Yöntem makalesi

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

2.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61146

⸱

13 Mayıs 2020

 ,  , 
1Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France

Bu makalede

Özet

Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.

Özet

Proteobakterilerden lipoproteinler, üç integral membran enziminin etkisiyle membran fosfolipitlerinden türetilen yağ asitleri tarafından posttranslasyonel olarak modifiye edilir ve triasile proteinlerle sonuçlanır. Lipoprotein modifikasyon yolundaki ilk adım, bir diasilgliseril grubunun fosfatidilgliserolden prolipoproteine transferini içerir ve bu da diasilgliseril prolipoprotein ile sonuçlanır. İkinci adımda, prolipoproteinin sinyal peptidi bölünür ve bir fosfolipitten türetilen üçüncü bir yağ asidi tarafından modifiye edilen bir apolipoprotein oluşturulur. Bu son adım apolipoprotein N-asiltransferaz (Lnt) tarafından katalize edilir. Lipoprotein modifikasyon yolu, çoğu γ-proteobakteride esastır ve bu da onu yeni antibakteriyel ajanların gelişimi için potansiyel bir hedef haline getirir. Burada açıklanan, küçük inhibitör moleküllerin yüksek verimli taraması ile uyumlu olan Lnt için hassas bir testtir. Enzim ve substratlar membrana gömülü moleküllerdir; bu nedenle, in vitro bir testin geliştirilmesi kolay değildir. Bu, aktif enzimin deterjan varlığında saflaştırılmasını, alkin-fosfolipitlerin ve diasilgliseril peptid substratlarının mevcudiyetini ve karışık misellerdeki reaksiyon koşullarını içerir. Ayrıca, aktivite testini yüksek verimli bir tarama (HTS) kurulumunda kullanmak için, reaksiyon ürününün doğrudan okunması, birleştirilmiş enzimatik reaksiyonlara göre tercih edilir. Bu florometrik enzim testinde, alkin-triasile peptid ürünü, bir tıklama-kimya reaksiyonu yoluyla floresan haline getirilir ve çok kuyulu bir plaka formatında tespit edilir. Bu yöntem, fosfolipitler ve açil-CoA dahil olmak üzere yağ asidi içeren substratlar kullanan diğer asiltransferazlar için geçerlidir.

Giriş

Bakteriyel lipoproteinler, amino terminlerinde kovalent olarak bağlanmış yağ asitleri ile karakterize edilir ve bu asitler 1,2 membranlarına sabitlenir. Proteinin olgun kısmı yapı ve işlev bakımından oldukça çeşitlidir, böylece lipoproteinlerin bakteriyel hücre zarfındaki çeşitli biyolojik süreçlerdeki rolünü açıklar.

Lipoproteinler, sitoplazmik membrana yerleştirildikten sonra fosfolipid kaynaklı yağ asitleri tarafından modifiye edilir. Prolipoproteinler, asillenmiş hale gelen değişmez bir sistein kalıntısı ve olgun proteindeki ilk amino asit içeren bir imza motifi olan lipobox içerir. Bu yolun ilk adımı, diasilgliseril grubunu fosfatidilgliserolden prolipoproteine diyasilgliseril ve sistein arasındaki bir tiyoeter bağlantısı yoluyla prolipoproteine aktaran prolipoprotein fosfatidilgliserol::d iasilgliseril transferaz (Lgt) tarafından katalize edilir. Sinyal peptidaz II (Lsp), sinyal peptidini diasilgliseril prolipoproteinden ayırır ve diasilgliserl moiety yoluyla membrana demirlenen bir apolipoprotein ile sonuçlanır. Üçüncü ve son adım, fosfolipitin sn-1 pozisyonundan apolipoprotein üzerine bir yağ asidi ekleyen ve triasile olgun lipoprotein ile sonuçlanan apolipoprotein N-asiltransferaz (Lnt) tarafından katalize edilir (Şekil 1)3. Lnt reaksiyonu, kararlı bir tiyoester açil enzim ara ürününün oluştuğu iki aşamalı bir pinpon reaksiyonudur. Lizofosfolipid yan ürünü, reaksiyonun ikinci adımında apolipoprotein substratının asilasyonundan önce salınır.

Fosfolipid substrat özgüllüğü, yüksek oranda Tris-Trisin Üre SDS-PAGE4 üzerinde N-açil diasilgliseril peptidin hareketlilik kaymasına dayanan bir Lnt testinde belirlenir. Küçük polar kafa gruplarına sahip, doymuş [sn-1] ve doymamış [sn-2] fosfolipitler tercih edilen substratlar4'tür. Jel kayma testi, apolipoprotein N-asiltransferazın kapsamlı kinetik çalışmaları veya HTS'nin inhibitör molekülleri tanımlaması için uygun değildir. Alkinli yağ asitlerini kullanan tıklama kimyası, bakteri5'te lipoprotein modifikasyonunu ve ökaryotlarda yağ asidi metabolizmasını incelemek için başarıyla kullanılmıştır6. Son zamanlarda, inhibitörleri7 tanımlamak için Ras palmitoylasyonunun in vitro bir testinin bildirildiği bildirilmiştir.

Burada açıklanan yöntemde, deterjandaki saflaştırılmış aktif Lnt, daha sonra floresan spektrometrisi ile tespit edilen alkin-triasile peptid oluşturmak için karışık misellerdeki substratlarla inkübe edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Enzim ve substrat hazırlama

  1. Enzimin saflaştırılması
    1. Lnt enzimini daha önce tarif edildiği gibi deterjanda çözünür membranlardan üretin ve saflaştırın 4,8. Kısaca, Lnt-strep geninin ekspresyonunu indükleyin, Lnt'yi bir C-terminal Strep etiketi ile kodlayın, OD600'de 0.6'da 16 saat boyunca 37 ° C'de susuz tetrasiklin (200 ng / mL) ile.
    2. Hücreleri 10 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın.
    3. Hücre peletini tampon WA'da (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) mL başına 100 OD600 birime kadar yeniden askıya alın.
    4. Hücreleri, 10.000 psi'de bir Fransız basınçlı hücre presinden iki geçitle kırın.
    5. Kırılmamış hücreleri ve kalıntıları 20 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüjleme ile temizleyin. Süpernatantı saklayın ve peleti atın.
    6. Süpernatantı 60 dakika boyunca 120.000 x g'de santrifüj yapın ve membran veziküllerini (yarı saydam kahverengi renkli pelet) toplayın. Süper natantı atın.
    7. Membran peletinden integral membran proteinlerini, oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca tampon WA'da% 1 (w/v) n-Dodesil β-D-maltosid (DDM) ile çözündürün. Çözünmeyen malzemeyi 120.000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın ve çıkarın. Saflaştırma için süpernatant fraksiyonu kullanın.
    8. Lnt-strep'i Nozeret ve ark.8 tarafından açıklandığı gibi bir afinite kromatografisi sütununda (bkz. Malzeme Tablosu) ve bir S400 jel filtrasyon sütununda (bkz.
    9. Saflaştırılmış enzimi, -80 °C'de% 0.05 DDM ve% 10 gliserol içeren tampon WA'da saklayın.
      NOT: Enzim 5 yıldan fazla bir süredir stabildir.
  2. Alkin-fosfolipid ve biyotinile Fibroblast Uyarıcı Ligand (FSL-1-biotin) substratlarının hazırlanması
    1. Aliquot 100 μL özel sentezlenmiş alkin-POPE (1-hekzade-15-ynoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin, bakınız Malzeme Tablosu) kloroformda 1.5 mL tüplere çözünür.
    2. Tüpleri bir şırınga ile delin ve kloroformu RT'de 2 saat boyunca bir hız boşluğunda buharlaştırın. Kuru fosfolipit örneklerini -20 °C'de saklayın.
    3. Kullanmadan önce alkin-PAPE'yi 500 μM'de% 0.1 Triton X-100'de çözün. Gerekirse alkin-POPE'yi çözündürmek için RT'de ultrasonik su banyosuna 3 dakikalık bir sonikasyon adımı ekleyin.
    4. FSL-1-biyotin'i suda 445 μM'de yeniden askıya alın.
      NOT: Her iki çözelti de -20 °C'de en az 2 ay saklanabilir.

2. Tüp testi

NOT: 1. Günde, Lnt reaksiyonunu 1,5 mL tüplerde ayarlayın (adım 2.1) ve 96 kuyu plakasını streptavidin ile kaplayın (adım 2.2).

  1. Reaktif karışımının hazırlanması ve enzimatik reaksiyon
    1. Standart bir Lnt testi için, 1,5 mL tüplerde 18 μL'lik son hacimde alkin-POPE (500 μM stoktan son 50 μM) ve FSL-1-biyotin (445 μM stoktan 50 μM nihai konsantrasyon) Lnt reaksiyon tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, %1 BSA içeren %0.1 Triton X-100) karıştırın. Tüm koşulları üçlü olarak gerçekleştirin.
    2. Substrat karışımını (adım 2.1.1'de hazırlanan) ultrasonik bir su banyosunda 3 dakika boyunca sonikleştirin ve Lnt enziminin eklenmesinden önce 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin (adım 2.1.3).
      NOT: MTSES (sodyum (2-sülfonatoetil)metanetiosülfonat), tiol-spesifik bir reaktif, Lnt8'i inhibe eder. Negatif kontrol numuneleri olarak kullanılmak üzere reaksiyon tüplerine (adım 2.1.1) 10 mM MTSES (% 100 DMSO'da 100 mM stok çözeltisi) ekleyin. Lnt reaksiyon tamponunun ses seviyesini toplam hacim 18 μL olacak şekilde ayarlayın.
    3. Aktif (1 ng/μL, 17,2 nM'ye karşılık gelir) veya inaktif Lnt (C387S) (%0,05 DDM içeren tampon WA'da 10 ng/μL'lik 2 μL) ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetle indirerek substratlarla (adım 2.1.2) karıştırın.
    4. Isıtmalı kapaklı bir termomikserde 16 saat boyunca 37 ° C'de reaksiyonu inkübe edin.
  2. 96 kuyu plakasının Streptavidin kaplaması
    1. H2O'da 2 mg / mL'de bir streptavidin stok çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Bu çözelti -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
    2. Stok çözeltisinden, çalışma çözeltisi olarak suda 10 μg / mL streptavidin hazırlayın. 96 kuyucuk plakasının her bir kuyucuğuna 100 μL çözelti ekleyin. Kuyucukları havayla kurutmak için kapaksız olarak gece boyunca 37 °C'de inkübe ederek streptavidin'i plakaya bağlayın.

NOT: 2. Günde, tıklama kimyası (adım 2.3) gerçekleştirin, Lnt reaksiyon karışımını streptavidin kaplı plakalara bağlayın (adım 2.4) ve floresanı tespit edin ve sonuçları analiz edin (adım 2.5).

  1. Klik-kimya reaksiyonu
    1. Azido-FAM (DMSO'da 5 mM), TCEP (Tris (2-karboksiyetil) fosfin hidroklorür; suda hazırlanan 50 mM), TBTA (Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amin; tert-bütanolde 2 mM: DMSO (4: 1)) ve CuSO4∙5H2O (H2O'da taze hazırlanmış 50 mM) stok çözeltileri hazırlayın.
    2. Adım 2.1.4'te hazırlanan Lnt reaksiyon karışımını içeren 1,5 mL'lik tüplerde, reaktifleri aşağıdaki sırayla ekleyerek klik-kimyası gerçekleştirin: 0,2 μL stok Azido-FAM (nihai konsantrasyon 50 μM), 0,4 μL stok TCEP (nihai konsantrasyon 1 mM), 0,2 μL stok TBTA (nihai konsantrasyon 0,02 mM).
    3. Vorteks 5 s için çözüm. Daha sonra 0,4 μL stok CuSO4 (son konsantrasyon 1 mM) ekleyin. 5 s için tekrar vorteks. Örnekleri karanlıkta RT'de 1 saat boyunca inkübe edin.
  2. Lnt reaksiyon karışımının streptavidin kaplı plakalara bağlanması
    1. Streptavidin kaplı plakaların kuyucuklarını, 2.2.2 3x adımından bir gecede inkübasyondan sonra 200 μL PBS-T1 (% 0.05 Ara-20 içeren PBS) ile yıkayın.
      NOT: Streptavidin plakalar hemen kullanılabilir veya 4 °C'de kuru olarak saklanabilir.
    2. Klik-kimya karışımından 18 μL'yi adım 2.3.3'ten 96 kuyu streptavidin kaplı bir plakadaki bir kuyuya aktarın ve N-açil-FSL-1-biyotin-FAM ürününü streptavidin plakalarına bağlamak için 100 μL PBS-T1 ekleyin.
    3. Streptavidin bağlama ve floresan okuması için pozitif kontrol olarak biyotin-floresein (DMSO'daki 3.1 m'lik bir stoktan 0.26 μM) kullanın.
    4. RT'deki plakaları karanlıkta 1 saat boyunca bir termomikserde inkübe edin, 300 rpm'de sallayın.
    5. 96 kuyucuk plakasının manuel yıkama adımlarını çok kanallı elektronik pipetle aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 200 μL PBS-T2 ile altı yıkama (%1 Ara-20 içeren PBS), pipetle üç yıkama, 200 μL PBS ile üç yıkama, pipetle üç yıkama.
  3. Floresan algılama ve analizi
    1. 200 μL PBS ekleyin ve floresanı bir floresan mikroplaka okuyucusuna 520 nm'de kaydedin. Sonuçları e-tablo yazılımına kaydedin.
      NOT: Biotin-floresein, streptavidin bağlama ve 520 nm'de floresan tespiti için pozitif bir kontrol olarak kullanılır. 0.26 μM biyotin-floresein ile 30.000-40.000 A.U.'nun tekrarlanabilir bir okuması beklenmektedir. Tüm numuneler, kontroller de dahil olmak üzere üçlü olarak analiz edilir.
    2. İstatistiksel bir yazılım kullanarak eşleşmemiş t-testini kullanarak her reaksiyon için standart sapmayı ve negatif kontroller ve pozitif numuneler için P-değerlerini hesaplayın.

3. Çok kuyulu plaka testi

NOT: 1. Günde, Lnt reaksiyonunu 384 kuyu plakasında (adım 3.1) ayarlayın ve 384 kuyu plakasını streptavidin ile kaplayın (adım 3.2).

  1. Reaktif karışımının hazırlanması ve enzimatik reaksiyon
    NOT: Reaktiflerin ve enzimin miktarı, tüp testine kıyasla azaltılır ve Lnt reaksiyonu doğrudan 384 kuyu plakasında gerçekleştirilir. Bu, daha az malzeme kullanılmasına ve daha da otomatikleştirilebilecek adımların azaltılmasına izin verir.
    1. Substratları aşağıdaki gibi karıştırın: alkin-POPE (500 μM stoktan son konsantrasyon 50 μM) ve FSL-1-biyotin (500 μM stoktan son 50 μM) Lnt reaksiyon tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl,% 1 BSA içeren% 0.1 Triton X-100) 384 kuyu plakası formatında kuyu başına reaksiyon başına 13.5 μL hacimde. Tüm koşulları üçlü olarak gerçekleştirin. Gerçekleştirilecek reaksiyon sayısı için gereken toplam reaktif miktarını hesaplayın (yani, bir 384 kuyu plakası için 5.184 μL).
    2. Substrat karışımını ultrasonik bir su banyosunda 3 dakika boyunca sonikleştirin.
    3. 384 kuyucuklu bir plakada kuyu başına substrat karışımının Aliquot 13.5 μL'si.
      NOT: Negatif kontrol olarak, kuyu başına 10 mM MTSES (%100 DMSO'da 625 mM stok çözeltisi) eklenebilir. 13,5 μL'lik bir nihai reaksiyon hacmine ulaşmak için Lnt tamponunun ses seviyesini (adım 3.1.1) ayarlayın.
    4. Lnt enziminin eklenmesinden önce 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin (adım 3.1.5).
    5. 3.1.3. adımdan itibaren reaksiyon karışımını içeren her bir kuyucuğa Lnt reaksiyon tamponuna (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, %0.1 Triton X-100, %1 BSA) 0,5 ng/μL (8,6 nM'ye karşılık gelen) aktif Lnt enzimi veya inaktif varyant (C387S) (% 0,05 DDM içeren tampon WA'daki 5 ng/μL stoktan 1,5 μL) ekleyin. Reaktifleri yukarı ve aşağı pipetle indirerek karıştırın. Toplam reaksiyon hacmi 15 μL'dir.
    6. Çok kuyulu plakalar için plakayı plastik folyo ile kapatın.
    7. Isıtmalı kapaklı bir termomikserde 16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. Streptavidin kaplama 384 kuyu plakaları
    1. 384 kuyu plakasının kuyularını kaplamak için 2.2.2 adımından itibaren 75 μL streptavidin (H 2 O'da 10 μg / mL) kullanın. Streptavidin, kuyucukları havayla kurutmak için kapaksız olarak gece boyunca 37 ° C'de inkübe ederek plakaya bağlanmasına izin verin.

NOT: 2. Günde, tıklama kimyası (adım 3.3) gerçekleştirin, Lnt reaksiyon karışımını streptavidin kaplı plakalara bağlayın (adım 3.4), floresanı tespit edin ve sonuçları analiz edin (adım 3.5).

  1. Klik-kimya reaksiyonu
    1. Azido-FAM (DMSO'da 1.2 mM), TCEP (tris (2-karboksiyetil) fosfin hidroklorür; H 2 O'da hazırlanan 24 mM), TBTA (Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amin; tert-bütanolde 0.48 mMM: DMSO (4: 1)) ve CuSO4∙5H 2 O(H2O'da taze hazırlanmış24mM) stok çözeltilerini hazırlayın.
    2. Üç klik-kimya reaktifini birleştirin: Azido-FAM (son konsantrasyon 50 μM), TCEP (1 mM final) ve TBTA (0.02 mM final) karışımı, her biri kuyucuk başına 2.25 μL'lik son hacimde 0.75 μL'de. 384 kuyu plakası başına gerekli hacmi hesaplayın (yani, 384 kuyu plakasının tüm kuyuları kullanıldığında 864 μL kullanın). Kuvvetlice karıştırın.
    3. 3.1.7 adımından itibaren 384 kuyu plakasındaki tamamlanmış Lnt reaksiyonuna kuyu başına 2,25 μL reaktif çözeltisi ekleyin.
    4. Çok kanallı elektronik pipetle yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek karıştırın.
    5. CuSO4 (1 mM nihai konsantrasyon için 24 mM stoktan 0,75 μL) ekleyin ve çok kanallı elektronik pipetle yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek karıştırın.
    6. RT'de karanlıkta 1 saat boyunca inkübe edin.
  2. Lnt reaksiyon karışımının streptavidin kaplı 384 kuyu plakalarına bağlanması
    1. Streptavidin kaplı plakaların kuyularını, 3.2.1 1x adımından 85 μL PBS-T1 ile gece boyunca inkübasyondan sonra yıkayın.
    2. N-asil-FSL-1-biotin-FAM ürününü streptavidin plakalarına bağlamak için inkübasyon plakasının her bir kuyucuğundan 3.3.6 adımından streptavidin kaplı plakaya adım 3.4.1'den 11 μL klip-kimya reaksiyonunun 11 μL'sini aktarın.
    3. 64 μL PBS-T1 arabellek ekleyin.
    4. Streptavidin kaplı kuyucuklara bağlanma kontrolü olarak biyotin-floresein (DMSO'daki 3,1 m'lik bir stoktan 0,19 μM) ekleyin.
    5. RT'deki 384 kuyu plakasını karanlıkta 1 saat boyunca bir termomikserde 300 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
    6. Otomatik bir plaka yıkayıcı kullanarak plakaları aşağıdaki gibi yıkayın: 85 μL PBS-T2 ile 10 yıkama, plakalar yıkamalar arasında çalkalanır; 85 μL PBS ile 5 yıkama, plakalar yıkamalar arasında çalkalanır.
  3. Floresan algılama ve analizi
    1. PBS (85 μL) ekleyin ve floresan mikroplaka okuyucusuna 535 nm'de floresan kaydedin.
    2. Verileri açıklandığı gibi analiz edin (adım 2.5.2).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Lnt reaksiyonunda, fosfolipitlerden gelen sn-1 yağ asidi bir diasilgliseril peptid üzerine aktarılır ve olgun triasile peptid8 ile sonuçlanır. Burada tarif edilen in vitro Lnt testi, substrat olarak bir alkin yağ asidi (alkin-POPE) ve FSL-1-biyotin içeren fosfolipitleri kullanmak üzere tasarlanmıştır ve bu da alkin-FSL-1-biyotin oluşumuna neden olur. Azido-FAM ile bir tıklama-kimya reaksiyonu üzerine, bu ürün floresan olarak etiketlenmeli ve floresan spektrometri ile tespit edilmelidir (<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Triasillenmiş ürünün floresan tespitine dayanan burada açıklanan Lnt testi protokolü hassas ve tekrarlanabilirdir. Biotin'in streptavidin'e spesifik ve verimli bağlanması, tahlilde kilit bir unsurdur. Lnt reaksiyonunun tamamlanmasından sonra bırakılan alkin-POPE substratı da FAM ile floresan olarak etiketlenir, ancak streptavidin plakalarına çoklu yıkama adımlarıyla bağlandıktan sonra verimli bir şekilde çıkarılır. Ayrıca, DMSO'nun eklenmesi Lnt aktivitesini etkilemez ve tahlil üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Hem substrat...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Kemogenomik ve Biyolojik Tarama Platformu'ndan Fabrice Agou ve Alix Boucharlat'a, Institut Pasteur Paris'teki Teknolojik Kaynaklar ve Araştırma Merkezi'ne (C2RT) protokol hakkında yararlı öneriler için, BGPB Birimi'nin tüm üyelerine destek ve bilimsel tartışmalar için ve Simon Legood'a makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Çalışma, Carnot Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve Carnot Mikropları ve Sağlığı Enstitüsü'nün Küresel Bakım Girişimleri (15 CARN 0017-01 ve 16 CARN 0023-01) tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ä kta Arıtıcı FPLC sistemiGE HealthcareNASaflık: NA
Lnt arıtma
alkin-POPEAvanti Polar Lipidler900414PSaflık: >99%
Lnt substrat
Azido-FAMLumiprobeA4130Saflık: % 100 (saf) < br / > Reaktifi tıklayın
BioPhotometer PlusEppendorfN/ASaflık: NA
OD 600 nm
BioTek ELX 405 Plaka yıkayıcıseçin BioTekN° serie 115800, n° malzeme 405 Saflık Seçin: NA
Yıkama adımları
biotin-floreseinSigma53608Saflık: ≥ % 90 < br / > Floresan kontrolü
Bakır (II) sülfat pentahidratSigmaC3036Saflık: ≥ %98
Tıklama reaktifi
DDMAnatraceD310ASaflık: ≥ %99 β+&alfa;; < %15 &alfa;
Lnt saflaştırma için deterjan
Dimetilsülfoksit (DMSO)InvitrogenD12435Saflık: susuz
Solbilizasyon Tıklama reaktifi
Elektronik pipet Voyager 8 kanal 0,5-12,5 uLINTEGRA4721Saflık: NA
Reaktiflerin taşınması
Fransız Basınç HücresiN/AN/A Saflık: NA
Hücre bozulması
FSL-1-biotinEMC mikro koleksiyonlarıL7030Saflık: NA
Lnt substrat
Greiner Bio-One 384 kuyulu standart CELLSTAR polistiren mikroplakaGreiner781091Saflık: NA
Şeffaf alt ile siyah (yukarı veya alt okuma)
Greiner Bio-One 96 kuyulu steril polistiren plaka, yüksek bağlayıcılıkGreiner655097Saflık: NA
Şeffaf alt kısımlı siyah (yukarı veya alt okuma)
Mikroplaka okuyucu Sonsuz M1000 proTecanN/ASaflık: NA
Floresan algılama
MTSES (sodyum (2-sülfonaetil)metanetiosülfonat)AnatraceS110MTSaflık: ~% 100 < br / > Tiyol spesifik inhibitör
Optik Olarak Şeffaf Yapışkan Conta LevhalarıThermo ScientificAB-1170Saflık: NA
Çok kuyulu plakayı kapatmak için folyo
Sephacryl S400 HR 16/60 jel filtrasyon kolonuGE HealthcareGE28-9356-04Saflık: NA
Lnt saflaştırma
StrepTactin Sepharose 50 %IBABiyoteknoloji2-1201-010Saflık: NA
Lnt arıtma
streptavidinSigmaS4762-1MGSaflık: ≥ 13 birim / mg protein
Biyotin bağlayıcı
TBTA (tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil] aminSigma678937Saflık: %97
Tıklama reaktifi
TCEP (tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorürSigma75259Saflık: ≥ %98
Tıklama reaktifi
TECAN Infinite F500TecanN/ASaflık: NA
Floresan algılama
TECAN Infinite M1000 proTecanN/ASaflık: NA
Floresan algılama
Thermomixer CEppendorf5382000015Saflık: NA
Isıtmalı kapak
Triton X-100Sigma93443Saflık: H2O
içinde %10 Lnt reaksiyon tamponu
Ultra santrifüjBeckman LCN/ASaflık: NA
Hücre fraksiyonasyonu

Kaynaklar

  1. Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
  2. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
  4. Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
  5. Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
  6. Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
  7. Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147(2017).
  8. Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978(2019).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  10. Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198(2016).
  11. Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
  12. Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952(2017).
  13. Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
  14. Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

T k Kimyas AnaliziFlorometrik Enzim AnaliziAlkin Fosfolipid SubstratlarStreptavidin Kapl PlakalarAzido FAM Saptamaok Kuyucuklu Plaka FormatMembran Proteini PurifikasyonuZ Prime Fakt r

İlgili makaleler