Yöntem makalesi

IDISCO+ ve Hafif Sac Floresan Mikroskobu ile Vertebral Lenfatik Vaskülatür ve Drenajın Üç Boyutlu Görüntülemesi

DOI:

10.3791/61099

⸱

22 Mayıs 2020

 ,  , 
1Université Pierre et Marie Curie Paris, Sorbonne Université, Institut du Cerveau et de la Moelle Epinière, 2Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Department of Neurology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir protokol hafif levha floresan mikroskobu ile doku temizleme birleştirerek sunulmaktadır (LSFM) lenfatik damarlar ve lenf düğümleri üç boyutlu ve hücresel çözünürlük görüntüleri elde etmek için (LNs) beyin omurilik sıvısı toplama (BOS) ve spinal epidural sıvı.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkezi sinir sistemi ile ilişkili lenfatik sistem (CNS) beyin etrafında döner lenfatik vaskülatür içerir, omurilik, ve ilişkili LNs. CNS ile ilişkili lenfatik sistem CNS drenaj LNs doğru BOS makromoleküllerve meningeal bağışıklık hücrelerinin drenaj ı dahil, bu nedenle CNS dokularda atık temizleme ve bağışıklık gözetimdüzenleyen. Sunulan çevre dokular içinde devrelerinin bütünlüğünü korurken CNS ilişkili lenfatiklerin üç boyutlu (3D) ve hücresel çözünürlük görüntüleri elde etmek için yeni bir yaklaşımdır. iDISCO+ protokolü, daha sonra hafif sac floresan mikroskopi (LSFM) ile görüntülenen vertebral kolon kireçlenmiş ve temizlenmiş tüm montaj preparatları içinde immünetiketleme lenfatik damarlar için kullanılır. Bu teknik, omuriliğin etrafındaki meningeal ve epidural boşlukları ekstravertebral lenfatik damarlara bağlayan lenfatik ağın 3Boyutlu yapısını ortaya koymaktadır. Sağlanan moleküler izleyicilerin drenaj devrelerinin 3D görüntüleri daha önce cisterna magna veya torakolombbar spinal parankim yoluyla BOS içine enjekte edilir. iDISCO+/LSFM yaklaşımı nörovasküler biyoloji, nöroimmünoloji, beyin ve vertebra kanseri, ya da vertebrakemik ve eklem biyolojisi CNS ilişkili lenfatik sistemin yapısını ve işlevini keşfetmek için benzeri görülmemiş fırsatlar getiriyor.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CNS BOS ve menenjler, epidural doku ve kemiklerin katmanları örtünme ile çevrilidir. Bos, yumuşak beyin ve omuriliğine fiziksel koruma sağlar. Çoğunlukla koroid pleksus ve meningeal membranlar (yani, pia mater, araknoid ve dura mater) tarafından salgılanır. BOS-meningeal kompleksi de CNS dokuları ve vücudun geri kalanı arasında fonksiyonel bir arayüz kurar, bu nedenle CNS homeostaz katkıda. İlk olarak, BOS CNS para-arteriyel alanlarda cns paranchyma nüfuz ve interstisyel sıvı ile dinamik etkileşim (ISF)1 glenfatik (glia-lenfatik) sistemi ile, hangi paravasküler boşluklar ve CNS damarları etrafında astrosit son ayak membranlar oluşur2,3,4. Metabolik atık ve aşırı sıvı sonra sonuçta sistemik dolaşıma doğru beyin parankim doğrudan intramural perivasküler drenaj tarafından temizlenir3, bos doğru paravenöz alanlarda ve beyin drenaj lenfatik damarlar yoluyla, glenfatik modele göre2,4. BOS çıkışı esas olarak lenfatik sistem üzerinden, kribriform plaka ve ilişkili ekstrakraniyal lenfatik damarlar aracılığıyla5,6,7, yanı sıra meningeal lenfatik damarlar tarafından, hangi beyin-drenaj LNs 8 yakınsama8,9,10,11,12 (Şekil 1). Önemli bir, ikincil rağmen, BOS çıkışında rol kranial araknoid villi tarafından alınır, hangi meningeal venöz sinüslerin lacuna nüfuz13.

CFS drenaj devreleri, cns veya BOS içine renkli / floresan izleyicilerin enjeksiyonu dayalı deneysel yaklaşımlar ile kapsamlı bir şekilde araştırılmış, CNS içinde ve vücut organları ve dokuları boyunca enjeksiyon dan sonra farklı zaman noktalarında izleyicilerin desen görüntüleme takip13. Uzun bir süre için, BOS çıkışı sadece ve doğrudan kan dolaşımı tarafından sorumlu olarak kabul edildi, dural venöz sinüsler içine yansıtılan araknoid villi yoluyla13. Ancak, BOS çıkışı ağırlıklı olarak lenfatik vaskülatür tarafından gerçekleştirilir, son zamanlarda yakın kızılötesi tarafından gösterildiği gibi (NIR) farelerde BOS enjekte tracer taşıma dinamik görüntüleme9,10. BOS-drenaj lenfdamarları sonra sağ subklavian ven yoluyla kan dolaşımına lenf dönmek. Tamamlayıcı yakınlaşmalar hem ekstrakraniyal6,,7,13 ve intrakranial9,10,,11,12 BOS enjekte izleyicilerin lenfatik çıkışları tespit ve BOS iki lenfatik yollar tarafından emilir öneririz, bir dış ve kafatası ve vertebral sütun için diğer iç. BOS drenaj ana parçası hızla rostrally bulunan lenfatik damarlar aracılığıyla oluşur, burun mukozasında kafatası dışında, etmoid kemik cribriform plaka kanalları aracılığıyla3,6,13 ve, caudally, lumbosakral vertebral kemiklerin dışında henüz tam olarak karakterize değildir dorsolateral yolları ile7,14. Buna ek olarak, kafatası menenjler, dura mater doğrudan lenfatik kılcal damarlar kafatası kemikleri çapraz ve CNS drenaj LNs bağlanmak dural lenfatik kollektörleri doğru BOS ve meningeal bağışıklık hücrelerini absorbe12,14. Beyin meningeal lenfatikler yaşlanma üzerine değişmiş ve aynı zamanda nörolojik beyin hastalıklarının sonucunu etkisi çünkü Bu meningeal lenfatik damarlar, CNS patofizyolojisi önemli rol oynamaktadır, nörodejenerasyon dahil olmak üzere, nöroinflamasyon, ve beyin kanseri15,16,17. Bu nedenle, CNS ilişkili lenfatik vaskülatür (yani, BOS drenaj dural ve periferik lenfatik damarlar) insanlarda CNS hastalıkları ile mücadele için umut verici bir yeni hedef olabilir.

İmmünohistoloji ve yüksek çözünürlüklü manyetik rezonans görüntüleme ile yapılan yakınsak çalışmalar, meningeal lenfatik vaskülatürde de primatlarda, ortak marmoset maymunlar ve insanlar7dahil olmak üzere 7,11,13olduğunu göstermiştir . Ayrıca, meningeal lenfatik damarlar kafatası ile sınırlı değildir, ancak spinal gangliyon ve rami yüzeyine vertebral sütun içinde genişletmek13,18. Üç boyutlu (3D) vertebral sütun lenfatiklerin genel anatomisi koruyan görüntüleme etiketli vertebral ve spinal örnekleri, üstteki kemikler de dahil olmak üzere, kaslar, ligamentler, yanı sıra komşu visseral dokular, son zamanlarda yapıldı14. IDISCO+ protokol19,20 immunolabel dekalilen ve lenfatik spesifik antikorlar ile tüm vertebral kolon preparatları temizlenmiş için kullanılan ya membran reseptörü LYVE121 veya transkripsiyon faktörü PROX122. Görüntü edinimi ve analizi daha sonra hafif sac floresan mikroskobu (LSFM) ve Imaris yazılımı ile gerçekleştirilmiştir. LSFM aydınlatma eksenel hapsi ile büyük örneklerin hızlı ve minimal invaziv 3D görüntüleme sağlar, hangi azaltılmış fotobleaching ve fototoksisite23sonuçlanır.

iDISCO+/LSFM yaklaşımı dural ve epidural lenfatik damarların farklı tabakalarının karakterizasyonuna ve bu vaskülatürün ekstravertebral lenfatik devrelere ve vertebral kolona komşu LN'lere bağlanmasını sağlar. Protokol, vertebral kanal drenajını göstermek için daha önce floresan izleyiciler le enjekte edilen dokulara uygulandı. Bu yazı, vertebral lenfatik vaskülatür görüntü iDISCO+/ LSFM metodolojisi hakkında ayrıntılı bilgi sağlar ve BOS ve epidural sıvı drenaj soruşturma ile alaka göstermektedir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan tüm in vivo prosedürleri, deneysel hayvan kullanımı yönergeleri için Avrupa Topluluğu'na (L358-86/609EEC) uygun olarak, hayvan testi ve araştırmalarına ilişkin tüm ilgili etik düzenlemelere uygunolarak uygulanmaktadır. Çalışma, INSERM Etik Komitesi (n°2016110111126651) ve ICM Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (Institut du Cerveau et de la Moelle épinière) tarafından etik onay aldı.

1. Hazırlık

  1. Ameliyat için aşağıdaki diseksiyon araçlarını hazırlayın: neşter (1), mikroforseps (2), forseps (1), diseksiyon makası ve Michel dikiş klipsleri. 26 G iğne (0,45 mm x 13 mm), 1 mL şırınga ve 10 μL mikroşiniş hazırlayın.
  2. 67.5 °C'de tek adımlı bir protokolle mikrokapilleri cam mikropipet çekmeceile çekin. Enjeksiyon başına iki mikrokapiller hazırlayın.
  3. Görüntüleme lenfatik drenaj için reaktifler hazırlayın (Tablo 1): Ovalbumin Alexa Fluor 555 konjuge (OVA-A555, 1x fosfat tamponlu salin (PBS]) ve anti-LYVE1 antikor (1 mg/mL 1x PBS).
  4. IDISCO+için antikor(Tablo 1)hazırlayın. Primer antikorlar için anti-LYVE1 tavşan poliklonal antikor (1:1.600) ve anti-PROX1 keçi poliklonal IgG antikor (1:2.000) kullanın. İkincil antikorlar için, Alexa Fluor eşek anti-tavşan-568, eşek anti-tavşan-647 ve eşek anti-keçi-647 (1:2,000) kullanın.

2. Intra-cisterna magna (ICM) ve torakolombbar (ThLb) enjeksiyonları için cerrahi prosedürler

  1. Hayvanın ameliyata hazırlanması
    1. Yetişkin erkek ve dişi C57BL6/J fareler, 8-12 haftalık kullanın.
    2. Fareye intraperitoneal (IP) enjekte edin ve ameliyattan 15 dakika önce 0,015 mg/mL buprenorfin çözeltisi %0,9 sodyum klorür le seyreltin.
    3. Fareyi %2-3 izofluran gazı ile indüksiyon kutusunda anestezi edin.
  2. İzleyici enjeksiyonu için anestezili hayvanın hazırlanması
    1. Anestezili fareyi ve ısıtma yastığını stereotaksik aparata yerleştirin. Farenin başını tutmak için kulak çubuklarını kullanın ve vücudu kafaya ~135° açıyla yatırın veya omuriliği thlb vertebral seviyesinde (Th12-L1) bir omurilik adaptörüyle hareketsiz hale getirin. Anestezi verimliliğini kontrol etmek için forcep ile kuyruk veya pençe çimdik.
    2. Fare hidrasyonu için IP 200 μL %0,9 sodyum klorür enjekte edin.
    3. Bir neşter bıçak kullanarak, bir deri kesi yapmak, ICM enjeksiyonu için servikal bölgeye doğru oksipital bölgede, ya da ThLb vertebral düzeyinde (Th10-L3) ThLb spinal parankim içine enjeksiyon için.
  3. Tracer enjeksiyonu
    1. Dura mater, menenjlerin en dış tabakası yüzeyini görselleştirmek için boyun ve sütun kapsayan paraservikal ve paraspinal kasları atın.
    2. Dura mater'in merkezi alanını dikkatlice delin ve araknoidin 26 G iğnesi ile alt kısmından emin olun.
    3. Mikro kapiller implantasyon
      1. Cam kılcal uçtan 2 mm(bkz. adım 1.2) kesip, 10 μL şırıngaya bağlı bir kanüle bağlı mikrokapilleri kullanarak OVA-A555 veya LYVE1 antikorunun 2−8°L'ini aspire edin.
      2. ICM enjeksiyonları için 30° açıda dura matermedial bölgesinde mikrokapiller veya ThLb spinal enjeksiyonlar için 10 ° açıyla tanıtın ve dura mater altında 1,5 mm itin.
        NOT: Bağ delinmiş, ancak laminektomi yapılmaz.
      3. Cam kılcal damar çevresindeki kesiği kapatmak için 10 μL cerrahi tutkal ekleyin ve kurumasını bekleyin.
    4. Floresan izleyiciyi yavaşça 1 μL/dk'dan enjekte edin. Enjeksiyon hacmi teslim edildikten sonra, 1 dakika boyunca yerinde kılcal korumak. Mikrokapillergeri ve enjeksiyon deliği kapatmak için cerrahi tutkal ekleyin.
  4. Enjeksiyon sonrası, dikiş klipsleri ile deri kesilerini kapatın. Fareyi stereotaksik cihazdan çıkarın ve iyileşene kadar 37 °C'de ameliyat sonrası ısınma odasına yerleştirin.

3. Perfüzyon ve doku diseksiyonu

  1. BOS izleyici enjeksiyonundan sonra 15 dakika veya 45 dakika sonra IP'ye öldürücü dozda (100 μL) sodyum pentobarbital enjekte edin. Hiçbir refleks olduğunu doğrulamak için kuyruk veya pençe çimdik.
  2. Diseksiyon makası ile, deri kesmek ve torasik kafes doğru alt karın bölgesinden periton tabakasını açın. Kalbe ulaşmak için göğüs kafesini makasla açın.
  3. 26 G iğneyi kalbin sol ventriküline yerleştirin ve 2 mL/dk'da 1x PBS'de 20 mL buz gibi %4 paraformaldehit (PFA) ile perfuse yapmaya başlayın. Hızla sağ atriyum kesmek ve perfüzyon sıvı akışı serbest makas kullanın.
  4. Tamamen forceps ile cilt çıkarın ve makas ile dört bacak kesti. Tüm iç organları çıkarın ama SAĞLAM LNs korumak için dikkatli olun.
    NOT: Mandibular LN'ler yüzeyseldir, bu nedenle deriyi keserken çıkarmamaya dikkat edin. Derin servikal LN'ler (dcLNs) trakeanın her iki tarafında, iç juguler venlerin lateral yüzeyi ile temas halinde ve stereomastoid kaslara yakın yer alır.
  5. Lomber segmentlere servikal içinde omurilik ile vertebral kolon kaldırmak için kaburga kesin.
  6. İncelenmiş dokuları buz gibi %4 PFA'da 1x PBS'de bir gecede 50 mL tüpe (~18 saat) 4 °C'de batırın. Sabit dokuları 5 dk boyunca 1x PBS'nin 50 mL'sinde 3x yıkayın.

4. Vertebra segmentinin floresan makroskopisi

  1. Örneği floresan stereozoom mikroskobualtında bir kamera(Malzeme Tablosu)ile yerleştirin. Örneğin genel görünümünü alın veya belirli bir bölgeyi yakınlaştırın.

5. Tüm montaj immünboyama için örnek hazırlık

  1. Bir mikrotome bıçak kullanarak, transversyal oksipital ve servikal düzeyde baş ve vertebral sütun kesti.
    NOT: Bu diseksiyon, başın ve servikal vertebral bölgenin vertebral sütunun geri kalanından izole edilmesine olanak sağlar.
  2. Bir mikrotome bıçak ile, servikal kesti, torakolombbar, ve vertebral sütun un sakral bölgeleri transversally 2−4 vertebra segmentleri halinde, yaklaşık 0.5 cm boyutu her.
  3. Vertebral sütunun servikal ve torasik bölgelerinin tüm uzunluğu boyunca, vertebral eksenden ayrılmış sırayla her segmenti izole edin. Her numuneyi 2 mL 1x PBS'lik bir tüpte saklayın.

6. vertebrasegmentinin iDISCO+ bütün montaj immünoboyama

NOT: iDISCO+ protokolünün ayrıntılı açıklamasına http://www.idisco.info'dan erişilebilir.

  1. Gün 1: Doku dehidratasyon
    1. Dehydrate vertebral doku örnekleri (yani, bir vertebra segmenti) ardışık daldırma tarafından 20%, 40%, 60%, 80%, ve 1x PBS 1 h ajitasyon ile 1 h için metanol.
    2. Numuneleri gece boyunca oda sıcaklığında (RT) ajitasyon la %33 metanol/%66 diklorotan (DCM) çözeltisi içinde kuluçkaya yatırın.
  2. 2. Gün: Doku beyazlatma
    1. Örnekleri 2kat %100 metanol ile 1 saat boyunca RT'de yıkayın. Numuneleri 4 °C'de %5 H2O2 metanol (%30 H2O2 ve metanol 1:5 v/v) bir gecede inkübed.
  3. 3. Gün: Kireçlenme ve permeabilizasyon adımı
    1. Örnekleri kademeli olarak %80, %60, %40, %20 metanol, sonra 1x PBS (her çözeltide 1 saat) ajitasyon ile RT'de yeniden suratın.
    2. Kemik yapısını korumak için 30 dakika boyunca Mors çözeltisindeki numuneleri (%10 trisodyum sitrat ve %45 formik asit 1:1 v/v) inküterek omurları dekalsitedin.
    3. Numuneleri 1x PBS ile 2 x durulayın ve PTx2 çözeltisinde 1 saat için 2 x inkübasyon (1x PBS'de %0,2 Triton X-100, ikinci kuluçka için yenileyin) AJitasyon ile RT'de. Daha sonra permeabilizasyon çözeltisi (PTx2 ile% 20 dimetil sülfoksit [DMSO] ve% 2.3 w / v glisin) 37 °C 24 saat için pretreated örnekleri kuluçka.
  4. 4. Gün: Engelleme adımı
    1. 24 saat boyunca 37 °C'de bloklama çözeltisi (PTx2 % 6 eşek serumu ve %10 DMSO ile PTx2) inkübül örnekleri.
  5. Gün 5−16: Tüm montaj immünetiketleme
    1. PTwH'de seyreltilmiş primer antikordaki inkübat örnekleri (1x PBS %0.2 Ara-20 ve 1x PBS'de %0.1 heparin içeren) %5 DMSO/3% eşek serumu ile 37 °C'de 6 gün süreyle. Numuneleri rt'de PTwH'de 4−5x ajitasyonla bir gecede yıkayın.
    2. PTwH'de sekonder antikor seyreltmelerinde 37 °C'de %3 eşek serumu ile 4 gün boyunca inkübat eritme örnekleri. Temizlemeden önce numuneleri rt'de PTwH 4−5x'te ajitasyon altında bir gecede yıkayın.
  6. Gün 17 ve 18: iDISCO+ doku temizleme
    1. 1x PBS'de ardışık daldırma ile dehidrat örnekleri kademeli olarak %20, %40, %60, %80 ve %100 metanolde 2kat (her çözeltide 1 saat). Her numuneyi bir gecede %33 metanol/%66 DCM'lik bir çözeltide kuluçkaya yatırın.
    2. Metanol kaldırmak için 15 dakika boyunca% 100 DCM 2x yıkayın. Dibenzyl eter incubate (DBE) temizlenene kadar sallayarak olmadan (4 saat) ve daha sonra görüntüleme den önce RT DBE de saklayın.

7. LSFM görüntüleme

  1. Görüntü 4x/0.3 hedefi ile donatılmış LSFM ile bir transversal düzlemde örnekleri temizlenir.
    1. Tek taraflı üç sayfa aydınlatma yapılandırması, sabit x konumu (dinamik odaklama yok) kullanın. 561 nm, 100 mW'a ayarlanmış LED lazerler kullanın; ve 639 nm, 70 mW. Işık sayfası sayısal diyaframaçıklığını %30'a ayarlayın.
    2. Farklı emisyon filtreleri kullanın: Alexa Fluor-568 veya -555 için 595/40 ve Alexa Fluor-647 için -680/30.
  2. Mikroskop odasını DBE ile doldurun.
  3. 2,5 μm z adımve kamera ile adım başına 30 ms pozlama süresi ile yığınları aquire(Tablo Malzemeler). (x8), 0,8 μm/pikselin etkin bir büyütmesi için x2 optik zum özelliğini kullanın ve mozaik satın almalarını tam karede %10 çakışarak gerçekleştirin.
  4. Satın alma yazılımı yla .tif formatında görüntüler edinin ve dosya dönüştürme yazılımıyla 3B biçime dönüştürün.
  5. Dikiş yazılımı(Malzeme Tablosu)ile mozaik edinimi reconstruct . Görüntüleri açın ve kılavuz olarak görüntüler arasındaki %10 çakışmayı kullanarak tüm mozaik resmi yeniden oluşturmak için el ile hareket edin.
  6. Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3ve Şekil 4'tegösterildiği gibi, verilerin ortogonal projeksiyonlarını oluşturmak ve ekranda bulunan lenfatik damarlara ve diğer anatomik yapılara renk kodu özelliği eklemek için 3B yazılımı(Malzeme Tablosu)kullanın. Üreticinin talimatlarına göre LSFM'den elde edilen ham verilere 1,47 gama düzeltmesi ayarlayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vertebral lenfatik vaskülatür 3D görüntüleme
Şekil 1 iDISCO+/LSFM prosedürünün adımlarını ve iDISCO+-tedavi THLb omurlarının vertebrakanalı içindeki lenfatik devrelerin LSFM görüntüsünü sunar. LSFM ile iDISCO+ kombinasyonu vertebraan anatomisi korunmuş ve lenfatik vasküler ağ bir görünüm yakaladı (yani, dorsally çıkan ekstravertebral damarlar ile bağlı intravertebral damarlar ve lateral vertebral vücuttan) çevreleyen kemikler içinde, ligamentler, kaslar, ve sinir gangliyonu.

DCLN drenajının floresan makroskopi görüntülemesi
CNS ile ilişkili lenfatik sistemde makromolekül drenajını görüntülemek için, makromoleküler izleyiciler BOS veya spinal parankim içine enjeksiyon ile in vivo uygulandı. Makromoleküler bir izleyici, cisterna magna'daki BOS'a kolayca teslim edilebilir. Sarnıç magna beyincik ve medulla oblongata dorsal yüzey arasında yer almaktadır, foramen magnum üzerinde. Makromoleküler izleyici de vertebral kolon boyunca farklı düzeylerde stereotaktik cerrahi ile spinal parankim içine enjekte edilebilir.

Kullanılan makromoleküler izleyiciler ya doğrudan florofor ile etiketlendi ya da spesifik antikorlara sahip immünohistokimya ile postmortem tespit edildi. Şekil 2A OVA-A555izleme için deneysel planı göstermektedir , kırmızı floresan ve küçük molekül ağırlığı tracer (yaklaşık 45 kDa), ya BOS enjekte edildi (Şekil 2B) veya omurilik ThLb bölgeye (Şekil 2C).

Makromoleküler izleyici enjeksiyonundan 45 dakika sonra fareler kurban edildi, %4 PFA ile perfüzyon yapıldı ve beynin ve vertebral kolon bölgesinin parçalanmış parçalarını ayırmak için işlendi. Makromolekül drenajı daha sonra BOS ve epidural sıvıları toplayan LN'lerin floresan makroskopi görüntülemesi ile kolayca değerlendirildi. Şekil 2'degösterildiği gibi, ova-A555 enjeksiyonu ya BOS (Şekil 2B)ya da omuriliğin ThLb(Şekil 2C)bölgesine enjekte edildikten sonra 45 dk.'da dcLN'lere OVA-A555 birikmesi ile sonuçlandı. Bu gözlem lenfatik sistem tarafından floresan izleyici alımı ve drenaj gösterir; vertebral lenfdrenaj görüntü iDISCO+/ LSFM prosedürü takip etmeden önce bir ön koşuldur.

Vertebral lenfatik sistemde makromolekül drenajının 3Boyutlu görüntülemesi
DCLN'lerde OVA-A555 etiketlemesinin saptanması sonucunda, iDISCO+/LSFM prosedürü OVA-A555enjekte edilmiş farelerden izole edilmiş kireçlenmiş ve önceden temizlenmiş vertebral örneklerine uygulanabilir. Bu yaklaşım, tracer enjeksiyonu sonrası belirli bir zaman noktasında BOS ve spinal epidural sıvılenfatik drenaj bir 3D harita oluşturulmasına izin verdi. Bu 3D haritalama enjeksiyon noktasından vertebral sütunun her düzeyinde, ardışık CNS segmentleri görüntüleme ile yapılabilir.

Şekil 3A THLb spinal parankim içine OVA-A555 enjeksiyonu için deneysel tasarım gösterir ve ova-A555 dağılımı nın ortaya çıkan 3D desen servikal ve torasik vertebral segment, lenfatik vaskülatür ile birlikte. OVA-A555 enjeksiyonundan 45 dakika sonra, Şekil 2'degösterilen mikroskop gözlemleri ile uyum içinde, omurilik dokularında ve dcLN'lerde (Şekil 3B'dekibeyaz oklar) OVA-A555 birikimi saptanmıştır. Ancak anti-LYVE1 antikorları ile etiketlenmiş servikal ve torasik lenfatik vaskülatürde sapnamadı. Vertebral lenfatik damarlarda BOS enjekte edilen izleyicinin yokluğu ya lenfatik damarlar içinde tracer kısa bir kalıcılık süresi ya da lenfatik damarlar tarafından tracer alımıeksikliği nedeniyle olabilir(Şekil 3C).

İlk hipotezi test etmek için tavşan anti-LYVE1 antikorcns ilişkili lenfdamarları bağlamak için lenfatik endotel hücre etiketi olarak kullanılmıştır. Enjekte edilen tavşan anti-LYVE1 antikorları daha sonra immünohistokimya ile anti-tavşan sekonder antikoru saptanırken, lenfatik endotel hücreleri anti-PROX1 antikorları ile immünojen olarak etiketlendi. Şekil 4, PROX1+ lenfatiklere göre, thlb spinal parankim(Şekil 4A)içine anti-LYVE1 enjeksiyonunun deneysel tasarımını ve enjeksiyon bölgesine yakın bir ThLb segmentinde LYVE1 antikorlarının elde edilen 3Boyutlu dağılım desenidir (Şekil 4B). Hem vertebral lenfatikler hem de onların ekstravertebral lenfatik bağlantıları enjekte edilen anti-LYVE1 antikorları ile etiketlendi, bu da vertebral lenfatik damarlar ve vertebral lenfatik sisteme doğru lenfdrenajı ile izleyici alımını doğrulattı. NN'ler THLb bölgesinde eksikti ve bu nedenle, görüntülenmiş segmentte görüntülenemedi. Ayrıca, lenfatik damarlar boyunca gözlenen LYVE1 belirteci nin sürekli likörü, daha önceki çalışmalarda bildirildiği gibi lenfatik vaskülatürdeki LYVE1'in kesintisiz ekspresyonunu yansıtıyordu14,21. Bu çalışmanın sonuçları, 45 dk tracer enjeksiyonundan sonra, LYVE1 antikor, ancak OVA-A555, lokal vertebral lenfatik alımının saptanmasına izin vermiştir ve lokal vertebral lenfatik drenaj kalıcı bir belirteç olarak OVA-A555 tercih edildi gösterdi.

figure-results-1
Şekil 1: Vertebral lenfatik vaskülatürüç boyutlu görünümü. (A) Protokolün şematik gösterimi. (B) ThLb vertebral lenfatik vaskülatür bir dorsofrontal perspektiften bir 3D görünümü düzlemsel projeksiyon. Lenfatik damarlar iDISCO+ protokolü kullanılarak anti-PROX1 antikor (yeşil) ile immünoetiketli ve daha sonra LSFM tarafından görüntülendi. Art arda üç omurun (beyaz ok başları) vertebra kanalı içindeki vaskülatürün metamerik benzeri desenine dikkat edin. Yarım daire dorsal damarlara (beyaz ok başları) ek olarak, her vertebraağı ventral dallar (sarı oklar), spinal rami ve ganglia boyunca çift taraflı lateral çıkış yolları (beyaz oklar) ve orta hatta bir dorsal çıkış yolu (beyaz çift ok) içeriyordu. Vertebral ağlar uzunlamasına bir kap (mor oklar) ile birbirine bağlıydı. Tam bir açıklama için bkz: Jacob L. ve ark.18 SC = omurilik; Yıldız = ventral vertebral vücut; D = dorsal; L = yanal; V = ventral; Ölçek çubukları = 300 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: dcLNs OVA-A555etiketli BOS Sıvıları toplandı. (A) Deneysel tasarım şeması. OVA-A555 ya ICM veya ThLb spinal parankim içine enjekte edildi, daha sonra fareler enjeksiyondan sonra 45 dakika kurban edildi. Örnekler floresan makroskop görüntüleme(B,C)ile temizlendi ve gözlendi. ICM- (B) ve ThLb-(C)enjekte edilen farelerden cervival vertebraların floresan makroskop görüntüleri. OVA-A555 dcLNs birikmiş olduğunu unutmayın(B,C, beyaz ok başları), servikal omurilik pial ve paravasküler boşluklar (B,C) ve ICM enjeksiyonu sonrası, ventrolateral çıkış yolları, servikal sinirler boyunca büyük olasılıkla(B, beyaz oklar). SC = omurilik. Yıldız = ventral vertebral vücut; D = dorsal; L = yanal; V = ventral; B ve C = 2 mm'deki ölçek çubukları lütfen bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Vertebral lenfatik sistemde OVA-A555etiketli BOS sıvılarının saptanması. (A) Deneysel tasarım şeması. OVA-A555 ThLb spinal parankim içine enjekte edildi, daha sonra fareler 45 dakika enjeksiyondan sonra kurban edildi. Örnekler iDISCO+ protokolü ile tedavi edildi ve bir LSFM ile görüntülendi. (B,C) LSFM tarafından yakalanan frontal 3D servikal (B) ve torasik (C) omurga segmentlerinin düzlemsel projeksiyonları. OVA-A555 birikimi (kırmızı) omurilik dokularında ve dcLNs tespit edildi(B, beyaz ok), Şekil 2'degösterildiği gibi , ancak servikal ve torasik lenfatik vaskülatür immünoplor burada anti-LYVE1 antikorları ile etiketlenmiş (yeşil). SC = omurilik; Yıldız = ventral vertebral vücut; D = dorsal; L = yanal; V = ventral; Ölçek çubukları = 1 mm (B), 300 μm (C). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Anti-LYVE1 antikorlarının intraspinal enjeksiyonu sonrası vertebral lenfatik drenajın saptanması. (A) Deneysel tasarım şeması. Anti-LYVE1 antikorları THLb spinal parankim içine enjekte edildi, daha sonra fareler enjeksiyondan sonra 45 dakika kurban edildi. Örnekler iDISCO+ protokolü ile tedavi edildi ve bir LSFM ile görüntülendi. (B). Bir ThLb frontal 3D görünümleri düzlemsel projeksiyonlar (B) omurga segmenti, bir LSFM ile yakalanan. Anti-LYVE1 antikorları anti-tavşan antikorları (mor) ve anti-PROX1 antikorları (yeşil) ile lenfatik vaskülatür ile tespit edildi. Beyaz damarlar PROX1+ lenfatikler anti-LYVE1 antikorları ile birlikte etiketlenmiştir (B); bunlar vertebral (sarı oklar) ve ekstravertebral (çift sarı oklar) lenfatikler içerir. SC = omurilik; Yıldız = ventral vertebral vücut; D = dorsal; L = yanal; V = ventral; Ölçek çubukları = 300 μm (B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ReaktifHedefŞekilProtokol adımıYorum
OVA-A555 BOS izleyicisiŞekil 2 ve Şekil 32. ICM veya ThLb enjeksiyonu
7. LSFM görüntüleme.		Suda çözünür, enjekte etmesi kolay ve yüksek yoğun floresan
Anti-Lyve1 antikorLVs hücrelerinin membran belirteciŞekil 36. iDISCO+ bütün montaj immnunostaining.
7. LSFM görüntüleme.		Tüm montaj immnunostaining için verimli antikor
Dural ve epidural LV'lerin tracer drenajıŞekil 42. ICM veya ThLb enjeksiyonu
6. iDISCO+ bütün montaj immnunostaining
7. LSFM görüntüleme
Anti-Prox1 antikorLVs hücrelerinin nükleer belirteciŞekil 1 ve Şekil 46. iDISCO+ bütün montaj immnunostaining
7. LSFM görüntüleme		Tüm montaj immnunostaining için verimli antikor

Tablo 1: Çalışmada kullanılan antikorlar ve izleyiciler.

SorunOlası nedenÇözüm
Tracer enjeksiyonu için cerrahiİstenmeyen CNS doku lezyonu1. Cam kılcal damar takılması kontrol eksikliği
2. Cam kılcal damarların yanlış derinliği		1. Dikkatli bir şekilde delin, ama tam olarak, cam kılcal ekleme den önce 26 G iğne ile dura mater.
2. Cam kılcal damar eklemenin derinliğini azaltın (dura mater'den 1.5 mm).
3. Cam kılcal çapını azaltın.
Enjekte edilen izleyicinin epidural veya ekstra vertebral boşluklara istenmeyen şekilde kirletmeİzleyicinin yanlış enjeksiyonu1. Cam mikro kılcal iyi dura mater delinme içine eklenmiş olup olmadığını kontrol edin.
2. Tracer enjekte etmeden önce cam mikrokapiller ve çevrili doku arasında cerrahi tutkal ekleyin.
Enjekte edilen izleme nin aşırı hacmiEnjekte edilen izleme nin hacmini (<2 μL) azaltın.
iDISCO+ immünboyamaDokuda etiketlemenin yokluğu, heterojenliği veya aşırı arka planı1. Primer antikor konsantrasyonu ile ilgili sorunlar
2. Yetersiz permeabilizasyon
3. Yetersiz yıkama
4. Yetersiz takas		Kuluçka adımlarının sayısını ve/veya zamanını artırın: permebilizasyon, sızlanma, primer antikor ve temizleme. Bkz. http://www.idisco.info (SSS ve SORUN Giderme).
Yetersiz kireçlenmeÖzellikle baş dokuları için EDTA21 veya Mors çözeltisi ile numunenin daha sıkı bir kireçlenme tedavisi kullanın.
iDISCO+ takasÖrnekler opak veya kahverengi renklidirYetersiz ağartmaTaze H2O2 çözeltisi kullanın, hacmi ve/veya kuluçka süresini artırın.
Oksidasyon varlığıHavanın varlığından kaçınmak için tüpü tamamen doldurun.
Yetersiz takasHacmi ve/veya kuluçka süresini artırın. Bkz. http://www.idisco.info (SSS ve SORUN Giderme).
Tracer algılamaTespit edilemeyen izleyiciSeçili izleyicinin yanlış birleşimiAlexa 555, 594 ve 647 florokromlar iDISCO+protokolüne 5,6,,7,,88,9,10'adayanıklıdır. Ancak, bu FITC, GFP, RFP florokromlar için durum böyle değildir.
Enjeksiyondan sonra kurban zaman noktasıLokal vertebral lenfatiklerde kısa süreli (15 dk) drenaj analizi için OVA-A555'i tercih edin. Lenf nodu drenaj analizi için OVA-A555 ve Lyve1 antikorları uzun süreli (>45 dk) analiziçin kullanılabilir.
Görüntüleme: yakalama ve analizLenfatik devre yakalanan görüntüleri tatmin edici değildirDiseksiyon sorunu (lenf düğümleri eksik)Görüntülemek istediğiniz lenfatik devregöre, incelenmiş örnek vertebral / kafatası komşu dokuları dikkatle ekleyin.
Görüntüleme sorunu1. LSFM'nin edinim parametrelerini değiştirin: lazer yoğunluğu, ışık sayfası sayısal diyafram açıklığı, ışık sayfası kalınlığı, sergilendirme süresi.
2. Amaç kadar doku yoluyla ışık tarafından seyahat yolu azaltmak için destek örnek yerleştirin.
3. Edinim sırasında doku örneğinin içinde kabarcık olmadığından emin olun.

Tablo 2: Olası sorunlar ve çözümler de dahil olmak üzere protokolün her adımı için sorun giderme önerileri.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iDISCO+/LSFM protokolü, cns ile ilişkili lenfatik ağın hücresel çözünürlük düzeyinde çevre dokuları içinde benzeri görülmemiş 3D görünümler sağlar. Bu protokol iyi orta boy örnekler için uyarlanmıştır, exeeding değil 1.5 cm3, LSFM optik sisteminin sınırlamaları nedeniyle, azaltılmış çalışma mesafesi, ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi için ticari objektif lenslerin büyük boyutu23. Bu sınırlama tüm beyin ilişkili lenfatik sistemi yakalama engeller. Araştırma alanının ihtiyatlı bir şekilde sınırlandırılmış olması ve CNS'i çevreleyen dokuların tüm lenfatik devrelere katkıda bulunan ekstrakraniyal lenfatik damarları ve LAN'leri içerecek şekilde dikkatlice incelenmesi gerektiği unutulmamalıdır(Tablo 2).

Boyut ve anatomik hususlara ek olarak, çevreleyen mezenkimal dokuların karmaşıklığı kafatası ve vertebral kolon boyunca değişir, homojen bir örnek açıklama elde etmek ve yumuşak bir izotropik biyolojik doku içinde ışık ışını yayılmasına izin vermek için kireçlenme ve ön temizleme tedavisi adaptasyon gerektirir. Kemiklerin yokluğunda, beyin veya omurilik dokularının LFSM görüntüleme kireçlenme adımı gerektirmez, ve yakalanan görüntülerin nihai çözünürlüğü optimal19. Mors çözeltisi ile hafif bir kireçlenme adımı içeren yukarıda açıklanan protokol, Şekil 1 ve Şekil 4'tegösterildiği gibi vertebral sütunun LSFM görüntülemesi için iyi uyarlanmıştır. Buna karşılık, boyun bölgesi kas, yağ ve glandüler dokuların birden fazla tabaka ek olarak özellikle karmaşık bir kemik anatomisi görüntüler, yakalanan LSFM görüntülerin kalitesini azaltmak, Şekil 3Byansıtıldığı gibi . Boyun ve servikal bölgenin LSFM görüntüleme böylece dokuların daha sıkı bir tedavi ile geliştirilmiş olabilir; örneğin, EDTA ile, daha önce24bildirilmiştir . Bu nedenle kireçlenme adımı kritiktir ve kireçlenme koşulları, tam iDISCO+ protokolünü başlatmadan önce kullanılan her antikor için daha önce test edilmelidir(Tablo 2).

iDISCO+/LSFM protokolü, meningeal ve epidural boşluklar ile ilişkili LN'ler arasındaki bağlantı devrelerinin 3Boyutlu görünümünün üretilmesine olanak sağlarken, LSFM tarafından yakalanan görüntülerden lenfatik vaskülatür doğrudan kantitatif analizi aşağıdaki nedenlerle mümkün değildir: 1) lenfatik damar devrelerinin delineasyonu lenfatik marker ekspresyonunun sürekli desen nedeniyle güvenilmez, membranar LYVE1 hereterogenously dağıtılan çünkü21 ve PROX1 bir nükleer ifade deseni22vardır; 2) antikorların heterojen penetrasyonu, hem de eksik ve heterojen kireçlenme ve ön temizleme nedeniyle biyolojik dokuda devam edebilir asiztropi. LSFM görüntüleme böylece interaktif görselleştirme sağlayan ve böylece lenfatik vaskülatür (www.syglass.io) nicelik kolaylaştıran sanal gerçeklik araçları tarafından genişletilmesi gerekir. Ayrıca, CNS ile ilişkili devrenin kesin tanımının, daha önce11,14,,18olarak bildirilen, özellikle de dura mater ve BOS ile ilgili lenfdamarların konumunu tam olarak lokalize etmek için, ince (5-10 μm) kriyostat veya parafin gömülü doku bölümlerinde konvansiyonel immünoetiketleme ile elde edilen yüksek çözünürlüklü konfokal verilerle LSFM bilgilerinin yedeklenmesi gerektiği de dikkat çekicidir.

iDISCO+/LSFM protokolü, Şekil 3 ve Şekil 4'tegösterildiği gibi CNS ile ilişkili lenfatik sistemde makromoleküler drenajın üç boyutlu görüntülenmesine olanak sağlar. Ancak, lenfatik drenaj fonksiyonel değerlendirme gerektirir, yukarıda ayrıntılı iDISCO+/ LSFM protokolü önerileri ek olarak, titiz bir prosedür aşağıdaki, nihai sonuç enjeksiyon cerrahisi kalitesine bağlıdır gibi, teslim alanının seçimi, kullanılan makromolekül marker türü ve enjekte hacmi, ve tracer uygulama dan sonra kurban zamanı(Tablo 2). Enjekte edilen hayvanlar arasındaki izleyici deseninin varyasyonları nedeniyle, lenfatik drenaj devrelerinin karakterizasyonu büyük deneysel gruplar gerektirir (>enjeksiyon durumuna göre 10). Sunulan protokolde, 1) dura mater istenmeyen lezyonlar ve CNS dokulara penetrasyon önlemek için enjeksiyondan önce delinmiş olmalıdır; 2) enjekte edilen hacim, enjeksiyon kapilleri boyunca, epidural uzaya veya ekstravertebral dokulara istenmeyen difüzyonu sınırlamak için 2 μL'den az olmalıdır; 3) enjeksiyon kılcal ekleme derinliği CNS yaralanması veya ICM ve intraspinal enjeksiyonlarda yanlış hedefleme önlemek için dura mater altında 2 mm ile sınırlı olmalıdır, sırasıyla. Ayrıca, lenfatik damarların içinde enjekte edilen izleyicinin varlığını değerlendirmek için, yukarıda belirtildiği gibi, komşu vertebral segmentlerin tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü konfokal analizi nin yapılması gerektiğini de unutmayın. Bu analiz, marker etiketli lenfatik damarların kesitlerinde izleyici ve lenfatik belirteç için yoğunluk profili çizimlerinin oluşturulmasını gerektirir. Bu yaklaşım daha önce enjeksiyondan sonra 15 dakika thLb lenfatikler tarafından OVA555 alımı göstermek için kullanılmıştır (Jacob ve ark.14Ek Şekil 5F). Ancak, bu çalışmada anti-LYVE1 izleyicisi için resimli olmamıştır (Şekil 4).

Olası BOS izleyicileri arasında, OVA-A555 iDISCO+ protokol tedavilerine dirençli olduğu ve LSFM görüntüleme için yüksek floresan koruduğu için mükemmel bir seçenektir. Ancak, izleyici türü analiz zaman noktasına göre seçilmelidir unutmayın (Tablo 1 ve Tablo 2). Yukarıda bildirildiği gibi, lokal vertebral lenfatik damarların OVA-A555 etiketleme 15 dk enjeksiyon dan sonra gözlenmektedir14. Ancak, OVA-A555 artık bu lokal lenfatik devrelerde enjeksiyondan sonra 45 dk(Şekil 3)anti-LYVE1 antikoraksine saptanmaz (Şekil 4).

Sonuç olarak, iDISCO+/LSFM protokolü, CNS ve vertebral kolon kanserleri veya vertebral kemik ve eklem hastalıkları gibi fizyolojik ve patolojik koşullarda CNS ile ilişkili lenfatik sistemin 3Boyutlu yapısını ve drenajını araştırmak için iyi uyarlanmıştır. Tam prosedür uzun olmasına ve metodolojik titizlik gerektirmese de, sanal gerçeklik araçları ve yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme kullanılarak tamamlayıcı analizile kullanıldığında değerli, benzersiz bilgiler sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale tarafından desteklendi. Agence Nationale Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), Federasyon pour la Recherche sur le Cerveau (FRC 2017), Carnot Olgunlaşma (L.J.), Universidade Federal de Rio de Janiero (J.B.için UFRJ), NIH (R01EB016629-01) ve Yale Tıp Fakültesi. ICM platformlarını kabul ediyoruz: Hücresel görüntüleme için ICM-QUANT ve immünohistokimya için ICM-histomikler. Tüm hayvan çalışmaları PHENO-ICMice tesisinde yapılmıştır. Çekirdek 2 "Investissements d'avenir" (ANR-10- IAIHU-06 ve ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) ve "Fondation pour la Recherche Médicale" tarafından desteklenir. Nicolas Renier'i metodolojik tavsiyeler ve el yazması okuması için kabul ediyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< güçlü > Sarf malzemeleri< / güçlü >
Santrifüj tüpleri: 0.2mlEppendorf30124359
Santrifüj tüpleri: 2mlEppendorf30120094
Konik santrifüj tüpleri: 15mlFalcon352096
Konik santrifüj tüpleri: 50mlFalcon352070
Mikrotom bıçak 80mmMicrom Microtech FransaF/MM35P
İğneler 26G (0.45x13 mm)TerumoAN*2613R1
Şırınga 1mlTerumoSS+01H1
Mikroskoplar ve görüntüleme yazılımları
AxioZoom.V16 floresan stereo zoom mikroskobu, ORCA-Flash 4.0 dijital sCMOS kamera (Hamamatsu Photonics) veya bir OptiMOS sCMOS kameraZeiss
Imspector Mikroskop kontrol yazılımı, Sürüm v144 (satın alma yazılımı)Abberior instruments
Imaris File Converter x64 9.2.0 (dosya dönüştürme yazılımı), Imaris stitcher yazılımı 9.2.0 (stitcher yazılımı), Imaris x64 9.2.0 (3D yazılımı)OXFORD instruments
LED lazerler (OBIS) LVBT Lazer modülü 2. nesilTUTARLI
Ultramikroskop II, bir sCMOS kamera (Andor Neo) ve bir 4  &zamanlar;  /0.3 objektif lens (LVMI-Fluor WD6)LaVision Biotec
Reagents
Alexa Fluor 568 Eşek anti TavşanThermo FisherA10042
Alexa Fluor 647 Eşek anti keçiJackson ImmunoResearch705-605-147
Alexa Fluor 647 Eşek anti TavşanJackson ImmunoResearch711-605-152
Anti-LYVE1 poliklonal antikoruAngiobio#11-034
Anti-PROX1 keçi poliklonal IgG antikoruR& D sistemleri#AF2727
Buprenorfin Enjeksiyon Ampulleri (Buprecare solüsyonu, 0.3mg / ml)AnimalcareAmpul 1ml
Dibenzil Eter% 100 (DBE)Sigma Aldrich108014
Diklorometan% 100 (DCM)Sigma Aldrich270997
Formik asit% 99CARLO ERBA405793
GlisinSigma AldrichG.7126
Domuzdan elde edilen heparin sodyum tuzuSigma AldrichH4784
Hidrojen peroksit çözeltisi (H2< / sub>O2< / sub>% 30)Sigma AldrichH1009
İzofluran (Iso-Vet% 100)PiramalNDC 66794-013-10
Metanol% 100Sigma Aldrich322415
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Konjugeİnvitrojen11549176
Fosfat Tampon Çözeltisi PBS (stok çözeltisi 10X)EuromedexET330-A
Sodyum Pentobarbital (Ötesol 400mg/mL)Dechra08718469445110
Tri-sodyum sitratVWR6132-04-3
Cerrahi alet ve ekipmanlar
Anestezi sistemiUniventorUniventor 410 Anestezi Ünitesi
Cam mikropipet çektirmeNarishigePC-10
Isıtma yastığıCMA Mikrodiyaliz ABCMA 450 Sıcaklık kontrolörü
Mikrokılcal damarlar (Cam Kılcal Damarlar)Harvard ApparatusGC120-15
Mikroforseps, forseps, diseksiyon makası ve Michel Sütür Klipsleri (7.5  &zamanlar; &ince; 1.75mm)İnce Bilim Aracı12040-01
Neşter (steril tek kullanımlık neşter 23)Swann-Norton0510
Stereotaksik cihazKOPFModel 940
Şırınga Hamilton 10 & mikro; l 701NHamilton28618-U
Sıcak hava SistemiVet-Tech LTDHE011

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
  2. Iliff, J. J., Goldman, S. A., Nedergaard, M. Implications of the discovery of brain lymphatic pathways. The Lancet Neurology. 14 (10), 977(2015).
  3. Engelhardt, B., et al. Vascular, glial, and lymphatic immune gateways of the central nervous system. Acta Neuropathologica. 132, 317-338 (2016).
  4. Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. , 1-14 (2018).
  5. Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Lymphatics in Neurological Disorders: A Neuro-Lympho-Vascular Component of Multiple Sclerosis and Alzheimer's Disease. Neuron. 91 (5), 957-973 (2016).
  6. Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434(2017).
  7. Ma, Q., Decker, Y., Müller, A., Ineichen, B. V., Proulx, S. T. Clearance of cerebrospinal fluid from the sacral spine through lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 216 (11), 2492-2502 (2019).
  8. Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3210-3219 (2017).
  9. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  10. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. The Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  11. Antila, S., et al. Development and plasticity of meningeal lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3645-3667 (2017).
  12. Ahn, J. H., et al. Meningeal lymphatic vessels at the skull base drain cerebrospinal fluid. Nature. 572 (7767), 62-66 (2019).
  13. Pollay, M. The function and structure of the cerebrospinal fluid outflow system. Cerebrospinal Fluid Research. 7, 9(2010).
  14. Jacob, L., et al. Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice. Nature Communications. 10 (1), 1-16 (2019).
  15. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  16. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  17. Song, E., et al. VEGF-C-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance of brain tumours. Nature. 577 (7792), 689-694 (2020).
  18. Absinta, M., et al. Human and nonhuman primate meninges harbor lymphatic vessels that can be visualized noninvasively by MRI. eLife. 6, 29738(2017).
  19. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  20. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  21. Jackson, D. G., Prevo, R., Clasper, S., Banerji, S. LYVE-1, the lymphatic system and tumor lymphangiogenesis. Trends in Immunology. 22 (6), 317-321 (2001).
  22. Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
  23. Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet microscopy: a tutorial. Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).
  24. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

iDISCO ProtokolMSS li kili LenfatiklerLenfatik DrenajFloresan zleyici EnjeksiyonuDoku effafla t rmaAntikor EtiketlemeOrtogonal Projeksiyonlar

İlgili makaleler