Yöntem makalesi

Viral Kaynaklı Nöroinflamatuar Yanıtları İncelemek Için Fare Ayak Takımı Aşılama Modeli

DOI:

10.3791/61121

⸱

14 Haziran 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Princeton University, 2Princeton Neuroscience Institute, Princeton University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ayak takımı aşılama modeli in vivo viral kaynaklı nöroinflamatuar yanıtları karakterize etmek için değerli bir araçtır. Özellikle, viral kinetik ve ilgili immünopatolojik süreçlerin periferik sinir sisteminde başlatılan net bir değerlendirme sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol farelerde alfaherpesvirus enfeksiyonu sırasında nöroinflamatuar yanıtların başlatılması ve geliştirilmesi için kullanılan bir footpad aşılama modeli açıklar. Alfaherpesvirüsler periferik sinir sisteminin ana işgalciler ilerler gibi (PNS), Bu model viral çoğaltma kinetik karakterize etmek için uygundur, CNS PNS onun yayılması, ve ilişkili nöroinflamatuar yanıtlar. Ayak takımı aşılama modeli virüs parçacıkları nın ayak takımı epidermisindeki birincil enfeksiyon bölgesinden epidermisin, ter bezlerini ve dermisi innerve eden duyusal ve sempatik sinir liflerine yayılmasını sağlar. Enfeksiyon dorsal kök gangliyonu siyatik sinir yoluyla yayılır (DRG) ve sonuçta beyne omurilik yoluyla. Burada, bir fare footpad pseudorabies virüs (PRV), bir alfaherpesvirüs yakından herpes simpleks virüsü (HSV) ve varisella-zoster virüsü (VZV) ile ilgili aşılanır. Bu model PRV enfeksiyonu ciddi inflamasyon neden olduğunu göstermektedir, ayak ve DRG nötrofil infiltrasyon ile karakterize. Yüksek inflamatuar sitokin konsantrasyonları daha sonra ELISA tarafından homojendokularda saptanır. Buna ek olarak, DRG'de PRV geni ile protein ekspresyonu (qPCR ve IF boyama yoluyla) ile pro-inflamatuar sitokin üretimi arasında güçlü bir korelasyon gözlenmektedir. Bu nedenle, ayak takımı aşılama modeli alfaherpesvirüs kaynaklı nöropatilerin altında yatan süreçlerin daha iyi anlaşılmasını sağlar ve yenilikçi tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yol açabilir. Buna ek olarak, model periferik nöropatiler üzerinde araştırma rehberlik edebilir, multipl skleroz ve PNS ilişkili viral kaynaklı hasar gibi. Sonuçta, uyuşturucu gelişimi için bir maliyet-etkin in vivo aracı olarak hizmet verebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, PNS'den CNS'ye ve ilişkili nöroinflamatuar yanıtlara kadar virüslerin replikasyonve yayılmasını araştırmak için bir footpad aşılama modelini açıklamaktadır. Ayak takımı aşılama modeli yoğun nöronlarda alfahiçvirüs enfeksiyonu çalışmak için kullanılmıştır1,2,3. Bu modelin temel amacı nörotropik virüsler CNS ulaşmadan önce PNS ile maksimal bir mesafe seyahat etmek için izin vermektir. Burada, bu model psödorabis virüsü (PRV) ile enfekte farelerde belirli bir nöropati (nöropatik kaşıntı) gelişiminde yeni anlayışlar elde etmek için kullanılır.

PRV birkaç iyi bilinen patojenler ile ilgili bir alfaherpesvirus (yani, herpes simpleks tip 1 ve 2 [HSV1 ve HSV2] ve varisella-zoster virüsü [VZV]), hangi soğuk yaralar, genital lezyonlar ve su çiçeği neden, sırasıyla4. Bu virüslerin hepsi pantropik ve belirli bir doku tipi için yakınlık göstermeden birçok farklı hücre tipleri enfekte edebiliyoruz. Ancak, hepsi ev sahibi türlerin PNS (ve bazen, CNS) işgal ederek karakteristik bir nörotropizm sergiler. Doğal konak domuz, ama PRV en memeliler bulaştırmak olabilir. Bu doğal olmayan konaklarda, PRV PNS enfekte ve şiddetli bir pruritus indükler "deli kaşıntı", perakut ölüm takip5,6. PRV enfeksiyonunun klinik sonucu ve patogenezinde nöroimmün yanıtın rolü tam olarak anlaşılamamıştır.

Ayak takımı aşılama modeli PRV footpad epidermal hücrelerde enfeksiyon başlatmak için izin verir. Daha sonra, enfeksiyon epidermis innerve duyusal ve sempatik sinir lifleri içine yayılır, ter bezleri, ve dermis. Enfeksiyon yaklaşık 60 saat içinde DRG siyatik sinir yoluyla hareket eden virüs parçacıkları tarafından yayılır. Enfeksiyon omurilik yoluyla yayılır, sonuçta hayvanlar moribund (82 h post-enfeksiyon) haline geldiğinde arka beyne ulaşan. Bu süre zarfında doku örnekleri toplanabilir, işlenebilir ve virüs replikasyonu ve immün yanıt ın belirteçleri için analiz edilebilir. Örneğin, PRV patogenezinde klinik, virolojik ve nöroinflamatuar süreçlerin başlatılması ve gelişimi arasında korelasyon lar kurmak için farklı dokularda histolojik inceleme ve viral yük nicelliği yapılabilir.

Ayak takımı aşılama modeli kullanılarak farelerde PRV'ye bağlı pruritusun hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırılabilir. Ayrıca, Bu model herpesvirus enfeksiyonları sırasında virüs kaynaklı nöroinflamasyon başlatılması ve gelişimi içine yeni bir fikir sağlayabilir. Alfaherpesvirüs kaynaklı nöropatilerin altında yatan süreçlerin daha iyi anlaşılması yenilikçi tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yol açabilir. Örneğin, bu model post-herpezik lezyonları olan hastalarda nöropatik kaşıntı mekanizmaları araştırmak için yararlıdır (örneğin, herpes zoster, zona) ve ilgili insan hastalıkları için farelerde yeni terapötik hedefleri test.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri Princeton Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilip onaylanan bir protokole (sayı 2083-16 ve 2083-19) uygun olarak yapılmıştır. Bu çalışma, Princeton Üniversitesi biyogüvenlik komitesi tarafından onaylanmış tam donanımlı bir laboratuarımız olan biyogüvenlik seviyesi-2 (BSL-2) gerekliliklerini sıkı bir şekilde izleyerek yapılmıştır. Fare ayak takımı aşınması, viral aşılama, fare diseksiyonu ve doku toplama gibi işlemler Princeton Üniversitesi biyo-çevreleme hayvan tesis odasında bir biyolojik güvenlik kabininde (BSC) gerçekleştirildi. Prosedürü gerçekleştirenler tek kullanımlık gece elbiseleri, baş örtüsü, göz koruması, steril eldivenler, cerrahi maskeler ve ayakkabı kılıfları giydiler.

1. Fare ayak takımı aşınması

  1. Bir C57BL/6 fare anestezi (5-7 hafta eski) izofluran gaz anesteziile, küçük bir anestezi sistemi (oda) ile% 3 dozda teslim.
    1. Fareyi, aşıdan önce arka ayak altlığı nda, cerrahi anestezi düzlemine yerleştirin. Fareye diyaframlı bir burun konisi (hayvanın namlusuna uyacak kadar büyük bir yarık) takın ve sabit dozda izofluran gazı anestezik %1,5-2,0 oranında anestezi kağıda takın.
    2. Başparmak forseps ile güçlü çimdikleme tarafından oluşturulan ağrılı uyarıcı bir yanıt için yakından fareyi izleyin.
  2. Hafifçe düz forceps ile bir arka ayak takımı kavramak.
    1. Yavaşça arka ayak takımı glabrous cilt aşındırın yaklaşık 20x, topuk ve yürüyüş pedleri arasında, bir emery kurulu (100-180 kum). Çok sık abrading veya çok fazla basınç uygulayarak kanama neden etmeyin.
    2. İnce forceps kullanarak, yavaş yavaş stratum basale ortaya çıkarmak için aşınma ile ayrılmış stratum korneum soyma.

2. PRV ayak takımı aşısı

  1. % 2 fetal sığır serumu (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin içeren DMEM ortamlarında istenilen titreye seyreltilmiş virüs inokülünü hazırlayın (Malzeme Tablosu).
    1. PK15 hücrelerindeki virüs stoğundaki plak oluşturan birimlerin (PFU) sayısını hesaplayın ve standartlaştırın ve viral inokülü buna göre seyreltin.
      NOT: Bu çalışmada 8 x 106 PFU dozunda İİV (PRV-Becker) öldürücü suşu kullanılmıştır. Bu doz, tüm aşılanmış hayvanların 82 saat post-inoülzyon (hpi) klinik semptomlar gösterdisağlamak için önceki bir ön deneyde optimize edilmiştir.
    2. Buz üzerinde virüs inoculum tutun ve kullanmadan önce yavaşça karıştırın.
  2. Abraded pad (topikal uygulama) üzerine virüs inoculum (8 x 106 PFU) bir 20 μL damlacık ekleyin. Sahte aşıları (sadece orta) paralel olarak gerçekleştirin.
  3. Virüsün adsorpsiyonuna yardımcı olmak için 10 x'i iğnenin şaftına hafifçe sürtün. İğne ucu ile çizilmekaçının. Bu adımı her 10 dakikada bir tekrarlayın.
  4. Abraded ayak takımı kuruyana kadar fareyi 30 dk anestezi altında tutun.
  5. Anesteziyi durdurduktan sonra fareyi sternal recumbency'yi koruyana kadar izleyin ve klinik takip ve örnekleme için ayrı bir kafese yerleştirin.

3. Fare diseksiyonu ve doku toplama

  1. Enfeksiyon dan sonra uygun zamanlarda, fareyi boğulma yöntemi (CO2) ile ötenaziedin.
    NOT: Bu çalışmada, PRV-Becker enfekte fareler için insancıl uç nokta (hayvanlar terminal belirtileri göstermeye başladığınızda) 82 hpi olduğunu. Ötenazi kontrol hayvanları paralel olarak.
  2. İğneler/iğneler kullanarak fare nin ventral tarafını cerrahi bir paspasın üzerine yerleştirin. Farenin uzuvlarını iğnelerle cerrahi bir köpük tahtasına sabitle. Kürk kontaminasyonunu en aza indirmek için farenin ventral tarafını %70 etanol ile ıslayın.
  3. Forceps kullanarak kürk ve cilt dış tabaka çimdik ve üretral açılış yakınındaki ince makas kullanarak küçük bir başlangıç kesi yapmak.
    1. Bu açıklıktan çeneye kadar orta ventral taraftaki kesite devam edin.
    2. Ön ekstremitelerin ve arka ekstremitelerin ekstremitelerine doğru iki lateral kesi uzatın.
    3. Altta yatan kas tabakasından cildi ayırın ve yan aşağı pin.
    4. Karın boşluğuaçın ve toraks tabanına kadar eğim. İki transversal kesi yaparak karın boşluğunun açılmasını tamamlayın.
    5. Her iki yan tarafta diyafram ve kaburga keserek torasik boşluğu açın.
      NOT: Göğüs kafesinin kenarlarının kesilmesi kalbi kesme riskini önler.
    6. Kalp, akciğerler, dalak, pankreas, karaciğer, böbrekler ve mesane gibi açık organları 1,5 mL mikrotüpler de toplayın. Tüpleri buzda tut.
    7. Topuk ve yürüyüş pedleri arasında abraded footpad kesin ve adım 3.3.6 açıklandığı gibi bir tüp doku parçası yerleştirin.
  4. Fare nin yan tarafını yukarı yerleştirin ve kürkü %70 etanolile ısla. Vertebral sütun ortaya çıkarmak için deri tabakası nı kesin.
    1. Pelvis bölgesinde küçük bir kesi yapın. Arka bacaklardan baş doğru deri şerit.
    2. Bacakları ve kolları, her iki taraftaki omurilik kolonuna paralel ve yakın bir makasla keserek çıkarın.
    3. Kafatasının tabanında (C1-C2 seviyesi) kafa kes.
    4. Foramen magnumdan frontal kemiğe kadar olan makasla kafatasını kesin.
    5. Kafatasını forceps kullanarak yanal yönlerde çekin.
    6. Yavaşça forceps kullanarak beyin dışarı kepçe ve adım 3.3.6 açıklandığı gibi devam edin.
  5. Kavisli makas kullanarak kas, yağ ve yumuşak dokuları keserek omurilik temizleyin. Kuyruğunu kes. Bozulmamış omurgayı steril buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Omurilik ve DRG daha fazla diseksiyon kadar buz tüpleri tutun.

4. Omurilik ve DRG ekstraksiyonu

NOT: Fare diseksiyonundan hemen sonra vertebra kolonundan omurilik ve DRG alın. Omurilik ve DRG ekstraksiyon için protokol bir önceki yayın dan uyarlanmıştır7.

  1. Buz gibi PBS tüpünden vertebra kolonunu çıkarın ve soğutmadan sonra daha kolay hale gelen kalan yumuşak dokuları çıkarın.
  2. Bir jilet kullanarak omurlar (T1, L1 ve S2 seviyeleri) aracılığıyla sütunda üç enine kesim yapın. Üç parçayı steril buz gibi PBS içeren 15 mm'lik Petri kabına yerleştirin. Daha sonraki çözümlemeiçin segmentlerin kökenini takip edin ve işaretleyin.
  3. Bir segment alın ve forceps arasında güvenli, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde. Bir jilet kullanarak orta hattan tek bir uzunlamasına keserek sütunu iki eşit yarıya bölün.
  4. Her iki yarıya da yeni steril buz gibi PBS içeren yeni bir Petri kabına yerleştirin. Sol ve sağ tarafları ayırt edebilmek için segmentin doğru yönünü sağlayın.
  5. Bir diseksiyon mikroskop altında, yavaşça ince forceps kullanarak bir rostral için bir rostral her yarısından vertebra sütunundan omurilik soyma.
  6. 500 μL steril buz gibi PBS içeren 1,5 mL mikrotüplerde her iki omurilik yarılarını toplayın. Tüpleri buzda tut.
  7. Yavaşça DRG ortaya çıkarmak için omurilik bir tarafında diğer menenjler kaldırın.
  8. Maruz kalan spinal sinir kavrayarak ayrı ayrı her DRG çıkarın ve omurilik yavaşça dışarı çekin. Toplanan DRG'yi buz gibi PBS içeren 15 mm'lik Petri kabına yerleştirin. Tüm ipsilateral ve kontralateral DRG'yi omurilik segmentinden ayrı olarak hasat edin ve adım 4.5'te açıklandığı gibi ilerleyin.
    NOT: DRG beyaz spinal sinir boyunca yuvarlak şeffaf bir yapı olarak görülebilir.
  9. Diğer iki spinal kolon segmentini kullanarak 4.3-4.7 adımlarını 30-45 dk içinde tekrarlayın.
  10. Tüm tüpleri 4 °C'de 3 dk yüksek hızda (17.900 x g)santrifüj edin.
  11. Sıvı nitrojen de süpernatant ve flash-freeze tüpleri aspire. Daha fazla doku homojenizasyonu için tüpleri -80 °C'de saklayın.
  12. Alternatif olarak, 4.9 adımdan sonra histopatolojik analizler ve/veya immünororeskans boyamaiçin temizlenmiş DRG ve diğer fare dokularını düzeltin ve kesitleyin.

5. Doku homojenizasyonu

  1. Buz üzerinde dondurulmuş doku örnekleri içeren tüpleri eritin.
  2. 100 mg doku tartın ve steril çelik boncuk ve 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 1 M Tris-HCl (pH = 8,0), 5 M NaCl, %10 SDS içeren 2 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve kokteyl inhibitörü tabletleri proteaz edin.
  3. 2 dk için 20 döngü/s'de homogenizer kullanarak oda sıcaklığında (RT) dokuları bozun, ardından 1 dk bekleme süresi, ardından 2 dk için 20 döngü/s.
  4. Tüpü rt'de 10 dk yüksek hızda (17.900 x g)santrifüj edin.
  5. Yeni bir tüpte süpernatant (500 μL) toplayın ve inflamatuar belirteçleri ve viral yükleri ölçmek için ELISA ve qPCR yapana kadar -20 °C'de saklayın.
    NOT: QPCR için, RNase içermeyen malzeme (yani, boncuk, tüp, vb) ile tüm örnekleri toplamak ve% 1 betamercaptoetanol içeren RNA lysis tampon ile dokuları bozabilir (Malzeme Tablosu).

6. Dondurulmuş DRG bölümlerinin hazırlanması ve immünofloresan boyanmesi

  1. Doku işleme
    1. Parçalara dolanve temizlenmiş DRG'yi %1 paraformaldehit (PFA) ile 2 saat BOYUNCA RT'de sabitleyin.
    2. PBS'de %10 sakaroz ile 15 mL'lik bir tüpe doku aktarın. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
    3. PBS'de %20 sakaroz ile 15 mL'lik bir tüpe doku aktarın. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
    4. PBS%30 sakaroz ile 15 mL tüp içine doku aktarın. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
    5. Bir kriyomold kullanarak OCT dokular gömmek ve hızlı dondurma için kuru buz blokları yerleştirin.
    6. Numuneleri kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
  2. Kriyoding hazırlığı
    1. -80 °C'den donmuş bloğu çıkarın ve 30 dakika boyunca kriyostat oda sıcaklığında dengelemesine izin verin.
    2. 15 μm kalınlığında DRG cryosection ve slaytlar üzerine bölümleri monte.
    3. Slayta monte edilmiş dokunun etrafına hidrofobik bir daire çizmek için bir kalem kullanın.
    4. Slaytları 4 °C'de boyama ya da boyama kadar tutun.
  3. İmmünofloresan boyama
    1. DRG bölümlerini 3x PBS'de 10 dakika boyunca RT'de yıkayın.
    2. 37 °C'de 1 saat boyunca istenilen primer antikor (örneğin, PRV glikoprotein B'ye karşı fare antikoru) ile 100 μL'lik kesitleri kuluçkaya yatırın. % 10 negatif keçi serumu içeren PBS primer antikor seyreltin.
    3. Adımı 6.3.1'i tekrarlayın.
    4. 37 °C'de 50 dakika boyunca istenilen ikincil antikor (keçi anti-fare Alexa Fluor 488) 100 μL ile bölümleri kuluçkaya yatırın. Sadece PBS'de sekonder antikor seyreltin.
    5. Bölüme PBS'de seyreltilmiş 100 μL DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindole) boya ekleyin. Daha fazla kuluçka numunesi 37 °C'de 10 dk.
    6. Adımı 6.3.1'i tekrarlayın.
    7. Örnekleri floresan montaj ortamı nı kullanarak cam kaydıraklarüzerine monte edin ve kapak lı olarak emniyete alayın ve örtün.

7. Parafin gömülü doku kesitlerinin hazırlanması ve H&E boyandırı

  1. 4 °C'de 24 saat boyunca %10 formalin ile dokuyu düzeltin.
  2. Parafin katıştırma ve sabit dokuların kesiti için standart işlem çizelgesi ni gerçekleştirin. Transfer sabit dokular 70% etanol ve süreç yükseltilmiş alkoller ile ksilen ve parafin takip, daha önce açıklandığı gibi8.
    NOT: Kasetlerin içinde DRG gibi küçük doku örneklerini saklamak için polyester süngerkullanın.
  3. Standart deparafinizasyon yapın ve ardından doku kesitlerinin H&E boyantisyonu, daha önce açıklandığı gibi9.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare ayak takımı aşılama modeli in vivo alfaherpesvirus enfeksiyonunun immünopatogenezinin karakterizasyonuna olanak sağlar, buna inolanmış ayak lıktan sinir sistemine enfeksiyonun replikasyonu ve yayılması ve spesifik nöroinflamatuar yanıtların indüksiyonu da dahil olmak üzere.

Bu çalışmada, ilk olarak fare arka ayak takımı aşılanmış ve ya mock-aşılanmış ya da PRV (PRV-Becker) öldürücü bir suşu ile aşılanmış aşılanmış. Aşınma yeri kontrol ayak takımı görünür oldu. İyileşme sürecinin bir parça...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan ayak takımı aşılama modeli alfaherpesvirüs enfeksiyonu sırasında nöroinflamatuar yanıtların başlatılması ve gelişimini araştırmak için yararlıdır. Ayrıca, bu in vivo modeli çoğaltma kinetik kurmak ve PNS CNS alfaherpesvirus yayılması nı kurmak için kullanılır. Bu diğer aşılama modelleri için bir alternatif, yan deri aşılama modeli gibi, hangi derin dermal çizilme dayanır13, veya intrakranial rota, doğrudan CNS içine virüs tanıttı14,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar histopatoloji analizleri yürüten mükemmel teknik destek için Charles River laboratuvarları kabul. Bu çalışma Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) (RO1 NS033506 ve RO1 NS060699) tarafından finanse edilmiştir. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Antikor anti-PRV gBLaboratuvar1/500 seyreltme
Aqua-hold2 pap kalem kırmızıFisher scientific2886909
Kompakt zımpara tahtaları-24 sayım (100/180 tane tırnak törpüsü)Revlon
Complete EDTA içermeyen Proteaz İnhibitörü KokteyliSigma-Aldrich11836170001
C57BL/6 fare (5-7 hafta)The Jackson Laboratuvarlar
DAPI çözeltisi (1mg/ml)Fisher scientific622481/1000 seyreltme
Tek kullanımlık steril polistiren petri kabı 100 x 15 mmSigma-AldrichP5731500
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)Hyclone, GE Healthcare yaşam bilimleriSH30022
Dulbecco'nun Fosfat Tampon Salin (PBS) çözeltisiHyclone, GE Healthcare yaşam bilimleriSH30028
Fetal sığır serumu (FBS)Hyclone, GE Healthcare yaşam bilimleriSH30088
İnce kavisli makas paslanmaz çelikFST14095-11
Fluoromount-G montaj ortamı Fisherscientific0100-01
Formalin çözeltisi, nötr tamponlu %10Sigma-AldrichHT501128
Isothesia IsofluranHenry ScheinNDC 11695-6776-2
Mikrosantrifüj tüpü 2mlDenville Scientific1000945
Mikrotüp 1.5mlSARSTEDT72692005
Negatif keçi serumuVectorS-1000
Penisilin / StreptomisinGibco154022
Hassas Kayma iğnesi 18GBD305196
Tıraş bıçağı çelik sırtPersonna9412071
RNA lizis tamponu (RLT)Qiagen79216
Paslanmaz Çelik Boncuklar, 5 mmQiagen69989
Superfrost/artı mikroskobik slaytlarFisher scientific12-550-15
Doku lizörü LTQiagen69980
Tissue-Tek OCTSakura4583
488 (keçi anti-fare)Yaşam TeknolojileriA110291/2000 seyreltme
tarafından yapılmıştır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
  2. Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
  3. Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
  4. Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
  5. Wittmann, G., Rziha, H. J. Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. Knipe, D. M., Howley, P. M. 9, Kluwer Academic Publishers. Boston, Mass. 230-325 (1989).
  6. Diseases of swine, 6th ed. Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. 209-223 (1986).
  7. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82(2016).
  8. Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
  9. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  10. Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608(2017).
  11. Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
  12. Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087(2019).
  13. Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
  14. Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
  15. Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
  16. Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
  17. Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), Basel, Switzerland. 364-382 (2013).
  18. Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
  19. MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188(2018).
  20. Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
  21. Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), Basel, Switzerland. 49(2017).
  22. Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Viral N roinflamatuar Yan tAlphaherpesvirus EnfeksiyonuPseudorabies Vir s ModeliDorsal K k Ganglion AnaliziOmurilik DiseksiyonuDoku HomojenizasyonuELISA Sitokin TespitiqPCR Gen Ekspresyonumm nofloresan Boyama

İlgili makaleler