklu plaka için, aspirat kültürü ortamı, 1x'i 2 mL HBSS ile durulayın ve aspire edin. 2 mL ortam ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin. Bu, seçim sürecinin başlangıcıdır.
    3. Ortamı her 2 günde bir değiştirin ve ölü hücreleri ve puromisine dirençli hücre popülasyonlarını gözlemleyin. Sonuçları, puromisine dirençli olmayan ve ölmeyen transfekte edilmemiş kontrol hücreleriyle karşılaştırın.
  5. Klonal seçime başlamak için, monoklonal popülasyonların büyüdüğünden emin olun. Her 6 kuyulu çoklu plaka için:
    1. 96 kuyulu bir çoklu plakaya kuyucuk başına 200 μL ortam ekleyin.
      NOT: 6 kuyulu çoklu plakadan seçilen her bir hücre, 96 kuyulu çoklu plakanın ayrı kuyucuklarında kaplanacaktır.
    2. 6 kuyucuklu çoklu plakadaki her bir monoklonal popülasyonu tanımlamak için bir mikroskop kullanın. Tek hücrelerden oluşan koloniler gözlemlenebilir.
    3. 6 kuyucuklu çoklu plakadan aspire kültürü ortamı, 1x'i 2 mL HBSS ile durulayın ve HBSS'yi aspire edin.
    4. Her monoklonal popülasyona 10 μL tripsin ekleyin, böylece tek hücreleri 96 kuyucuklu çoklu plakanın her bir oyuğuna aktarın. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 48 saat inkübe edin.
  6. 48 saat sonra, ortamı oyuk başına 100 μL taze ortam ile değiştirin. Tek hücrelerin genişlemesi nedeniyle koloniler oluşana kadar bu işlemi tekrarlayın.
  7. Tek bir hücre iyi bir şekilde genişledikten sonra, her bir monoklonal popülasyonu 24 kuyu, 6 kuyu ve 100 mm hücre kültürü plakasından oluşan ayrı kuyucuklarda plakalayın.
  8. Tek hücreli bir sıralama yöntemi kullanarak kararlı bir monoklonal hücre hattı oluşturun.
    1. 100 mm hücre kültürü plakalarından aspirat kültürü ortamı. 1x'i 8 mL HBSS ile durulayın ve aspire edin.
    2. Her plakaya 2 mL tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 2 dakika inkübe edin. 8 mL kültür ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin.
    3. Hücreleri 5 dakika boyunca 252 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Her hücre peletine 4 mL HBSS ekleyin, dikkatlice yeniden süspanse edin ve sitometri tüplerine aktarın.
    4. Her hücre örneğini, hücre sıralama teknolojisine sahip bir akış sitometresine (Malzeme Tablosu) enjekte edin ve yüksek yeşil ve kırmızı floresan ile hücreleri ayırın.
    5. Seçilen hücreleri 15 mL konik tüplere aktarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 252 x g'da santrifüjleyin. 9 mL stabil hücre hattı büyüme ortamı içeren bir T-25 şişesine hücre peleti ekleyin. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
      NOT: Hücre sıralamasından sonra, üç monoklonal popülasyon (Tablo 1) elde edilmelidir.
  9. 24 saat sonra ortamı çıkarın ve 8 mL taze ortam ekleyin. Hücreler birleşene kadar bu işlemi her 2 günde bir tekrarlayın.
    NOT: Otofajik akıyı incelemek için iki kontrol kullanılabilir: yüksek otofajik akı sinyali referansı olarak rapamisin ve düşük otofajik akı sinyali referansı olarak klorokin. Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mM'lik bir rapamisin stok çözeltisi ve H 2O'da 30 mM'lik bir klorokin stok çözeltisi hazırlayın ve-20 ° C'de saklayın. mCherry ve GFP ekspresyonunu test ederek en iyi monoklonal popülasyonu seçmek için iki yöntem kullanılabilir: akış sitometrisi (adım 1.10) veya yüksek içerikli floresan görüntü analizi (adım 1.11).
  10. Akış sitometrisi
    1. Tohum: 2.5 x 10 Her monoklonal popülasyonun oyuğu başına5 hücre, tedaviden en az 24 saat önce, tedaviden en az 24 saat önce, 1 mL stabil hücre hattı büyüme ortamında ve 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
    2. Tedavi gününde, ortamı çıkarın, kuyucuk başına% 2 FCS ile desteklenmiş 1 mL stabil hücre hattı büyüme ortamı ekleyin. % 2 FCS ile stabil hücre hattı büyüme ortamına 10 μM rapamisin ve 30 μM klorokin ekleyin ve% 5 CO2'de 16 saat inkübe edin.
    3. Ortamı çıkarın, oyuk başına 1 mL HBSS ile durulayın ve aspire edin.
    4. Her oyukta 500 μL tripsin ekleyin, 37 ° C'de 1 dakika inkübe edin ve 500 μL kültür ortamı ekleyerek reaksiyonu nötralize edin. Hücreleri kazıyın ve konik tüplere aktarın.
    5. Hücreleri 5 dakika boyunca 252 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Hücre peletlerini 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın. 5 dakika boyunca 252 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    6. 500 μL PBS ekleyin, hücreleri sitometri tüplerine aktarın ve her numuneyi sitometri ekipmanına enjekte edin. Her koşul için 10.000 olay toplayın.
    7. Akış sitometrisi ile monoklonal popülasyonu seçmek için, EGFP'yi uyarmak için 488 nm'lik bir lazer ve mCherry için 633 nm'lik bir lazer kullanın. Ardından, yüksek ve düşük otofajik akıya sahip hücre popülasyonunu seçmek için bir mCherry ve EGFP floresan oranı oluşturun.
  11. Yüksek içerikli floresan görüntü analizi
    1. % 10 FCS,% 1 P / S ve 2.5 μL / mL puromisin ile desteklenmiş büyüme ortamında 384 oyuklu plakada (siyah duvar / şeffaf alt) her bir monoklonal popülasyonun 4 x 103 hücresini tohumlayın. Tedaviden önce 24 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
    2. Ortamı çıkarın ve kuyucuk başına% 2 FCS ile desteklenmiş 50 μL stabil hücre hattı büyüme ortamına 10 μM rapamisin ve 30 μM klorokin ekleyin. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 16 saat inkübe edin.
    3. Ortamı çıkarın, oyuk başına 50 μL HBSS ile durulayın ve aspire edin. Hücreleri %4 paraformaldehit (PFA) ile 37 °C'de 10 dakika sabitleyin. PFA'yı çıkarın ve kuyucuk başına 50 μL HBSS ile durulayın.
    4. Hücre çekirdeğini tanımlamak için Hoechst 33342 (2.5 μg/mL) ile 37 °C'de 10 dakika boyayın. Hoechst 33342 boyasını aspire edin, oyuk başına 50 μL HBSS ile durulayın ve oyuk başına 50 μL PBS ekleyin.
    5. Bölüm 3'te açıklandığı gibi HTS platformu tarafından elde edilen otofajik akının veri toplama ve analizini gerçekleştirin.
      NOT: Monoklonal popülasyonu seçme kriterleri, otofajik akının sırasıyla rapamisin veya klorokin ile artmasına veya azalmasına dayanmaktadır (Tablo 1). Yüksek düzeyde mCherry ve GFP ekspresyonuna sahip klonlar, otofaji akısının doğru yüksek içerikli floresan görüntü analizi, kantitasyonu için daha uygundur.

2. Canlı kondrositlerde görüntü tabanlı otofajik akı testi

NOT: Bir klon seçtikten sonra, otofajik akıyı ölçmek için testi başlatın.

  1. Elde taşınan bir elektronik 384 kanallı pipet kullanarak, seçilen klonun 4 x 103 hücresini (adım 1.11) oyuk başına 384 oyuklu plakaya (siyah duvar / şeffaf alt) %10 FCS, %1 P/S ve 2.5 μL/mL puromisin ile desteklenmiş 50 μL stabil hücre hattı büyüme ortamında tohumlayın. Tedaviden önce 24 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
  2. Deney gününde, bileşik ekleme için bir aralık plakası hazırlayın.
    1. Bir aralık konsantrasyonu elde etmek için sırasıyla akustik sıvı işleme teknolojisi ve elektronik 384 kanallı pipet kullanarak aralık plakasına her bir bileşiğin/kontrolün bir hacmini ve kararlı hücre hattı büyüme ortamını ekleyin.
      NOT: Bu tahlildeki kontroller, %2 FCS, 30 μM klorokin ve 10 μM rapamisin ile takviye edilmiş stabil hücre hattı büyüme ortamını içeriyordu. Aralık konsantrasyonları, istenen nihai konsantrasyona bağlı olacaktır. Örneğin, bu tahlilde, sırasıyla 300 μM ve 100 μM'lik bir aralık konsantrasyonu elde etmek için oyuk başına 50 μL kararlı hücre hattı büyüme ortamına klorokin ve rapamisin ilave edildi.
    2. Bir mikroplaka yıkama robotu kullanarak, hücre plakasından otomatik bir şekilde ortamı aspire edin ve oyuk başına% 2 FCS ile desteklenmiş 45 μL kararlı hücre hattı büyüme ortamı ekleyin.
    3. Ardından, başka bir otomatik sıvı işleyici iş istasyonu kullanarak nihai bir konsantrasyon elde etmek için aralık plakasından test plakasına oyuk başına 5 μL aktarın.
  3. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 16 saat inkübe edin. Bir mikroplaka yıkama robotu kullanarak ortamı aspire edin.
  4. Hücreleri 37 ° C'de 10 dakika boyunca kuyu başına 50 μL% 4 PFA ile sabitleyin. Kuyucuk başına 50 μL HBSS ile yıkayın.
  5. Çekirdekleri Hoechst 33342 (2,5 μg/mL) ile 37 °C'de 10 dakika boyayın. Hoechst 33342'yi aspire edin ve kuyucuk başına 50 μL HBSS ile durulayın.
  6. Kuyucuk başına 50 μL PBS ekleyin. Plaka artık okuma, veri toplama ve müteakip analiz için hazırdır.
    NOT: Bu protokol, yüksek verimli tarama (HTS) için açıklanmıştır. Bununla birlikte, az sayıda bileşik kullanılıyorsa, otomatik aletler olmadan manuel olarak eklenebilirler. Kalibre edilmiş sıvı işleme aletleri ve/veya elektronik pipetler kullanılarak hücrelerin ve süpernatantın minimum manipülasyonu, yüksek içerikli floresan görüntü analizi ile otofaji akışının kantitasyonu için hücre kültürü tek katmanlarının başarılı bir şekilde hazırlanmasını kolaylaştırır.

3. Otofajik akının veri toplanması ve analizi

  1. Veri toplama için, görüntü işleme algoritması ile otomatik görüntü elde etme ve analize izin veren yüksek içerikli bir tarama sistemi (HCS) ve otomatik bir mikroskop kullanın.
  2. Bir edinim protokolü geliştirmek için, otofajik akı olayları sırasında çekirdekleri ve otofagozomların ve otolizozomların oluşumunu tanımlamak için birkaç kanal ve maruz kalma süresi (Tablo 2) seçin.
  3. Her kuyu için, kuyu yüzeyini kaplayan dört alandan ve 0,2 μm'lik bir çalışma mesafesi ile ayrılmış 8 μm'den başlayan dört yığın halinde görüntüler toplayın. Ayrıntılı hücre görüntüleme için 60x objektif kullanarak görüntüleri yakalayın.
  4. HCS mikroskobu tarafından sağlanan görüntü analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin. Otofaji akısı izleme için sağlam bir analiz protokolü algoritması geliştirmek için, otomatik hücre görüntüsü segmentasyonu ve LC3 aktivasyonuna karşılık gelen benekleri özel olarak tespit etmek için en uygun yöntemi seçin. Aşağıda açıklandığı gibi yöntemler, hücre segmentasyon adımları ve niceleme talimatları ekleyerek son analiz dizisini gerçekleştirin:
    1. Çekirdek Bul yapı taşına tıklayın ve nükleer boya kanalı Hoechst 33342'yi seçin. Yöntem'i seçin ve çıktı popülasyonu Çekirdeklerini seçin.
    2. Sitoplazma yapı taşını bul'a tıklayın ve sitoplazmik boya kanalı Fluorescein'i seçin. Yöntem Seç | Bireysel eşik.
    3. Sitoplazma Bul (2) yapı taşına tıklayın ve sitoplazmik boya kanalı RFP'yi seçin. Yöntem Seç | Bireysel eşik.
    4. Popülasyon yapı taşına tıklayın ve etüt popülasyonu Çekirdeklerini seçin. Ortak filtreler (Kenarlık nesnelerini kaldır) yöntemini seçin ve çıktı popülasyonu Nuclei Inside Borders'ı seçin.
    5. Noktaları Bul yapı taşına tıklayın ve belirli bir işaret kanalı olan Fluorescein'ı seçin. Çalışma popülasyonunu seçin Sınırlar içindeki çekirdekler ve çalışma bölgesi Sitoplazma'yı seçin. Yöntem'i seçin ve çıktı popülasyonu Kenarlıkların İçindeki Noktalar'ı seçin.
    6. Noktaları Bul (2) yapı taşına tıklayın ve belirli işaretçi kanalı RFP'yi seçin. Çalışma popülasyonunu seçin Sınırlar içindeki çekirdekler ve çalışma bölgesi Sitoplazmayı (2) seçin. Yöntem'i seçin ve çıktı popülasyonu Noktalar (2) İç Kenarlıklar'ı seçin.
    7. Yoğunluk Özelliklerini Hesapla yapı taşına tıklayın ve belirli bir işaretleyici kanalı olan Fluorescein'i seçin. Çalışma popülasyonu Nuclei Inside Borders'ı seçin ve çalışma bölgesi Spot'u seçin. Yöntem'i seçin ve çıkış özelliklerini seçin: Yoğunluk, Spot Floresein, İç Kenarlıklar.
    8. Yoğunluk Özelliklerini Hesapla yapı taşına tıklayın ve belirli işaretleyici kanal RFP'sini seçin. Çalışma popülasyonu Nuclei Inside Borders'ı seçin ve çalışma bölgesi Spot'u (2) seçin. Yöntem'i seçin ve çıkış özelliklerini seçin: Yoğunluk, Spot (2), RFP, İç Kenarlıklar.
    9. Sonuçları Tanımla yapı taşına tıklayın, Kenarlıklar İçindeki Popülasyon Çekirdekleri'ni seçin, Çekirdek Nesnelerinin Sayısı (Ortalama)'yı seçin, Göreli Yoğunluk Noktaları Floresein - kuyu başına ortalama'yı seçin ve Göreli Yoğunluk Noktaları (2) - RFP - kuyu başına ortalama'yı seçin.
  5. Otofajik akıyı ölçmek için, akış sitometrisi analizi11 için daha önce açıklanan yöntemin aynısını kullanın. Bağıl yoğunluk noktalarının mCherry/EGFP oranını oluşturun.
    NOT: Daha yüksek akıya sahip hücreler daha az yeşildir, bu da hücredeki mCherry/EGFP oranını artırır. Hücrelerdeki otofaji akısı olaylarından gelen ilgili sinyallerin anlamlı bir sayısını tanımlamak ve doğru bir şekilde ölçmek, istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar oluşturmak için çok önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otofajik akı, hücrelerde farmakolojik modülasyon veya hücre stres tepkisi ile izlenebilir. Ölümlüleştirilmiş İnsan Kondrositleri (T / C28a2), otofaji için bir floresan raportör (mCherry-EGFP-LC3B) olarak LC3 kullanarak bir otofaji raportör hücre hattı geliştirmek için kullanıldı. Şekil 1 , insan kondrositlerinde (mCherry-EGFP-LC3-T / C28a2) otofaji raportör hücre hattının geliştirilmesinden başlayarak, farmakolojik modülasyon ile otofajik akının indüksiyonuna veya inhibisyonuna kadar tarama ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kusurlu otofaji, yaşlanmaya bağlı eklem dejenerasyonunun önemli bir özelliğidir, ancak kıkırdakdejenerasyonu 2 için otofajiyi hedef alan ne önleyici ne de hastalık modifiye edici tedaviler henüz mevcut değildir. Alaka düzeyi ve klinik etkileri göz önüne alındığında, otofaji, ilaç keşfi ve geliştirilmesi için bir ilgi hedefi haline gelmiştir, ancak bu anahtar homeostaz mekanizmasındaki değişiklikleri doğrudan izleme yöntemlerinin zor olduğu kanıtlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Instituto de Salud Carlos III- Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, İspanya, Plan Estatal 2013-2016 ve Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), "Una manera de hacer Europa", PI14/01324 ve PI17/02059 tarafından desteklenmiştir. Romatoloji Araştırma Vakfı'na (FOREUM) da destekleri için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 mm hücre kültürü plakasıCorning430167Hücre kültürü plakası
12 kuyulu çok plakalıCorning353043Hücre kültürü plakası
15 mL Santrifüj konik tüpFalcon-Corning352095Santrifüj konik tüp
24 kuyulu çok plakalıCorning351147Hücre kültürü plakası
25 cm2 Hücre Kültürü ŞişesiFalcon-Corning353014Hücre kültürü şişesi
384 oyuklu çok plakalı Hücre TaşıyıcıPerkin Elmer6007550Hücre kültürü plakası
6 oyuklu çok plakalıCorning351146Hücre kültürü plakası
96 kuyucuklu çok plakalıCorning353077Hücre kültürü plakası
Akustik sıvı işleme teknolojisiLabcyte& minus;https://www.labcyte.com
KlorokinSigma-AldrichC6628otofajik akı inhibitörü
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOD2650Disolvent
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Lonza, Basel, İsviçreBE-604FT / C28a2 büyüme ortamı
Eagle's Minimum Temel Ortam (EMEM)ATCC30 ve ndash; 2003HEK 293-T17 büyüme ortamı
FACScalibur sitometresiBecton Dickinson, CA& eksi;https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOF9665HEK 293-T17 serum
Fetal Buzağı Serumu (FCS)Gibco by Life Technologies, CA26010 – 074Serum
FuGenePromegaE2691Otofaji oluşturmak için bir plazmit dağıtım yöntemi olarak lipozomal olmayan bir lipit karışımı rapor edilen hücre hattı
El tipi elektronik 384 kanallı pipetIntegra−https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Sigma-AldrichH6648Tampon
HEK 293-T17ATCCCRL-11268Böbrek hücre hattı. Retroviral paketlemeyi kolaylaştırmak için hücreler kullanıldı
Yüksek İçerikli Tarama SistemiPerkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific62249DNA boyama
Görüntü Analiz YazılımıPerkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
Liquid Handler iş istasyonuPerkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
Mikroplaka yıkama robotuBiotek& eksi;https://go.biotek.com/405tradein
Opti-MEM® (1 kez)Thermo Fisher Scientific11058Transfeksiyon ortamı
Paraformaldehit (PFA)Sigma-Aldrich158127Fixer
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3BAddgene, Cambridge, MA22418Plazmid
pCL-EcoAddgene, Cambridge, MA12371Plazmid
Penisilin-Streptomisin (P / S)Sigma-AldrichP0781Antibiyotik
Fosfat tamponlu salin (PBS)MP Biyomedikal2810305Tampon
PuromisinSigma-Aldrich, St. Louis, MOP8833Antibiyotik
RapamisinCalbiochem, Almanya5053210otofajik akı aktivatörü
Yazılımı CellQuestProBecton Dickinson&https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Şırınga filtreleri 0.45 μ mCorningCLS431220Steril filtre
T / C28a2ve eksi;&eksi;İnsan Kondrositleri Hücre Hattı
TripsinGibco, CA15400054T / C28a2 hücreleri ile kullanılan Tripsin
TripsinSigma-Aldrich, St. Louis, MOSM-2002-CHEK 293-T17 hücreleri VSV ile kullanılan tripsin
. GAddgene, Cambridge, MA14888Plazmid
Life Technologies tarafından

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Lotz, M. K., Carames, B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nature Reviews Rheumatology. 7 (10), 579-587 (2011).
  3. Carames, B., Taniguchi, N., Otsuki, S., Blanco, F. J., Lotz, M. Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage, and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 62 (3), 791-801 (2010).
  4. Carames, B., Olmer, M., Kiosses, W. B., Lotz, M. K. The relationship of autophagy defects to cartilage damage during joint aging in a mouse model. Arthritis & Rheumatology. 67 (6), 1568-1576 (2015).
  5. Kroemer, G. Autophagy: a druggable process that is deregulated in aging and human disease. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 1-4 (2015).
  6. Leidal, A. M., Levine, B., Debnath, J. Autophagy and the cell biology of age-related disease. Nature Cell Biology. 20 (12), 1338-1348 (2018).
  7. Maiuri, M. C., Kroemer, G. Therapeutic modulation of autophagy: which disease comes first. Cell Death & Differentiation. 26 (4), 680-689 (2019).
  8. Vinatier, C., Dominguez, E., Guicheux, J., Carames, B. Role of the inflammation- autophagy-senescence integrative network in osteoarthritis. Frontiers in Physiology. 9, 706(2018).
  9. du Toit, A., Hofmeyr, J. S., Gniadek, T. J., Loos, B. Measuring autophagosome flux. Autophagy. 14 (6), 1060-1071 (2018).
  10. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO Reports. 10 (2), 173-179 (2009).
  11. Gump, J. M., Thorburn, A. Sorting cells for basal and induced autophagic flux by quantitative ratiometric flow cytometry. Autophagy. 10 (7), 1327-1334 (2014).
  12. Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and Measuring Autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865(2017).
  13. Nogueira-Recalde, U., et al. Fibrates as drugs with senolytic and autophagic activity for osteoarthritis therapy. EBioMedicine. 45, 588-605 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Osteoartrit TaramasLC3 Raporlay cY ksek erikli G r nt lemeOtomatik G r nt Analizinsan KondrositlerimCherry EGFP LC3BFenotipik TaramaYa lanma ile li kili Hastal klar
Video yakında

İlgili makaleler