Yöntem makalesi

Elektrofizyolojik Kayıtlar için Akut İnsan Hipokampal Dilimlerinin Hazırlanması

9.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61085

⸱

7 Mayıs 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology with Experimental Neurology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 3Department of Neurosurgery, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Sunulan protokol, potansiyel antiepileptik maddeler için bir preklinik değerlendirme aracı olarak hayati beyin dilimleri kullanmak nihai hedefi ile rezeke insan hipokampal doku taşıma ve hazırlanması açıklar.

Özet

Epilepsi dünya nüfusunun yaklaşık % 1'ini etkiler ve devam eden nöbetler nedeniyle yaşam kalitesinde ciddi bir düşüşe ve ani ölüm riskinin yüksek olmasıyla sonuçlanmaktadır. Mevcut tedavi seçeneklerinin bolluğuna rağmen, hastaların yaklaşık %30'u ilaca dirençlidir. Çeşitli yeni terapötikhayvan modelleri kullanılarak geliştirilmiştir, ancak ilaca dirençli hastaların oranı değişmeden kalır. Olası nedenlerden biri kemirgen modelleri ve insanlar arasında çeviri eksikliği, hayvan modellerinde insan farmakodirenci zayıf bir temsil ilerler gibi. Bir preklinik değerlendirme aracı olarak rezeke insan beyin dokusu bu çevirisel boşluğu köprü avantajı vardır. Burada açıklanan insan hipokampal beyin dilimleri ve epileptiform aktivite sonraki istikrarlı indüksiyon yüksek kaliteli hazırlık için bir yöntemdir. Protokol, 8 mM KCl ve 4-aminopyridin uygulaması sırasında patlama aktivitesiin indüksiyonunu açıklar. Bu aktivite, dimethylethanolamine (DMEA) gibi yerleşik AED lacosamide veya yeni antiepileptik adaylara karşı hassastır. Buna ek olarak, yöntem ekstrasellüler Mg azaltılması ile insan hipokampal beyin dilimleriNIN CA1 nöbet benzeri olayların indüksiyon açıklar+ ve bikülliline uygulama, BIR GABAA reseptör bloker. Deneysel kurulum epileptiform aktivite üzerindeki etkileri için potansiyel antiepileptik maddelerin ekran için kullanılabilir. Ayrıca, belirli bileşikler için öne sürülebilir etki mekanizmaları insan dokusunda bu yaklaşım kullanılarak doğrulanabilir (örneğin, yama-kelepçe kayıtları kullanılarak). Sonuç olarak, hayati insan beyin dokusu ex vivo soruşturma (burada, temporal lob epilepsi muzdarip hastalardan rezeke hipokampus) insan beyninde fizyolojik ve patolojik mekanizmaların mevcut bilgi artıracaktır.

Giriş

Epilepsi en sık görülen nörolojik hastalıklardan biridir, dünya nüfusunun% 1 etkileyen, ve artan morbidite ve mortalite ile ilişkili1,2. Ne yazık ki, epilepsi muzdarip hastaların üçte biri ilaca dirençli, 20'den fazla onaylı antiepileptik ilaçlar da dahil olmak üzere mevcut tedavi seçenekleri bir bolluk rağmen (AED)3. Preklinik hayvan araştırmalarından sonuçları klinik çalışmalara çevirememe, umut verici tedavi stratejilerinin birçok hastada etkili olmamasının bir nedenidir4. Son zamanlarda, nöropeptid Y (NPY) ve galanin hayvan modellerinde antiepileptik etkileri olduğu gösterilmiştir; rağmen, rezeke insan beyin dokusunda test edildiğinde, sadece NPY etkili oldu5.

Temel nörolojik mekanizmalar ve hastalık tedavisi yaklaşımları ile ilgili mevcut bilginin çoğu hayvan modelleri ve hücre kültürü deneylerinden kaynaklanmaktadır. Bilgilendirici olmasına rağmen, bu modeller sadece karmaşık insan hastalıkları ve yetişkin insan beyin ağı nın tek yönlerini temsil. Alternatif olarak, insan beyin dokusu çeviri boşluğu köprü potansiyeline sahiptir ama nadiren fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilir. Örneğin, post mortem beyin dokusu protein ekspresyonu, beyin morfolojisi, ya da anatomik bağlantıları araştırmadeğerli bir araç olmuştur, nöronal aktivite genellikle tehlikeye rağmen bu doku6,7,8,9,10,11.

Buna karşılık, yaşayan rezeke insan beyin dokusu preklinik ilaç değerlendirmesi ile ilgili araştırılmıştır, temel nöronal fonksiyonlar ve gen ekspresyonu desenleri12,13,14,15,16,17. Kemirgen dilimleri ile karşılaştırıldığında insan beyin dilimlerinin büyük bir avantajı rezeksiyon ve hazırlık sonrası nöronal dokunun uzun canlılık olduğunu. Kemirgen beyin dilimleri ile karşılaştırıldığında, genellikle hazırlık tan sonra 8 saate kadar kaydedilebilir, insan beyin dilimleri kadar istikrarlı nöronal aktivite göstermek 72 saat, Bu nadir ve değerli örneklerin ayrıntılı soruşturma sağlayan12,18.

Çeşitli çalışmalar rezeke kortikal ve hipokampal insan dokusunun çeşitli alanlarda epileptiform aktivite özelliklerini araştırdı ve epileptiform aktivite indüksiyon için farklı yöntemler kullanılır. Kemirgen dilimlerinde, epileptiform aktivitesi çeşitli yöntemlerle indüklenebilir: DG hiler hücrelerinin elektriksel uyarılması, ekstrasellüler K+ (8-12 mM KCl), gabaA reseptörlerinin biküllin (BIC) ile bloke edilmesi, potasyum kanallarının 4-aminopyridine (4-AP) tarafından bloke edilmesi ve ekstrasellüler çözeltide Mg2+'nın çıkarılması veya azaltılması19. Ancak, insan dokusunda epileptiform aktivitein indüksiyonu yukarıda belirtilen yöntemlerden en az ikisinin kombinasyonunu gerektirir20,21,22.

Burada sunulan insan hipokampal beyin dilimleri hazırlanması için bir yöntemdir, hangi kadar uygulanabilir 20 saat ve yüksek K uygulanması üzerine epileptiform aktivitesiin indüksiyon göstermek+ (8 mM) ve 4-AP veya düşük Mg2 + ve BIC.

Protokol

Hastalar ameliyattan önce yazılı izin vermeli ve deneyden önce gerekli etik anlaşmalar yapılmalıdır. Temsili sonuçlarla ilgili olarak, insan katılımcıların katıldığı tüm çalışmalar Charité-Universitätsmedizin, Berlin (EA2/111/14) tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.

1. 10x çözeltilerinin hazırlanması

NOT: İnsan beyin dokusuna erişim planlamasındaki güçlükler nedeniyle burada açıklandığı gibi 10x çözeltilerinin hazırlanması tavsiye edilir. Alternatif olarak, son 1x çözeltileri çift distile suya (ddH2O) son konsantrasyonda tek tek maddeler eklenerek taze olarak hazırlanabilir.

  1. Bireysel 10x çözeltiler için Tablo 1'e göre ddH2O'ya maddeler ekleyin ve eriyene kadar karıştırın.
  2. Hazırlıktan sonra 1 aya kadar 10x çözümleri kullanın (dondurulmuş 10x kolin aCSF için 1 yıla kadar).
  3. 10x kolin aCSF için, 10x 1.1 kolin aCSF 50 mL aliquots hazırlamak(Tablo 1) ve donma -20 °C veya -80 °C daha fazla kullanıma kadar.
    NOT: Bakteri ve kalsiyum karbonat yağışı ile kontaminasyonu önlemek için glikoz ve CaCl2 ila 10x 1.1 kolin aCSF eklemeyin.
  4. 10x çözüm 2 tüm 1x son çözümler için kullanılabilirken, 10x çözümleri 1.1-1.4 özelleştirilip buna göre adlandırılmıştır (Tablo 1).

2. 1x nihai çözümlerin hazırlanması

NOT: Son 1x çözümleri kullanımdan bir gün önce taze veya en erken olarak hazırlanmalıdır. Tüm son çözeltiler oksijen le çözeltileri zenginleştirmek için cam gaz dağıtıcısı kullanılarak %5 CO2 ve %95 O2 ile karbogenated edilmeli ve pH'ı 7,4 'e (max = 7,4 ± 0,2) ayarlanmalıdır.

  1. Taşıma ve hazırlık için Kolin aCSF
    1. Son 500 mL çözeltiiçin, 37 °C su banyosunda kolin aCSF için 10x çözeltisi 1.1 aliquot'un 50 mL aliquot'u çözültün.
    2. 10x çözeltisinin 1.1 ve 50 mL 10x çözeltisinin 2 ila 300 mL ddH2O'nun çözülmüş 50 mL aliquot'unu ekleyin.
    3. Son glikoz ve CaCl 2 konsantrasyonlarınıekleyin, sonra çözünene kadar karıştırın(Tablo 1, çözelti 1.1).
    4. 500 mL'lik son hacme ddH2O ekleyin ve ozmolariteyi ölçün (300 mOsm ± 10 mOsm).
    5. İsteğe bağlı olarak, çözümü sterilize etmek için bir filtre kullanın (steril koşullar altında uzun süreli dilim canlılığı tartışmasına bakın).
    6. Ameliyat odasından laboratuvara taşınması için ayrı bir şişeyi yaklaşık 100 mL 1x kolin aCSF ile doldurun.
    7. İsteğe bağlı: operasyon odasından laboratuvara taşıma süresine bağlı olarak, daha uzun taşıma sürelerinde aCSF'nin sabit pH'ını sağlamak için gaz geçirmez şişe kapakları kullanmayı düşünün.
    8. Nihai çözeltiyi daha fazla kullanıma kadar 4-8°C'de saklayın.
    9. Operasyon günü, buz üzerinde chill 1x kolin aCSF ve karbogen gazıbağlı bir cam gaz dağıtıcı kullanarak en az 10-15 dakika karbogat için karbogen gazı (%5 CO2, 95% O2).
      NOT: Taşıma çözeltisinin yeniden karbogenasyonunu gerektirecek daha uzun bekleme süreleri durumunda, bir gaz şişesini operasyon odasının erişimine açık tutmayı düşünün. Ancak, uzun ve kısa taşıma sürelerinden önce (15 dk vs. 60 dk) hipokampal dokuyu yeniden karbogenasyon yapmadan taşıdık ve epileptiform aktivitein indüksiyonundaki farklılıkları gözlemldik.
  2. depolama ve kayıt için aCSF
    1. Son 2 L çözeltisi için 200 mL 10x çözelti1.2 (aCSF) ve 200 mL 10x çözelti 2 ve glukoz(Tablo 1)ila ~1500 mL ddH2O ekleyin.
      NOT: Son çözeltilerin hacimleri uygulamalı deneylere ve depolama ve kayıt için kullanılan odanın türüne bağlıdır.
    2. 2 L'lik son hacme ddH2O ekleyin ve ozolariteyi ölçün (300 mOsm ±10 mOsm).
    3. Çözeltiyi kullanmadan önce en az 10-15 dakika 35 °C'ye ısıtın ve karbogenat.
  3. Patlama aktivitesiin indüksiyonu için HighK++4-AP aCSF
    1. Son 1 L çözümü için 100 mL 10x çözelti1.3 (highK++4-AP aCSF) ve 100 mL 10x çözeltisi 2 ila ~700 mL ddH2O ekleyin.
    2. Tablo 1'egöre glikoz ve 4-AP (son konsantrasyon = 100 μM) ekleyin.
    3. 1 L'nin son hacmine ddH2O ekleyin ve ozolariteyi ölçün (300 mOsm ±10 mOsm).
    4. Çözeltiyi kullanmadan önce en az 10-15 dakika 35 °C'ye ısıtın ve karbogenat.
  4. Nöbet benzeri olayların indüksiyonu için LowMg2++BIC aCSF (SLE)
    1. Son 1 L çözümü için 100 mL 10x çözelti1.4 (lowMg2++BIC aCSF) ve 100 mL 10x çözeltisi 2 ila ~700 mL ddH2O ekleyin.
    2. Tablo 1'egöre glikoz ve BIC (son konsantrasyon = 10 μM) ekleyin.
    3. 1 L'nin son hacmine ddH2O ekleyin ve ozolariteyi ölçün (300 mOsm ± 10 mOsm).
    4. Çözeltiyi kullanmadan önce en az 10-15 dakika 35 °C'ye ısıtın ve karbogenat.

3. Arayüz odasının hazırlanması

  1. Bir arabirim odasında, dilimin altında yeterli miktarda çözüm sağlamak için dilimler üç filtre kağıdı katmanı üzerinde direnir. Bunu yapmak için, her dilim tutma bölmesi için iki ~4 cm x ~2 cm filtre kağıdı kesin (açıklanan arayüz odası iki bölmeden oluşur) ve üst üste yerleştirin.
  2. Çözeltinin gerilimini kırmak için bölmelerin içine 4 cm x 2 cm filtre kağıtlarının etrafına ince pamuk telleri yerleştirin. Eşit akış tan emin olun (burada, ince kesilmiş tellere kesilmiş siyah naylon taytlar ~10 cm uzunluğunda kullanılır; yerleştirme için Şekil 1'ebakın).
  3. Dilim tutma bölmelerinin içine daha büyük filtre kağıtlarının üzerine küçük filtre kağıtları yerleştirin. Küçük filtre doku parçaları kabaca bir beyin dilimi büyüklüğünde olmalıdır (~1.5 cm x ~1.0 cm) ve tek tek dilimlerin daha fazla işlenmesini sağlayacaktır. Her bölmeye üç ila dört küçük filtre kağıdı parçası yerleştirin.
  4. Peristaltik pompa ile 1,8 mL/dk'lık bir aCSF akış hızı sağlayın.
  5. Karbogenat ve ~35 °C (dilimin son sıcaklığı ~ 32 °C olmalıdır) arayüz odası önceden ısıtın.

4. Hazırlık alanının kurulumu

NOT: Kontaminasyonu önlemek ve dilim sağkalımlarını sağlamak için steril koşullarda hazırlık yapılabilir. Ancak, tüm vibratomlar steril bir başlık altına sığmaz ve hazırlık sırasında kontaminasyonu azaltmak için diğer önlemler gereklidir. Bu bölümde bu önlemlerin bazıları açıklanmaktadır.

  1. Hazırlama alanını %70 EtOH ile silin ve alüminyum folyo veya steril kapakları alanın üzerine yerleştirin.
  2. Süper tutkal, iki keskin cımbız, bir spatula, bıçaklı bir neşter ve beyin dokusunun kabaca kesilmesi için bir bıçak hazırlayın. Takımlar kontaminasyonu azaltmak için işlemden önce sterilize edilebilir.
  3. Vibratomun tampon tepsisini ve numune plakasını %70 EtOH ile silin. Tampon tepsi tamamen kurudıktan sonra, alüminyum folyo ile kaplayın ve buz banyosunda tepsi yerleştirin. Buz banyosunu ezilmiş buzla doldurun ve hazırlanınana kadar -20 °C'de tutun.
  4. Vibratomu ve jileti %70 EtOH ile silin ve dilimleme işlemi sırasında dikey titreşimleri ve doku hasarını en aza indirmek için vibratomu kalibre edin.

5. Doku dilimleme ve depolama

  1. Doğrudan rezeksiyon sonra, soğuk hemen doku yerleştirin, karbogenated kolin aCSF ve laboratuvara hızlı bir şekilde taşıma.
    DİkKAT: İnsan beyin dokusu potansiyel patojenler içerebileceğinden, hazırlık sırasında her zaman eldiven ve yüz maskesi takın. Buna ek olarak, steril bir başlık altında çalışmadığı zaman bir yüz maskesi takmak büyük ölçüde çözümler ve beyin dokusunun kontaminasyonazaltacaktır.
  2. Kolin aCSF doku çıkarın ve doku herhangi bir yanmış kısımları kesip.
  3. Kesme açısı ve doku katmanları göz önünde bulundurularak, numune plakası üzerine doku parçası yapıştırmak için eşit bir yüzey kesin. İdeal olarak, bir hipokampal dilim DG içerir, CA1-4, ve (mümkünse) subikülum.
  4. Beyin dokusunu 400 μm kalınlığında dilimler halinde dilimleyin ve kesme sırasında genliği ve hızı ayarlayın. Olası kalan pia mater nedeniyle, insan beyin dokusu daha fazla direnç gösterir ve daha yavaş kesim gerektirebilir.
    NOT: Dilim kalınlığı, mevcut ağı (daha kalın dilimlerde daha fazla nöron) veya dilimin uygulanabilirliğini (çözeltinin dilime nüfuzunu) büyük ölçüde etkiler. Mevcut mikro ağı artırmak için 500 m'lik dilim kullandık ve epileptiform aktivitenin indüksiyonundaki farklılıkları gözlemleyemedik. 300 μm dilimler genellikle yama-kelepçe deneyleri için kullanılır, ancak bu dilimlerde epileptiform aktivitein indüksiyonu henüz burada test edilmemiştir. Standart dilim kalınlığı olarak 400 μm kullanıyoruz, ancak 300-500 μm dilim yeterli olabilir.
  5. Toplamadan önce, kayıt odasına sığacak şekilde beyin dilimlerinin boyutlarını azaltmak için bir neşter kullanın. Membran odasının kullanımı için (bkz. bölüm 6), dilimler maksimum 1,5 cm x 1 cm olmalıdır. Azaltırken, kayıt için sağlam olması gereken belirli katmanları ve bağlantıları göz önünde bulundurun (örneğin, CA1 ve DG'de kayıt için, altyazıyı ve çevresindeki beyaz dokuyu kesin).
  6. Bir spatula ve küçük forseps kullanarak, küçük filtre kağıtları üzerinde arayüz odasında dikkatlice dilimleri yerleştirin ve kayıt kadar aCSF ~ 1 saat dinlenme sağlar.
  7. Dilimler en fazla 20 saat (steril koşullarda daha uzun) kaydedilebilir.

6. Epileptiform aktivitenin kaydedilmesi

  1. Membran odasında (batık tip kayıt odasında), plastik bir halka24yapıştırılmış şeffaf bir yarı geçirmatılabilir membran, üzerinde beyin dilimi yerleştirin. Bunun için, bir hücre kültürü eklemek membran plastik halka takmak için süper tutkal kullanın.
  2. Plastik halka dışında herhangi bir membran kaldırmak için bir neşter kullanın. Membranı hazneye yerleştirmeden önce zarın halkaya eşit ve tam olarak bağlı olduğundan emin olun.
    NOT: Membran 4-8 °C'de ddh2O'da saklanabilir ve 1 aya kadar yeniden kullanılabilir. Membranı her zaman ıslak tutun.
  3. Membran haznesinin hem giriş hem de çıkışı çözüm kaynağı için tüplere bağlanır. Giriş ve çıkış zıt yönlere hareket böylece peristaltic pompa tüpleri yerleştirin.
  4. Tüm tüpler ve oda çözelti ile doldurulur kadar karbogenated, önceden ısıtılmış aCSF giriş ve çıkış tüpü yerleştirin. Peristaltik pompanın hızını ayarlayarak 10-13 mL/dk eşit akış hızına ulaşın.
    NOT: Burada kullanılan membran haznesi yüksek akış hızı, 14 mL/dk24'ekadar çözelti akışı sağlayan batık tip kayıt odasıdır. Farklı bir batık tip kayıt odası kullanılması durumunda, akış hızlarının ayarlanması gerekir. Ancak, epileptiform aktivitein indüksiyonu için membran odasının kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
  5. 32 °C'lik sabit bir sıcaklık sağlamak için membran haznesine yakın bir şekilde girişe bağlı bir ısıtma elemanı kullanın.
  6. Dikey bir çekmece kullanarak 1-2 MΩ cam pipetler hazırlayın. Pipetleri 154 mM NaCl çözeltisi ile doldurun ve bir elektrot tutucuya yerleştirin.
  7. Cımbız ve spatula kullanarak, küçük filtre kağıdı ile dilim alarak ve karbogenated aCSF ile dolu bir Petri kabına hem yerleştirerek arayüz odasından bir hipokampal dilim çıkarın. Küçük filtre kağıdını hipokampal dilimden çıkarın ve (gerekirse) dilimi filtre kağıdından ayırmak için pipet kullanarak biraz kuvvet uygulayın. Dilimi çevirmemeye dikkat edin.
  8. Dilimi kayıt odasına yerleştirin ve dilim örgükullanarak yerinde tutun.
    NOT: Bernoulli prensibine bağlı olarak, kullanılan batık tip membran haznesinde, dilimler genellikle ek bir dilim örgü kullanılmadan stabildir.
  9. Bölgeye ve ilgi katmanına (burada, CA1) elektrotlar yerleştirin ve kaydetmeye başlayın.
  10. 10-20 kHz örnekleme hızı ve 2 kHz'de düşük geçişli filtreleme ile mevcut kelepçe modunda alan potansiyel aktivitesini kaydedin.
  11. ACSF'de 5 dakikaya kadar bazal aktivite kaydedin.
  12. Çözeltilerin karıştırılmasını önlemek için akış tüplerini aCSF'den highK++4AP veya lowMg2++BIC aCSF'ye ve çıkış tüpünü bir atık kabına geçirin. 2 dakika sonra, çözeltiyi korumak için çıkış tüpünü girişle aynı çözeltiye yerleştirin.
  13. highK++4-AP tarafından indüklenen patlama aktivitesi yıkamadan 2-5 dakika sonra görülmelidir. Ancak, LOWMg2++BIC ile SLE indüksiyonu 30 dakika kadar sürebilir. Gerekirse, en iyi sonuçları elde etmek için elektrotların konumlarını dikkatlice değiştirin.
  14. Bir kez son pozisyonda, en az 20 dakika için temel etkinliği kaydedin. SLE'leri kaydederseniz, SLE'lerin düşük frekansı nedeniyle daha uzun temel kayıtları düşünün.
  15. Temel aktivitenin stabil olması durumunda (olay sıklığı platosu), istenilen ilaçta yıkayın. Ilaçların yüksek akış hızı yıkama nedeniyle hızlı çözüm değişimi için izin, sadece 2-5 dakika sürer unutmayın.
  16. En az 20 dk uyuşturucu uygulaması sırasında kayıt aktivitesi, yıkama sonrasında. Aktivite en az 60-90 dakika boyunca istikrarlı olmalı, böylece daha uzun kayıtlar yapılmalıdır.

7. Analiz

  1. Frekans ve genlik analizi mevcut herhangi bir yazılım ile yapılabilir. Şimdiye kadar, SLEs veya patlama etkinliği güvenilir bir otomatik analiz kurmak mümkün olmamıştır, ve bunun yerine tanımlanan etkinliğin görsel onayı ile yarı otomatik bir analiz kullanılır.
  2. Patlama aktivitesi biphasik, pozitif ve negatif sapma ve ≥100 ms. Seri aktivitesi olarak görsel olarak tanımlanan tüm olaylar (örneğin, eşik analizi ile yarı otomatik olarak) olay sıklığının (olay aralığı, IEI), genlik ve analiz edilen zaman dilimindeki toplam olay sayısının daha fazla analizi için el ile belirtilmelidir.
    NOT: Patlama aktivitesinin yüksek frekansı nedeniyle, her uygulama aşamasının son 5 dakikası genellikle20olarak analiz edilir.
  3. SLE'ler Heuzeroth ve ark. Tanımlanan SLE'ler tanımlandığı şekilde analiz edilebilir, tonik (yüksek frekanslı spiking) ve tonik (yüksek frekanslı spiking) faz süresi süre, genlik, başak frekansı ve süresi için daha fazla analiz edilebilir. <10 s süresi olan SLE'ler analiz dışı edilmelidir.
    NOT: Olası antiepileptik maddelerin preklinik değerlendirilmesi için, rezeke hipokampal dokuda yerleşik indüksiyon nedeniyle patlama aktivitesi (highK++4AP tarafından indüklenen) üzerindeki etkileri araştırılmaktadır. LowMg2++BIC kullanılarak SLE'lerin indüksiyonu ile ilgili ön sonuçlar bildirilmiştir (Şekil 2), ancak bu verilerin analizi burada yer almamıştır.

Sonuçlar

Epileptiform aktivite 15 hastaya kadar menşeli rezeke edilen insan hipokampal dokusunda başarıyla kaydedilmiştir. Kararlı taşıma ve hazırlık prosedürleri kurulması insan beyin dokusunda epileptiform aktivitenin başarılı indüksiyon için önemlidir. Son zamanlarda yayınlanan sonuçlar göstermiştir 1) farklı hastaların rezeke dokuda epileptiform aktivite istikrarlı indüksiyon yanı sıra 2) yeni antiepileptik mekanizmaların değerlendirilmesi için bir preklinik araç olarak rezeke insan beyin dokusunun kullanımı14,20.

Birkaç dakika içinde patlama aktivitesi şeklinde highK++4-AP indüklenen epileptiform aktivitesinin uygulanması(Şekil2A,B,C,D ).,B,C,D İnsan hipokampal dokusunda düşük nöronal dağılım veya temporal lob epilepsisine (TLE) bağlı yüksek nöronal hücre kaybı nedeniyle, kayıt başlangıcında elektrotların yerleştirilmesi ayarlanabilir. 10 dakika sonra CA1 alanında dilim patlama aktivitesinin görünmediği durumlarda (elektrot yerleşiminden bağımsız), dilimin canlılığı tehlikeye atılabilir ve dilimin değiştirilmesi gerekir.

>10 s süreli SLE'ler lowMg2++BIC(Şekil 2E,F)uygulaması ile indüklenebilir. Şekil 2E, kayıt boyunca birkaç dakika sonra SLE'lerin kararlı indüksiyonunu ve kararlı frekansı gösterir. Burada, SLE aktivitesi incelenen hastadan dört dilimin ikisinde başarıyla indüklendi. Bir dilim 15 dakika SLE aktivitesinden sonra sadece patlama aktivitesi gösterirken, diğer dilim 40 dk sonra bile SLE'leri göstermedi.

Madde etkilerinin klinik öncesi değerlendirilmesi için highK++4-AP tarafından indüklenen patlama aktivitesi üzerinde potansiyel bir antiepileptik etki araştırıldı. Bilinen ve potansiyel antiepileptik maddeler (lacosamide, DMEA, dinamin14)test edildi ve örnekler burada konvansiyonel AED lacosamide (bir sodyum kanal engelleyici) yanı sıra DMEA (yeni bir potansiyel antiepileptik madde)20için gösterilmiştir. Patlama olaylarının olay sayısı ve olaylar arası aralığı (IEI), genlikler çoğunlukla etkilenmemiş olsa da, hem lacosamide hem de DMEA(Şekil 3C)uygulaması sırasında azalmıştır (Şekil 3D). Dilimlerin bir alt kümesinde, patlama olaylarının indüksiyonu ilk birkaç dakika içinde elde edilse de, uygulanan AED'lerin yıkanması sırasında etkinlik sıklığı geri kazanılmadı (burada gösterilmeyen veriler, bkz. Kraus ve ark.20). Burada, uygulanan ilaçların etkileri neden olarak kabul edildi; ancak, patlama aktivitesindeki düşüşler uzun kayıtlar sırasında aktivitedeki kademeli çürümeden etkilenmiş olabilir. Bu nedenle, sonuçlar dikkatle yorumlanmalıdır.

figure-results-1
Şekil 1: Arayüz odası. İnsan hipokampal beyin dilimleri depolamak için, iki beyin dilimi tutma bölmeleri ile bir arayüz odası kullanılır(A); özellikle, Bir Haas tipi arayüz odası23. Burada, hipokampal beyin dilimleri üzerinde dinlenme (d) filtre kağıt üç kat, (e) daha küçük parçalar bireysel beyin dilimleri işleme sağlamak için, ve (f) dilim altında çözelti yeterli bir tabaka sağlamak için daha büyük filtre kağıt parçaları. (c) Beyin dilimlerini çevreleyen bir pamuk ipi, filtre kağıtlarının üzerine, bölmenin(a)üstündeki girişlerden bile çözelti akışı sağlar. (b) Kapak kapağı, bölmesi altındaki oksijeni dilime yönlendirir. (B) Bir dilim tutma bölmesi üst görünümü. (C) Filtre kağıtlarının katmanlarını göstermek için yan görünüm. (g) Odanın alt kısmı. (h) Peristaltik bir pompaya bağlı çözelti girişi için tüp (mavi oklar çözelti akışının yönünü işaretler). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: HighK++4-AP ve lowMg2++BIC tarafından indüklenen insan hipokampal dilimlerinde epileptiform aktivite. CA1 örnek kayıtları ve highK+ (8 mM)+4-AP (100 μM) (A,B,C,D) ve lowMg2++BIC (10 μM) (E,F)uygulama alıntıları. (A) highK++4-AP banyo uygulaması birkaç dakika içinde epileptiform aktiviteyi tetikler ve aktivite en az 60 dakika stabildir. (B)'de (A)'nın ayrıntıları görülebilir. İnsan hipokampal dilimlerinin CA1 bölgesinde iki farklı aktivite türü indüklenir: interictal benzeri sivri (C, [B]'ninayrıntıları) ve patlama aktivitesi (D, [B] ayrıntıları). Patlama aktivitesinin antiepileptik ilaçlara duyarlı olduğu gösterilmiştir ve bu nedenle potansiyel antiepileptik maddelerin etkisi açısından analiz edilmiştir(Şekil 3). (E,F) LowMg2++BIC uygulaması birkaç dakika içinde CA1'de >10 s(F)süresinde SLE'leri tetikler. Ancak, SLEs indüksiyon diğer dilimlerde 30 dakika kadar sürebilir. Ölçek çubukları = 0,2 mV, 2 dk (A,E), 5 s (B), 500 ms (C,D), 5 dk (E) ve 2 s (F). Bu rakam Kraus ve ark.20'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Lacosamide veya DMEA uygulaması sırasında insan dilimlerinin epileptik patlama aktivitesinde azalma. Patlama aktivitesi (A) lacosamide ve (B) DMEA, potansiyel yeni bir antiepileptik molekül uygulama sırasında azaldı. (A) ve (B) ca1 alanının örnek kayıtlarını (C) ve (D) analiz için kullanılan bölgelerin alıntıları ile gösterir. Lacosamide (100 μM) ve DMEA (10 mM) uygulaması sırasında, orta alıntılarda görüldüğü gibi patlama aktivitesi azalmış ve yıkama sırasında tekrar artmaktadır. (C,D) Patlama aktivitesinin sayısı ve genliği her uygulama aşamasının son 5 dakikası için analiz edildi (taban çizgisi, lacosamide/DMEA, yıkama) ve tüm hastalar için özet sonuçlar olarak gösterildi (olay sayısı, C; genlik, D) ortalama ± SD olarak. Her nokta bir hastayı gösteriyor. Yıldız, Lacosamide uygulamasının analizi için Dunnett'in çoklu grup karşılaştırması (*p < 0.05, n = 4) veya Tukey'in DMEA uygulamasının analizi için karşılaştırması ile tekrarlanan ölçüm ANOVA ve post-hoc (**p < 0.01, n = 10) ile Friedman testi ve post-hoc tarafından değerlendirildiği önemli farklılıkları işareteder. Ölçek çubukları = 0,2 mV, 2 dk (tam kayıt, A), 5 s (alıntılar, A), 3 dk (tam kayıt, B) ve 1 s (alıntılar, B). Bu rakam Kraus ve ark.20'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Çözüm 1.1 kolin aCSF
Madde10x konsantrasyonu (mM)1x konsantrasyon (mM)Not
kolin Cl1100110
(+)-Na L-askorbat11611.6
MgCl2x6H2O707
Na pirüvat313.1
Kartal252.5
NaH2PO412.51.25
NaHCO326026
CaCl2-0.5nihai çözüme ekleme
Glikoz-10nihai çözüme ekleme
Çözüm 1.2 aCSF
Madde10x konsantrasyonu (mM)1x konsantrasyon (mM)Not
Nacl1290129
NaH2PO412.51.25
CaCl2161.6
Kartal303
MgSO4181.8
Glikoz-10nihai çözüme ekleme
Çözüm 1.3 highK++4-AP aCSF
Madde10x konsantrasyonu (mM)1x konsantrasyon (mM)Not
Nacl1240124
NaH2PO412.51.25
CaCl2161.6
Kartal808
MgSO4181.8
Glikoz-10nihai çözüme ekleme
4-AP-0.1nihai çözüme ekleme
Çözüm 1.4 lowMg2++BIC aCSF
Madde10x konsantrasyonu (mM)1x konsantrasyon (mM)Not
Nacl1300130
NaH2PO412.51.25
CaCl2161.6
Kartal303
Glikoz-10nihai çözüme ekleme
Bıc-0.01nihai çözüme ekleme
Çözüm 2
Madde10x konsantrasyonu (mM)1x konsantrasyon (mM)Not
NaHCO321021

Tablo 1: Taşıma, hazırlama ve kayıt için 10x ve son 1x çözümlerinin hazırlanması.

Tartışma

Canlı rezeke insan beyin dokusu AED'lerin klinik öncesi değerlendirilmesinde son derece değerli bir araçtır, çünkü sağlam bir insan beyni mikro ağını doğru bir şekilde temsil eder. Sunulan protokol, yüksek kaliteli hipokampal dilimlerin yanı sıra AED değerlendirmesi için kritik olan epileptiform aktivite için kararlı bir indüksiyon yöntemi sağlayan doku taşıma ve hazırlama yöntemini tanımlar.

İnsan beyin dilimlerinde kimyasal veya elektriksel indüksiyon yöntemlerinin yanı sıra epileptiform aktivitenin araştırılması daha önce diğer gruplar tarafından gösterilmiştir17,20,21,22. Bu protokol, yüksek K++4-AP uygulaması ile farklı hastalardan dilimler halinde stabil patlama aktivitesiin indüksiyonunun yanı sıra düşük Mg2++BIC uygulaması ile CA1 alanında SLE'lerin indüksiyonuna neden olundu. Patlama aktivitesiin indüksiyonunun SLE indüksiyonuna göre daha tutarlı olduğu (15 hastada test edilen dilimlerin %80'i) (bir hastada test edilen dilimlerin %50'si) saptandı. Ancak, şimdiye kadar, SLEs indüksiyon sadece bir hastada test edilmiştir. Bununla birlikte, SLE'lerin düşük Mg2++BIC ile indüksiyonu tavsiye edilir, çünkü SLE'ler henüz yüksek K++4-AP kullanılarak indüklenmeilmelidir.

Çeşitli çalışmalar taşıma ve insan beyin dokusunun hazırlanması için yöntemler tanıttı ve genellikle nöronal sağkalım için kritik üç faktör vurgulamak: ulaşım süresi, kullanılan ulaşım çözümleri, ve depolama koşulları.

Optimal dilim canlılığı için, bazı gruplar rezeke beyin dokusunun taşınması mümkün olduğunca kısa olduğunu öneririz. Ancak, ameliyathaneler ve laboratuvarlar nadiren yakın dır, bu da uzun ulaşım nedeniyle dilim kalitesinin tehlikeye atılabileceği anlamına gelir. Bazı gruplar taşıma12sırasında çözüme sabit O2 uygulayarak bu engeli aşmış. Biz kısa (max = 15 dk) ve uzun (1 saate kadar) süreler için taşıma sırasında sabit ek O2 kaynağı olmadan zaman beyin dokusu taşınan var, diğer gruplara benzer18,25. Bu olgularda epileptiform kayıtlarda doku kalitesinde farklılıklar gözlenmemiştir. Enstitümüzdeki diğer gruplarla iletişimde, yamalı kıskaç deneyleri için de dilim kalitesi değişmedi. Buna karşılık, doku kalitesindeki varyans muhtemelen operasyonlar sırasında hasar kaynaklanıyor, uzun süreli rezeksiyon, ve dilimleme prosedürü.

Taşıma ve kesme çözeltisi ile ilgili olarak, yayınlanan tüm yöntemler, kemirgen yama-kelepçe deneyleri için standart prosedüre benzer şekilde, ozmotik basınç nedeniyle hücre şişmesini azaltmak için nacl çözeltilerinden atlar. Ancak, birkaç yerine şimdiye kadar tanıtıldı (yani, sakaroz bazlı aCSF13,22, NMDG tabanlı aCSF12,26, ve kolin bazlı aCSF27). Ting ve meslektaşları 201426 yılında dilim hazırlama için NMDG tabanlı aCSF tanıttı ve daha sonra yavaş yavaş dilimleri28NaCl yeniden tanıtan bir kurtarma protokolü eklendi. Ancak, Ting ve ark tarafından açıklandığı gibi, NMDG tabanlı aCSF hazırlanan beyin dokusunun nöronlar yüksek membran direnci göstermek, böylece yama-kelepçe deneyleri sırasında tüm hücre mühür etkileyen26. Bu nedenle, nmdg tabanlı aCSF kolin tabanlı aCSF20kullanımına geçiş yaptık , hangi alan potansiyeli ve yama-kelepçe kayıtları için yüksek kaliteli dilimler verir.

Dilimlerin depolanması ile ilgili olarak, genellikle arayüz koşulları uzun dilim hayatta kalma için kritik optimum oksijenleme sağlamak kabul edilir18. Ancak, diğer gruplar 12 batıkkoşullaraltında 72 saate kadar dilim sağkalım göstermektedir. Önceki hipotezin aksine, insan beyin dilimleri kemirgen dilimleri ile karşılaştırıldığında düşük oksijenasyon veya oksidatif strese karşı daha dayanıklı gibi görünüyor. Öncelikle, arayüz odaları daha önce insan hipokampal dilimleri depolamak için kullanılmıştır, batık koşullar yama-kelepçe deneylerde insan beyin dilimlerinin bakımı için tavsiye edilir rağmen.

Diğer gruplar tarafından tartışıldığı gibi, uzun dilim sağkalım için ek bir kritik adım (arayüz <48 h18, için batık <72 h12) bakteriyel kontaminasyonun önlenmesidir. Kemirgen beyin dilimleri genellikle elektrofizyolojik kayıtlarda 8 saate kadar kullanılır ve bakteriyel kontaminasyonun bu dönemde dilimin canlılığını etkilediği düşünülmez. Bir rezeksiyondan hazırlanan yüksek sayıda dilim ve insan beyin dokusunun nadir bulunması, insan beyin dilimlerinin canlılığını uzatma ihtiyacını vurgular. Bu yöntem başarıyla kolayca steril koşullara adapte edilebilir yaşayan insan hipokampal beyin dilimleri, hazırlanması açıklar. Ancak, burada yapılan kayıtlar için, dilim hayatta kalma 20 saat uzanan bir öncelik değildi.

Arayüz odalarında kayıt da SLEs22gibi epileptiform aktivite indüksiyon için gerekli olduğu gösterilmiştir. Düşük oksijenlenme nedeniyle batık koşullar, SLE'lerin kaydı nda nadiren kullanılır; ancak, yama-kelepçe deneyleri için gerekli optik yüksek çözünürlük için gereklidir. Optimize edilmiş bir batık tip kayıt odasının kullanımı, yüksek oksijenasyon ve hızlı ilaç uygulaması nedeniyle insan beyin dilimlerinde epileptiform aktivitenin (hücre dışı alan veya tek nöron) kaydedilmesini sağlar29. Burada, alan potansiyeli kayıtları için yöntemler ve sonuçlar açıklanmıştır, ancak bu değiştirilmiş kayıt odası (veriler gösterilmez) kullanılarak fare ve insan beyin dilimlerinde yama-kıskaç kayıtlarının başarıyla gerçekleştirildiği vurgulanmalıdır.

Rezeke insan beyin dokusu kemirgen modellerine göre daha yüksek bir çeviri değerine sahiptir. Bu iPSCs tarafından çoğaltılamaz bir yetişkin, hastalıklı nöronal ağ temsil eder. Ancak, herhangi bir in vitro sisteminde olduğu gibi, insan beyin dilimleri bozulmamış bir insan beyni temsil etmez. Ayrıca, rezeke beyin dokusunun kayıtlı nöronal ağlar operasyon veya hazırlık sırasında hasar nedeniyle önemli moleküler ve fonksiyonel değişiklikler eolabilir. Dilimleme prosedürleri GABAerjik fonksiyonu etkilemek için gösterilmiştir ve epileptiform aktivite indüksiyon etkileyebilir30. Bir hipotez formüle edilirken bu sınırlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. Potansiyel antiepileptik ilaçlar test ederken, farklı beyin alanlarının kullanımı düşünülmelidir, ilaç hedefleri tüm insan beyin bölgeleri veya tüm hastalarda ifade olmayabilir gibi. Özellikle, TLE hastalarının hipokampi genellikle şiddetli nöronal hücre kaybı ile birlikte hipokampal skleroz belirtileri göstermektedir. İlaçlara karşı potansiyel refrakter gibi patolojik değişiklikler ve hastalık öyküsü hakkında hasta bilgileri elde etmek ve veri yorumlanması sırasında bunu göz önünde bulundurmak önerilir.

Sonuç olarak, bu yöntem başarıyla epileptiform aktivite iki farklı türde kayıt için yaşayan insan hipokampal beyin dilimleri ve indüksiyon teknikleri hazırlanması açıklar. Yaşayan insan beyin dokusunun kullanılabilirliği nadir olduğundan, insan beyin dilimleri kullanarak deneylerden maksimum verim sağlamak için optimize edilmiş taşıma ve kayıt koşulları kullanılmalıdır. Rezeke insan beyin dokusunun kemirgen modelleri ve hücre kültürü deneylerine ek olarak klinik öncesi doğrulama aracı olarak kullanılabilmesi önerilmektedir.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.

Teşekkürler

Mandy Marbler-Pötter'e (Charite-Unversitätsmedizin, Berlin) mükemmel teknik yardım için teşekkür ederiz. P.F. Alman Araştırma Vakfı (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) tarafından Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi-EXC-2049-390688087 altında finanse edilmiştir. Bu çalışma, Berlin Sağlık Enstitüsü'ndeki QUEST Dönüşüm Biyomedikal Araştırma Merkezi tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(+)-Na L-askorbatSigma AldrichA4034
4-APSigma Aldrich275875-5G
BıçaklareliteSERVE GmbHHW3vibratom CaCl
2Merck102382
Choline ClSigma AldrichC1879
Filtre kağıdıTiffeniçin kullanılır
Gaz geçirmez şişe kapaklarıCarl Roth GmbH+Co.KGE694.1
Cam filamentlerBilim ÜrünleriElektrotları kaydetmek içinGB150F-8P
Cam gaz dağıtıcıDWK Life Sciences GmbH258573309
GlukozSigma AldrichG7528
Arayüz Odasıkurum içi testere Haas ve diğerleri, 1979
KClAppliChem131494.1210
Membran (Hücre kültürü ekleri)MerckPICM030050
Membran odasıkurum içiyapı-bakınızHill and Greenfield, 2011
MgCl2?6H2OCarl RothHNO3.2
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na piruvatSigma AldrichP8574
NaClCarl Roth3957.1
NaH2< / sub>PO4< / sub>Merck106346
NaHCO3< / sub>Carl RothHNO1.2
Peristaltik pompaGilsonMinipuls 3
Dilim tutucuWarner instrumentsSHD-41/15
Dikey çektirmeNarishigePC-10
VibratomLeicaVT1200S
EK1546027T

Kaynaklar

  1. Hirtz, D., et al. How common are the "common" neurologic disorders. Neurology. 68 (5), 326-337 (2007).
  2. Ngugi, A. K., Bottomley, C., Kleinschmidt, I., Sander, J. W., Newton, C. R. Estimation of the burden of active and life-time epilepsy: a meta-analytic approach. Epilepsia. 51 (5), 883-890 (2010).
  3. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
  4. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  5. Ledri, M., et al. Differential Effect of Neuropeptides on Excitatory Synaptic Transmission in Human Epileptic Hippocampus. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 35 (26), 9622-9631 (2015).
  6. Qi, X. R., et al. Alterations in the steroid biosynthetic pathways in the human prefrontal cortex in mood disorders: A post-mortem study. Brain Pathology. 28 (4), 536-547 (2018).
  7. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  8. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (1), 54-60 (2002).
  9. Le Maître, T. W., Dhanabalan, G., Bogdanovic, N., Alkass, K., Druid, H. Effects of Alcohol Abuse on Proliferating Cells, Stem/Progenitor Cells, and Immature Neurons in the Adult Human Hippocampus. Neuropsychopharmacology. 43 (4), 690-699 (2018).
  10. Dennis, C. V., Suh, L. S., Rodriguez, M. L., Kril, J. J., Sutherland, G. T. Human adult neurogenesis across the ages: An immunohistochemical study. Neuropathology and Applied Neurobiology. 42 (7), 621-638 (2016).
  11. Verwer, R. W. H., et al. Mature astrocytes in the adult human neocortex express the early neuronal marker doublecortin. Brain. 130 (12), 3321-3335 (2007).
  12. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 8407(2018).
  13. Le Duigou, C., et al. Imaging pathological activities of human brain tissue in organotypic culture. Journal of Neuroscience Methods. 298, 33-44 (2018).
  14. Agostinho, A. S., et al. Dynorphin-based "release on demand" gene therapy for drug-resistant temporal lobe epilepsy. EMBO molecular medicine. 11 (10), 9963(2019).
  15. Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  16. Beaulieu-Laroche, L., et al. Enhanced Dendritic Compartmentalization in Human Cortical Neurons. Cell. 175 (3), 643-651 (2018).
  17. Sandow, N., et al. Drug resistance in cortical and hippocampal slices from resected tissue of epilepsy patients: no significant impact of p-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins. Frontiers in Neurology. 6, 30(2015).
  18. Wickham, J., et al. Prolonged life of human acute hippocampal slices from temporal lobe epilepsy surgery. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  19. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. , (2015).
  20. Kraus, L., et al. Dimethylethanolamine Decreases Epileptiform Activity in Acute Human Hippocampal Slices in vitro. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 209(2019).
  21. Antonio, L. L., et al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. , (2016).
  22. Gabriel, S., et al. Stimulus and Potassium-Induced Epileptiform Activity in the Human Dentate Gyrus from Patients with and without Hippocampal Sclerosis. Journal of Neuroscience. 24 (46), 10416-10430 (2004).
  23. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
  24. Hill, M. R. H., Greenfield, S. A. The membrane chamber: a new type of in vitro recording chamber. Journal of neuroscience methods. 195 (1), 15-23 (2011).
  25. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, 24818(2016).
  26. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in molecular biology. 1183, Clifton, N.J. 221-242 (2014).
  27. Testa-Silva, G., et al. Human synapses show a wide temporal window for spike-timing-dependent plasticity. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 2, 12(2010).
  28. Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  29. Morris, G., Jiruska, P., Jefferys, J. G. R., Powell, A. D. A New Approach of Modified Submerged Patch Clamp Recording Reveals Interneuronal Dynamics during Epileptiform Oscillations. Frontiers in Neuroscience. 10, 519(2016).
  30. Valeeva, G., Valiullina, F., Khazipov, R. Excitatory actions of GABA in the intact neonatal rodent hippocampus in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2013).

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings
Posted by JoVE Editors on 7/13/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings. Step 2.1.3 in the Protocol was corrected.

Step 2.1.3 in the Protocol was updated from:

Add final concentrations of glucose and MgCl, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

to:

Add final concentrations of glucose and CaCl2, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

Etiketler

Epileptiform AktiviteAkut Beyin Kesiti Haz rlamaVibratom ile KesmeKolin ACSF Sol syonuAray z Odas KurulumuD k Magnezyum BikukulinY ksek Potasyum 4 AminopiridinYama Kenetleme Kay tlar
Elektrofizyolojik Kayıtlar için Akut İnsan Hipokampal Dilimlerinin Hazırlanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.