Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanarak Konak Dışında Influenza Virüsünün Hayatta Kalmasını İzleme

Bir virüsün bulaşması çeşitli faktörlerin kombinasyonuna dayanır. Ortamda salgılanan bir virüs için, bulaşması aynı zamanda konak dışındaki koşullarda devam etme yeteneğine de bağlıdır. Genel olarak viral inaktivasyonu incelemek, bu nedenle, ulusal sağlık otoritelerinin ve politika yapıcıların kontrol ve biyogüvenlik önlemlerini uygulamasına yardımcı olmak için çok önemli bir adımdır.

Doğal ve laboratuvar ortamlarında virüs kalıcılığı hakkındaki bilgiler son on yılda önemli ölçüde artmıştır. İnfluenza A virüsleri (IAV) durumunda, bulaşma yolları viral parçacıkları çok çeşitli çevresel koşullara gönderir. Özellikle, 1) dışkı-oral yollar aracılığıyla su yoluyla bulaşabilir (yani kuş virüsleri), veya 2) kontamine fomitlerin yanı sıra aerosoller ve solunum damlacıkları (örneğin, kümes hayvanları ve memeli virüsleri) tarafından doğrudan veya dolaylı temas ¹. Her durumda, IAV, enfeksiyozitelerini az çok hızlı bir şekilde etkileyen çeşitli fizikokimyasal parametrelere (örneğin, pH, tuzluluk, sıcaklık ve nem) gönderilir2,3,4,5,6,7,8,9. Özellikle zoonotik ve pandemik virüsler konusunda, çevresel faktörlerin virüs dinamiklerini etkileme potansiyelini ve maruz kalma ve türler arası bulaşma risklerini değerlendirmek büyük önem taşımaktadır.

Şimdiye kadar, geleneksel viroloji teknikleri (yani, plak tahlilleri yoluyla viral titer tayini veya% 50 doku kültürü enfeksiyöz doz tahmini) zaman içinde IAV enfeksiyözlüğü değerlendirmek için kullanılmıştır; ancak bu teknikler zaman alıcıdır ve birçok malzeme gerektirir10,11,12. Enfekte hücrelerin mikroelekrodlarla zaman içinde empedansını ölçmek, genel olarak viral inaktivasyonun yanı sıra farklı çevresel koşullarda IAV sağkalımlarını izlemek için yararlı bir araç olarak hizmet eder. Bu yöntem, sitopatik etkilerin öznel insan gözleminin yerini alan nesnel, gerçek zamanlı veriler sağlar. Virüs titrasyonunu belirlemek, böylece geleneksel ölçümlerin daha düşük güven aralıklarıyla değiştirilmesi ve emek yoğun uç noktaların testlerinden kaçınılması için kullanılabilir.

Hücre empedansının ölçülmesi ile klasik plak tahlil veya _TCID50 yöntemleri ile elde edilen titrasyon sonuçları arasında doğrusal bir korelasyon mevcuttur. Bu nedenle empedans bazlı titrasyon yöntemi ile elde edilen veriler, virüsün seri seyreltilmesi ile standart bir eğri oluşturularak _TCID50 veya pfu değerlerinde kolayca dönüştürülebilir13,14,15,16,17. Serum örneklerinde bulunan nötralize edici antikorların tespiti, niceliği ve etkinliği de bu deneysel yaklaşım kullanılarak elde ^{edilebilir18,19}. Daha yakın zamanda, Equid alphaherpesviruses20'ye karşı antiviral bileşikleri taramak ve değerlendirmek için empedans tabanlı hücresel tahliller kullanılmıştır.

Bu teknoloji, IAAV'lerin tuzlu sudaki kalıcılığını farklı sıcaklıklarda değerlendirmek ve IAV'nin hemagglutinininde ortamdaki IAV kalıcılığını artıran veya azaltan mutasyonları tanımlamak için ^{kullanılmıştır21}. Bu tür taramalar, geleneksel titrasyon yöntemlerini kullanıyorsanız kapsamlı bir çalışma gerektirir. Ancak, bu metodoloji hücre morfolojisi, hücre numarası ve hücre yüzeyi bağlanma gücü üzerinde etkisi olan herhangi bir virüs için kullanılabilir. Ayrıca çeşitli çevresel koşullarda (yani havada, suda veya yüzeylerde) kalıcılığı izlemek için de kullanılabilir.

Burada açıklanan protokol örnek olarak suda IAV sağkalımını uygular. İnsan influenza virüsleri uzun süreler boyunca farklı fizikokimyasal parametrelere maruz kalır. 35 °C'de salin (35 g/L NaCl) su, önceki sonuçlara göre çevre modeli olarak ^{seçilmiştir9}. Maruz kalan virüslerin artık enfeksiyonu hücre enfeksiyonu yoluyla farklı zaman noktalarında ölçülür. IAV amplifikasyonu için referans hücre tipi olan MDCK hücreleri, mikroelektrod sensörleri ile kaplanmış ve 24 saat sonra maruz kalan virüsler tarafından enfekte edilmiş 16 kuyu mikrotiter plakası üzerinde tohumlanır. Hücre empedansı her 15 dakikada bir ölçülür ve hücre indeksi (CI) adı verilen rastgele bir birim olarak ifade edilir. Başlangıç hızı doğrudan hücre kültürüne aşılanan enfeksiyöz viral parçacıkların sayısına bağlı olan influenza virüsünün neden olduğu sitopatik etkiler, daha sonra _CIT50 değeri olarak ölçülen CI azalmasına yol açar. Bu değer, ilk CI'dan %50 azalmayı ölçmek için gereken süreye karşılık gelir (yani, virüs eklemeden önce). Çeşitli çevresel maruz kalma süreleri için hesaplanan _CIT50 değerleri, _CIT50 değerlerinin doğrusal gerilemesi sonrasında bir virüsün inaktivasyon eğiminin düşür.

Tüm influenza virüslerini uygun biyogüvenlik düzeyi gereksinimlerine göre ele alın (alt tipe bağlı olarak BSL-2 veya üstü). Deneyler arasında düşük varyasyon sağlamak için düşük geçiş geçmişine (MDCK hücrelerinde 5x'ten az) sahip IAV suşlarını kullanın.

1. Reaktiflerin ve başlangıç malzemelerinin hazırlanması

1. MDCK hücrelerinin ve steril hücre kültürü ortamının hazırlanması
   1. Modifiye Eagle'ın ortamında (MEM) %10 ısı inaktive fetal baldır serumu (FCS) ve antibiyotiklerle (100 birim/mL penisilin, 100 mg/mL streptomisin) Madin-Darby Köpek Böbreği (MDCK) hücrelerini yetiştirin.
   2. Çözdükten sonra, MDCK hücrelerini tam iyileşmeyi sağlamak için enfekte etmeden önce en az 2 kat (ancak hücre fenotiplerinde herhangi bir sürüklenmeyi önlemek için 30'dan az pasaj) iletin.
   3. Tohum 75 ^cm2 doku kültürü şişeleri(ler) 7.5 x ¹⁰⁶ MDCK hücreli 30 mL steril 1x MEM içerir ve nemlendirilmiş% 5 _CO2 inkübatörde 37 ° C'de kuluçkaya yaslar.
2. Empedans izleme ekipmanının hazırlanması
   1. Cihazı 35 °C'de inkübatöre yerleştirin ve en az 2 saat ısınmasını kesin.
   2. İnkübatörün dışına yerleştirilen kontrol ünitesine bağlayın.
   3. Denemenin geri kalanına başlamadan önce üretici tarafından önerilen temizleme prosedürlerine geçin.
3. MDCK hücrelerinde İhA stoklarının üretimi
   1. H1N1 virüslerini yaymak ve yükseltmek için, iki adet 75 ^cm2 doku kültürü şişesi üzerinde tohum 7.5 x ¹⁰⁶ MDCK hücreleri ve %90–%100 izdihama ulaşmak için 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatır.
   2. Hücre kültürü ortamını hücre monolayerinden 75 ^cm2 şişelerde deklare edin. Hücreleri 5 mL steril 1x PBS ile yıkayın.
   3. PBS'yi çıkarın ve hücreleri tekrar yıkamak için 5 mL 1x PBS ekleyin.
   4. Tek katmana dikkatlice 15 mL virüs yayma ortamı (%0 FCS ile 1x MEM) eklemeden önce bir şişeyi kontrol olarak etiketleyin ve PBS'yi çıkarın. Bu şişeyi % 5 CO2 ile 35 °C'de tutulan bir inkübatörde kuluçkaya _yatır. 3 günlük yayılmadan sonra karşılaştırma için kullanın.
   5. RT'de bir şişe IAV stoğunu çözün. Virüsü, virüs yayılma ortamı (%0 FCS ile 1x MEM) içeren 1,5 mL'lik bir tüpte uygun konsantrasyona seyreltin.
   6. 75 ^cm2'lik şişeden 1x PBS çıkarın ve hücre monolayerine 1 mL seyreltilmiş virüs ekleyerek hücre başına (pfu/hücre) 1 x ^10-3 veya 1 x ^10-4 plak şekillendirme ünitelerinin çokluğunda MDCK hücrelerini enfekte edin.
   7. Adsorb virüsü, her 15 dakikada bir düzenli olarak şişeyi karıştırarak RT'de 45 dakika boyunca MDCK hücrelerine.
   8. Inoculumu yavaşça çıkarın ve 1 μg/mL TPCK-tripsin (trypsin/L-1-tosylamid-2-fenilenth) içeren şişe başına 15 mL virüs yayılma ortamı ekleyin epil klorometil keton), viral hemagglutinin HA0'ı HA1 ve HA2 alt bölümlerine (endosomal membran ve viral genomun salınımı ile HA füzyonu için gerekli olan bir olay)²².
   9. Virüsü çoğaltmak için şişeleri en az 3 gün boyunca 35 °C ve% 5 _CO2'de kuluçkaya yatırın.
   10. MDCK hücrelerini 40x büyütmede mikroskop altında gözlemleyin ve hücreler üzerinde sitopatik etkiler (CPE) arayın (hücre kontrol şişesi ile karşılaştırarak). CPE tamamlanmamışsa (yani, hücrelerin yaklaşık% 80'i alt tabakadan ayrılmışsa), şişeleri ek 24 saat boyunca inkübatöre geri koyun.
   11. CPE tamamlandığında, hücre kültürünün üstnatantını ve santrifüjü 300 x g'da 10 dakika boyunca hücresel kalıntıları saçmak için dekantlayın.
   12. Netleştirilmiş süpernatantı 15 mL'lik bir tüpe ve aliquot soy virüslerini tek kullanımlık steril kriyojenik şişelere aktarın. Virüsleri dondurmak ve stoklamak için kriyotütleri hemen -80 °C'ye yerleştirin.

2. Hücreleri enfekte etmek için uygun hücre miktarının belirlenmesi

NOT: Tüm deneyler sırasında plakaları ambalajdan kağıt sargıları gibi elektrostatik olmayan yüzeylerde her zaman saklayın. Elektronik mikroter plakasında (E-Plaka olarak tasarlanmış) tohumlanacak hücrelerin en uygun konsantrasyonunun belirlenmesi için aşağıdaki bölüm 2'yi izleyin.

1. Deneyden ²⁴ saat önce taze bölünmüş hücreler (yaklaşık% 80 izdiham) elde etmek için MDCK hücrelerini 75 cm2 şişeler halinde hazırlayın.
2. Hücreleri 5 mL 1x PBS ile yıkayın ve %0,25 Trypsin-EDTA çözeltisinin 3 mL'sini ekleyerek ayırın.
3. 7 mL taze hücre kültürü ortamı ekleyin ve trypan mavi boyama ile otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
4. Hücre kültür ortamıyla hücre konsantrasyonu 400.000 hücre/mL'ye ayarlayın. 200.000 hücre yoğunluğu elde etmek için ek tüplerde iki kat seri seyreltmeler gerçekleştirin; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; ve 6.250 hücre/mL. Hücrelerin seyreltme aralığını hücre tipine ve büyüme davranışlarına göre ayarlayın.
5. E plakasını (Malzeme Masası) RT'de birkaç dakika bekletin ve çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyuya 100 μL hücre kültürü ortamı ekleyin. E-Plakanın elektrotlarına dokunmayın.
6. Beşiklerin kilidini açın ve plakanın ön ucunun empedans ölçüm cihazının (Malzeme Masası) beşik cebine yerleştirin. Kuluçka makinesinin kapısını kapatın.
7. Yazılımı açın.
   1. "Varsayılan deneme deseni kurulumu"nda, seçili beşiği seçin ve üst sayfayı çift tıklatın, sonra denemenin adını girin. "Düzen" i tıklayın ve plakanın seçilen her kuyusu için gerekli örnek bilgileri girin; ardından, bittiğinde "Uygula" yı tıklayın. "Zamanlama" | tıklayın "Adımlar" | "Bir adım ekle". Yazılım, arka plan empedansını (CI) ölçmek için otomatik olarak 1 sn'lik bir adım ekler.
   2. "Yürüt" sekmesindeki "Başlat/Devam Et"e tıklayın. "Çiz"e tıklayın, uygun kuyuları seçerek tüm örnekleri ekleyin ve bir sonraki adıma geçmeden önce CI'nin -0.1 ile 0.1 arasında olduğundan emin olun.
8. Plakayı beşikten çıkarın.
9. Her hücre süspansiyonunun 100 μL'sini 2.4 adımdan uygun kuyulara ve kontrol olarak kullanılan kuyularda 100 μL hücre ortamına ekleyin. Kuyuların altındaki hücrelerin düzgün dağılımını sağlamak için E plakasını RT'de 30 dakika boyunca laminar akış başlığında bırakın.
10. E plakasını beşik cebine yerleştirin. "Zamanlama" | tıklayın Yazılıma "adım ekle" ve 200 tekrar için her 30 dakikada bir hücreleri izlemek için değerler girin. Ardından, "Başlat/Devam Et"i seçin.
11. Yazılımdaki "Çiz" düğmesine tıklayarak CI verilerini kontrol edin ve çizin. Viral enfeksiyon sırasında hala büyüyen bir aşamada olan hücreleri elde etmek için plakada tohumlamadan hemen önce sabit faz 24 h olan hücrelerin konsantrasyonunu seçin. Sabit faz, CI maksimum olduğunda ulaşılır.

3. _CIT50 değerleri ile enfeksiyonun çokluğu arasındaki korelasyon

1. E plakasının her kuyusuna 100 μL steril 1x MEM kültür ortamı ekleyin. E plakasını cihazın beşik cebine 35 °C'de yerleştirin. 2.7. adımda açıklandığı gibi arka planı ölçün.
2. E plakasını beşikten çıkarın.
3. Elektronik mikrotiter plakanın her kuyusunda taze bölünmüş MDCK hücrelerinin tohum 3 x ^104'ü ve 35 °C'de 24 saat boyunca % 5 _CO2 ile büyütür, böylece IAV enfeksiyonu sırasında çoğaltıcı bir fazdadırlar.
4. Aşağıdaki adımları izleyerek tekrarlanabilirlik için ters pipetleme kullanarak, _H1N1 virüsünün bilinen 6 kütüğü10 TCID50 / mL titresinin farklı ₁₀ kat seyreltmeleri ile MDCK hücrelerini enfekte edin:
   1. MDCK hücrelerini 2x ile 100 μL MEM ile FCS (virüs yayılma ortamı) olmadan durulayın. Inoculumun daha fazla seyreltilmesini önlemek için ikinci yıkamadan sonra tüm ortamları çıkardığına dikkat edin.
   2. Tek kanallı pipet kullanarak her kuyuya 100 μL viral süspansiyon ekleyin. Kirlenmeyi önlemek için, kalan kuyuları kapakla kaplarken, plakada soldan sağa ve sonra yukarıdan aşağıya doğru başlayarak devam edin.
   3. Plakayı cihazın beşik cebine 35 °C'de yerleştirin. Potansiyel olarak kirlenmelere yol açabilecek ani hareketlerden kaçınmak için nazik olun.
   4. 2.10. adımda açıklandığı gibi en az 100 saat boyunca her 15 dakikada bir hücre empedansını izlemeye başlayın.
   5. İki ölçüm döngüsünden sonra (yani 30 dk), "Yürüt" sekmesindeki "Duraklat" ı tıklayarak cihazı duraklatın ve E plakasını beşikten çıkarın.
   6. Viral hemagglutinin'i cleave etmek için virüs yayılma ortamına 1 μg / mL TPCK-trypsin ekleyin.
   7. Her kuyuya TPCK-tripsin içeren 100 μL virüs yayma ortamı ekleyin ve E plakasını beşik cebine yerleştirin.
   8. "Yürüt" sekmesinde "Başlat/Devam Et"i tıklatın.
      NOT: Viral süspansiyonu virüs yayılma ortamı ile değiştirerek sahte enfekte hücrelere karşılık gelen negatif bir kontrol oluşturmayı unutmayın.

4. IAV hayatta kalma kinetiği

1. IAV'yi 35 °C'de tuzlu damıtılmış suya maruz bırak ve hücre empedansı azalmasını ölçerek zaman içinde enfeksiyelliklerini test edin.
   1. Damıtılmış suda 35 g/L'lik son konsantrasyona NaCl ekleyerek tuzlu damıtılmış su hazırlayın. 2 mL kriyotüslere 900 μL tuzlu su ekleyin.
   2. Tuzlu suya 100 μL viral stok ekleyin ve kriyotüpleri 1 saat, 24 saat veya 48 saat boyunca bir inkübatöre (35 °C, % 5 _CO2) yerleştirin.
   3. 16 kuyu mikrotiter plakası üzerinde taze bölünmüş MDCK hücrelerinin 100 μL 'si (3 x ¹⁰⁴ içerir) ve 37 °C'de 24 saat ve% 5 _CO2'de büyür.
   4. Bölüm 3.4'i tekrarlayarak tekrarlanabilirlik için ters pipetleme yöntemi kullanarak hücrelere 100 μL maruz kalan virüs (daha önce kültür ortamlarında 10x seyreltilmiş) bulaştırın.
2. Hücre empedansı her 15 dakikada bir en az 100 saat boyunca izleyin.

5. Enfeksiyellik kaybının değerlendirilmesi

1. CIT50 değeri ile virüs kaynaklı sitopatik etkilere bağlı CI düşüşünü ölçmek için _CIT50 değerlerinin belirlenmesi.
   1. "Çiz" i tıklayın ve "Tümünü ekle" yi tıklayarak tüm örnekleri ekleyin. "Deneme Bilgilerini Dışa Aktar"a tıklayarak sonuçları bir elektronik tabloya dışa aktarma. İlk CI'yı, maruz kalan virüsler tarafından hücre enfeksiyonundan sonra 5 saat (yani, mikrotiter E plakasındaki MDCK hücrelerinin tohumlandıktan sonra 24 saat) ölçülen hücresel empedans değeri olarak düşünün.
   2. İlk CI'dan %_50'lik bir düşüşü ölçmek için gerekli zamana karşılık gelen CIT50 değerini hesaplayın. _CIT50 değerini hesaplamak için, her örnek için 5 hpi olan CI değerini not edin. Ardından, elektronik tablodaki dizin ve eşleştirme işlevlerini kullanarak CI değerinin yarısına eşit olduğu zaman noktasını 5 hpi'de bulun.
2. Ortalama inaktivasyon eğiminin hesaplanması
   1. Maruz kalan her viral süspansiyon için farklı maruz kalma sürelerinde (gün olarak) _CIT50 değerlerini belirleyin.
   2. _CIT50 çizilmiş değerlerden, inaktivasyon eğimi olarak adlandırılan ve _CIT50.day-1 ile ifade edilen doğrusal bir regresyon eğimi hesaplayın.

Kuyu başına 15.000 ila 120.000 hücre arasında farklı konsantrasyonlarda MDCK hücreleri ile 120 saat sonra elde edilen ham veriler Şekil 1'de gösterilmiştir. 24 saat sonra, CI önlemleri, 30.000 hücre ile tohumlanan kuyulardaki hücrelerin hala büyümenin üstel aşamasında olduğunu ve bu hücre konsantrasyonunun daha fazla deney için kullanıldığını göstermektedir. Şekil 2 , CIT50 değerleri ile enfeksiyonun ilk çokluğu arasındaki doğrusal korelasyonu göstermektedir. MDCK hücreleri 24 saat boyunca kültürlenir, daha sonra farklı bir enfeksiyon çokluğunda A / Paris / 2590 / 2009 H1N1 viral suşu ile enfekte edilir. İlk CI enfeksiyondan sonra 5 saat ölçülür.

Şekil 3 , deneylerimizde kullanılan deneysel prosedürü göstermektedir (panel A). Virüs kaynaklı sitopatik etkiye bağlı CI azalmasını gösteren tipik sonuçlar B panelinde gösterilmiştir. Bunlar yazılım tarafından işlendikten sonra elde edilen ham verilerdir. CIT50 değerleri, veriler verildikten sonra elektronik tablo kullanılarak hesaplanmıştır. CIT50 değerlerinin farklı zaman noktalarında hesaplanmasından sonra, doğrusal regresyon analizi eğimin belirlenmesine izin verir (Panel C). Viral inaktivasyon eğimleri böylece her durumda her virüs için elde edildi, daha sonra çalışılan ortamda en büyük stabiliteye sahip virüsleri tanımlamak için karşılaştırıldı.

Şekil 4'te A/WSN/1933 H1N1 virüs suşuna ait genetik omurga taşıyan IAV rekombinant virüslerinin inaktivasyon eğimleri ve A/Yeni Kaledonya/20/1999 H1N1 virüsünden (HA-NA/NC99) bir HA ve NA olduğu gösterilmiştir. HA'daki eşanlamlı olmayan mutasyonlar, salin suyunda konak dışında virüs parçacığı kalıcılığı üzerindeki etkiyi incelemek için tanıtıldı.

Üç taraflı olarak yapılan farklı deneylerden ortalama inaktivasyon eğimlerini karşılaştırarak, HA'da konak dışındaki viral kalıcılığı etkilemek için yeterli olan amino asitleri tanımlayabildik. İnaktivasyon eğimi ne kadar düşükse, virüs o kadar kararlıdır. Örnek olarak, HA-NA/NC99 virüsünün HA/F453Y ikamesi veya HA::K147 eklemesi, ortalama inaktivasyon eğiminde 9,8 CIT50/gün ve 9,9 CIT50/gün'e önemli bir artışa neden oldu, sırasıyla, vahşi tip HA ile karşılaştırıldığında (ortalama inaktivasyon eğimi 4.85 CIT50 / gün), böylece çok kararsız mutantlar üretir. Buna karşılık, HA/T327A ikamesi tuzlu suda 35 °C'de viral stabiliteyi etkilemedi (ortalama inaktivasyon eğimi 6.6 CIT50/gün). Bu nedenle metodoloji, HA glikoproteinde konak dışında IAV sağkalımında yer alan amino-asit kalıntılarını tanımlayacak kadar güçlüydü.

Şekil 1: Mikroter E plakada hücre titrasyonu.
MDCK hücrelerinin seri seyreltmeleri mikrotiter E plakalarında tohumlandı ve hücre büyümesi 100 saate kadar izlendi (her 30 dakikada bir 200 süpürme). Gri noktalar, yinelenen olarak ölçülen CI'nin standart sapmalarını temsil eder. 24 saatteki dikey çizgi, açıklanan koşullarda, 3 x 104 hücrenin / kuyunun ilk tohumlanması, enfeksiyon sırasında yaklaşık% 70 izdiah kültürüne izin verdiğini vurgulamaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CIT50 değerleri ile enfeksiyonun ilk çokluğu arasında doğrusal gerileme.
Her nokta, farklı enfeksiyon çokluğuna sahip hücrelerin enfeksiyonu için hesaplanan CIT50 değerini gösterir. Düz çizgi doğrusal regresyon eğimini (R2

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.