Yöntem makalesi

Fillosferde ve Bitkisel Fermantasyonda Mikrobiyom Montajı Nın İncelenmesi için Gnotobiyotik Sistem

DOI:

10.3791/61149

⸱

3 Haziran 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Tufts University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikropsuz Napa lahanaları yetiştirme yöntemi, araştırmacıların tek mikrobiyal türlerin veya çok türlü mikrobiyal toplulukların lahana yaprağı yüzeylerinde nasıl etkileşimde bulunduklarını değerlendirmelerini sağlar. Steril bir sebze özü de sebze fermantasyon sırasında toplum kompozisyon vardiya ölçmek için kullanılabilir sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Filosfer, mikroplar tarafından kolonize edilebilir bitkinin zemin üstü kısmı, mikrobiyal topluluk montaj süreçlerini belirlemek için yararlı bir model sistemidir. Bu protokol, Napa lahana bitkilerinin fillosferindeki mikrobiyal topluluk dinamiklerini incelemek için bir sistem özetlemektedir. Bu bir kireçlenmiş kil ve besin suyu substrat ile test tüpleri mikropsuz bitkiler büyümek için nasıl açıklar. Mikrobuzsuz bitkilerin belirli mikrobiyal kültürlerle aşılanması, fillosferdeki mikrobiyal büyümeyi ve toplum dinamiklerini ölçmek için fırsatlar sağlar. Fermantasyon sırasında oluşan mikrobiyal topluluklarda lahanalardan üretilen steril sebze ekstresinin kullanımı da değerlendirilebilir. Bu sistem nispeten basit ve ucuz laboratuvarda kurmak ve mikrobiyal topluluk montaj önemli ekolojik sorulara hitap etmek için kullanılabilir. Ayrıca, fillosfer topluluk bileşiminin mikrobiyal çeşitliliği ve sebze fermantasyonlarının kalitesini nasıl etkileyip etkilebildiğini anlamak için fırsatlar sunar. Gnotobiyotik lahana fillosfer topluluklarının geliştirilmesi için bu yaklaşım diğer yabani ve tarımsal bitki türlerine uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fillosferin mikrobiyal çeşitliliği bitki sağlığının korunmasında önemli bir rol oynar ve aynı zamanda bitkilerin çevreselstresedayanma yeteneğini etkileyebilir 1,2,3,4,5. Buna karşılık, bitkilerin sağlığı doğrudan gıda güvenliği ve kalite6,7etkiler. Bitkiler ekosistem işleyişinde rol oynar lar ve bunlara bağlı mikrobiyomlar hem bitkilerin bu faaliyetleri yürütme yeteneğini etkiler hem de çevreyi doğrudan etkiler8. Bilim adamları phyllosphere fonksiyonu ve bileşimi deşifre etmeye başlamış olsa da, fillosfer mikrobiyal topluluk montaj etkileyen ekolojik süreçler tam olarak anlaşılamamıştır9,10. Fillosfer mikrobiyomu mikrobiyom11ekolojisini incelemek için mükemmel bir11deneysel sistemdir. Bu topluluklar nispeten basit ve topluluk üyelerinin çoğu standart laboratuvar medya10,12,,13yetiştirilebilir.

Fermente sebzeler, fillosferin toplum yapısının önemli sonuçları olduğu bir sistemdir. Hem lahana turşusu hem de kimchi'de, doğal olarak sebze yapraklarında (Brassica türlerinin fillosferi) oluşan mikroplar fermantasyon için inokül olarak hizmet vermektedir14,15. Laktik asit bakterileri (LAB) bitkisel mikrobiyomların her yerde üyeleri olarak kabul edilir, ancak onlar fillosfer de düşük bolluk olabilir16. Fermantasyon sırasında güçlü abiyotik seçimi, laktik asit bakterilerinin bolluğa artmasına olanak sağlayan mikrobiyal topluluk bileşiminde bir kaymaya yol açtır. LAB büyüdükçe, fermente bitkisel ürünlerin asidik ortamı nı oluşturan laktik asit üretirler17. Fillosfer ve fermantasyon arasındaki bağlantı mikrobiyomların nasıl yapılandırDığını anlamak için sebzeleri bir model olarak kullanma fırsatı sağlar.

Biz mikrop içermeyen Napa lahana büyümek ve sprey şişeleri kullanarak belirli mikrobiyal topluluklar ile aşılamak için yöntemler geliştirdik. Bu eşit ya bireysel mikroplar veya karışık topluluklar ile lahana aşılama ucuz ve güvenilir bir yöntemdir. Bir steril sebze özü (SVE) da üç farklı lahana türleri / çeşitleri geliştirilmiştir: kırmızı ve yeşil lahana(Brassica oleracea) ve Napa lahana(B. rapa). Bu SV'lere tuz ilavesi fermantasyon ortamını kopyalar ve fermantasyon mikrobiyom montajının küçük ölçekli ve nispeten yüksek iş lenmeli deneysel çalışmalarına olanak sağlar. Bu yöntemler, fillosferdeki mikrobiyal topluluk montajını ve fillosferdeki mikrobiyal topluluk dinamiğinin bitkisel fermantasyonun başarısıyla nasıl bağlantılı olabileceğini incelemek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Büyüyen mikropsuz lahanalar

  1. Mikropsuz lahana yetiştirmek için ekipman hazırlama
    1. İnce toz partiküllerini gidermek için kireçlenmiş kilin temizlenmesi
      1. Çalsamalı kil(Malzeme Tablosu)en az 3x musluk suyu ile durulayın; suyu boşaltın.
        DİkKAT: Kireçlenmiş kil çok ince toz üretir ve yıkanırken koruyucu bir maske(Malzeme Tablosu)takmaları tavsiye edilir.
      2. Sterilize etmek için ince bir tabaka (~4 cm) halinde ince bir tabaka halinde kalsinlenmiş kil ve kuru bir çevrim (20 dk için 121 °C ısıtma ve 20 dk kurutma süresi) otoklav içine yayın.
      3. Kalsinlenmiş kilin tepsilere yayılarak ve en az bir hafta sıcak bir kuluçka makinesine (30−37 °C) yerleştirerek kullanımdan önce tamamen kurumasını bekleyin. Bu Murashige ve Skoog (MS) besin suyu (bölüm 1.2) eşit miktarda absorbe edecek şekilde tamamen kireçlenmiş kil kurutmak için her 3 günde bir karıştırın.
        NOT: Kurutma aynı zamanda tüpler halinde tartılır bile kireçlenmiş kil hacmi tutmaya yardımcı olur. Kurutma fırını gibi diğer yollarla kurutma da uygun olacaktır.
    2. Mikropsuz lahana yetiştirmek için cam eşya nın temizlenmesi
      1. Her kullanım arasındaki cam tüpleri(Malzeme Tablosu)iyice temizleyin ve sterilize edin. Tüpleri %30 çamaşır suyu çözeltisinde 30 dakika bekletin ve bakteriyoloji ortamında asit yıkamadan önce musluk suyuyla iyice durulayın. Asit-yıkama iki yönlü test tüpü kapakları(Tablo Malzemeler)arasında kullanır.
    3. Yüzey sterilize lahana tohumu
      1. 100 napa lahana(B. rapa var pekinensis)tohumlarını 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
        NOT: Bir mikrosantrifüj tüpüne 100'den fazla tohum eklenmesi veya tüpün boyutunun değiştirilmesi, tohum kat kaldırma eksikliği nedeniyle tohumların çimlenme oranlarını etkileyebilir.
      2. Tohumlara %70 etanol ekleyin ve 5 dk. Bir pipet kullanarak etanol atın.
      3. 5 dk için %50 çamaşır suyu ve girdap 1 mL ekleyin.
      4. 5 dk. Deiyonize su bir pipet kullanarak atın için otoklavlı deiyonize su ve girdap 1 mL ekleyin.
      5. Tüm çamaşır suyunu durulamak için adım 1.1.3.4 3x tekrarlayın. Tohumları, tohum katını yumuşatmak için dikimden önce 2−8 saat steril deiyonize suda bekletin.
  2. Büyüyen mikropsuz lahanalar
    NOT: Napa lahanaları(B. rapa var pekinensis)Murashige ve Skoog (MS) besin suyunda ıslatılmış kireçlenmiş kil içeren cam tüplerde (15 cm x 2,5 cm) yetiştirilir.
    1. Temiz bir cam tüp (15 cm x 2,5 cm) içine temiz kalsinli kil 10 g tartın.
    2. Deiyonize suyun 1 L'sinde 4,4 g MS ortamını eriterek MS besin suyunu hazırlayın. Bir pipet kullanarak kireçlenmiş kil kapsayacak şekilde her cam tüp ms besin suyu (~ 9 mL) ekleyin.
      NOT: Tüpte duran sıvı, tohumun çimlenmesini önleyecektir, bu nedenle bazı tüplere biraz daha az MS suyu eklemek gerekebilir.
    3. 22 mm iki yönlü test tüpü kapakları ve otoklav (60 dk için 121 °C) ile gevşek kapaklı cam tüpler. Otoklavonları çıkarırken, onları mühürlemek için cam tüpler üzerine kapaklar itin. Kullanmadan önce oda sıcaklığına kadar tüpleri soğutun.
    4. Steril, ekstra uzun (25,4 cm) forceps kullanarak her tüpün ortasına bir steril lahana tohumu yavaşça yerleştirin. Tüpleri 7 yönlü bir tepsiye yerleştirin ve 24 °C'de 16 saatlik ışık döngüsüyle hafif rafların (tam spektrumlu T5 floresan ampuller veya bitki büyümesi için diğer aydınlatma kurulumu) altına yerleştirin.
      NOT: Tohumlar bir gecede çimlenir ve 5 gün sonra ilk gerçek yapraklarını geliştirirler. Gerçek bir yaprak, cotyledonlar oluştuktan sonra oluşan ilk vasküler yapraktır. Daha kırışık bir kenarı vardır ve Brassica rapa trichomes kaplıdır.
  3. Mikropsuz lahanaların sterilitesi için test
    NOT: Lahanaların mikropsuz olup olmadığını test etmek için, her bir partiden birkaç (5−10) lahana seçin ve herhangi bir eksteyete koloni olup olmadığını belirleyin.
    1. Lahanayı, sterilize edilmiş ençelerle bitkinin tabanını tutarak ve dışarı çekerek cam tüplerden yavaşça çıkarın. Lahanayı tüpten tamamen çıkarmadan önce, sterilize edilmiş diseksiyon makaslaköklerini dikkatlice kesin. Lahana yapraklarını 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe sıkıştırın.
      NOT: Daha büyük lahanalar, lahananın 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne girmesini kolaylaştırmak için hala tüpteyken büyük yapraklardan bir veya ikisini çıkarmayı gerektirebilir. Bu büyük yapraklar, lahananın geri kalanı gerekliyse, lahananın geri kalanı tüpe yerleştirildikten sonra 1,5 mL'lik tüpe eklenebilir.
    2. Her 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 400 μL 1x fosfat tampon salini (PBS) ekleyin. Steril bir mikroteks kullanarak, 30x haşere tarafından lahana homojenize.
    3. Lahananın 100 μL'lik plakası, numunede herhangi bir kirletici madde olup olmadığını belirlemek için agar plakaları üzerine homojendir. Fillosferde bulunan bakterilerin çoğu triptik soya (TS) agar plakaları üzerinde büyüyecek. Lahana homojenate kalın ve düzenli pipet ipuçları tıkanabilir gibi lahana homojen kaplama geniş orifice pipet uçları kullanın.

2. Fillosferin mikrobiyal çözeltilerle aşılanması

  1. Aşılama suşları gliserol stokları yapma
    NOT: Tablo 1, bu adımda kullanılabilecek mikrobiyal yalıtmaları listeler. Diğer fillosfer izole burada da kullanılabilir.
    1. Yoğun bir şekilde, yeni bir çizgiden, aynı medyanın iki/üç yeni plakasına, birçok koloniyi elde etmek için tek tek kolonileri dışarı çıkar.
    2. Çizgiler 2−5 gün boyunca büyümeye izin sonra 15 mL içeren 15 mL konik tüp içine tüm plakalardan koloniler kazımak 15 mL 15% gliserol, ve girdap iyice karıştırmak için.
    3. İyi karıştırılmış gliserol stokunun 1 mL'lik bir aliquot'ünü 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın ve gliserol stoklarını kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. Lahana aşılama sırasında nispeten büyük hacimlerde aşılama çözeltisi gerektiğinden, kalan 14 mL gliserol stoğunu -80 °C'de saklayın.
    4. Kullanımdan bir hafta önce, 14 mL inoculation çözeltisinin konsantrasyonunu (koloni oluşturma birimi [CFU] belirlemek için buz, seyreltme ve plaka (örneğin, 10-4, 10-5ve 10-6)üzerinde 1 mL gliserol stoku (adım 2.1.3) içeren 1.5 mL tüpü eritin.
  2. Aşılama sprey şişelerinin sterilizasyonu
    1. Amber yuvarlak Boston pompa şişeleri (59 mL) sökmek ve tüm bileşenleri (pompa, tüp, kapak ve şişe) 30% çamaşır suyu çözeltisi içinde 30 dakika için büyük bir plastik kapta sıkıca oturan kapak ile ıslatın.
    2. Sırılsıklam olduktan sonra, kabın kapağının sadece bir köşesini kaldırarak kabın tüm çamaşır suyunu dikkatlice dökün.
    3. Plastik kabı otoklavlı deiyonize suyla doldurarak şişeleri durulayın (konteyner büyüklüğüne bağlı olarak~1 L) ve bir köşede kapağı kaldırarak deiyonize suyu dikkatlice dökün.
    4. %70 etanol çözeltisi püskürterek ve UV ışığını 30 dakika açarak bir biyogüvenlik kabinini sterilize edin.
      NOT: Bu çalışmaya biyogüvenlik kabininde devam edin, böylece şişelerin kuruyan mikrobiyal kontaminasyon riski yoktur.
    5. Büyük plastik kap şişeleri çıkarın ve bir pipet kullanarak otoklavlı deiyonize su ile her şişe doldurun. Pompaları yeniden birleştirin ve her şişeye bir tane yerleştirin. Şişenin pompa bileşeninden çamaşır suyu çıkarmak için her şişe (şişe başına 10 sprey) yoluyla deiyonize su pompası.
    6. Tüm çamaşır suyunun cam şişelerden çıkarıldığından emin olmak için adım 2.2.5'i tekrarlayın.
    7. Şişelerin her şişeye bir numara yerleştirerek steril olup olmadığını test edin (tamamen kuruduğunda şişenin yan tarafına laboratuvar bandı yapıştırma) sonra şişelerin her birine 10 mL 1x PBS ekleyin ve bir TS agar plakaüzerine 3 sprey pompalayın. Püskürtme sonra, oda sıcaklığında bir hafta boyunca plakaları kuluçkaya yatırın. Herhangi bir koloni bir plaka üzerinde büyürse, ilgili şişenin steril olmadığını ve deneyler için kullanılmaması gerektiğini gösterir.
    8. Steril şişeleri depolamadan önce, kalan tüm PBS'yi çıkarın ve şişelerin biyogüvenlik kabininde iyice kurumasını bekleyin. Steril şişeleri steril plastik bir kapta (genellikle şişelerin beyazlatma için kullanılan kabı) kullanıma kadar saklayın.
  3. Mikrobiyal inokülhazırlanması ve mikropsuz lahana püskürtme
    DİkKAT: Tüm adımlar bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır, çünkü püskürtme, çalışma yüzeylerini kirletebilecek veya laboratuvar tezgahında yapılması halinde sağlık riski oluşturabilecek mikrobik çözeltileri aerosolize eder.
    NOT: Lahanalar 5 gün sonra gerçek yapraklar oluşturacak, bu nedenle herhangi bir mikrobiyal çözelti ile aşılama önce lahana dikim sonra bir hafta beklemek tavsiye edilir. Tüpler mühürlü olduğu için lahanaları sulamaya gerek yoktur. Küçük tüpler lahananın büyümesini kısıtlayış gösterdiğinden, deneyler dikimden sonraki bir ay içinde en iyi şekilde gerçekleştirilir.
    1. 1x PBS'de buz ve seyreltik üzerinde, istenilen aşılama konsantrasyonuna göre eritme gliserol stokları (2.1.4 adımda 1 mL aliquot'un çözülmesi ve kaplaması ile belirlenen konsantrasyon).
      NOT: Çeşitli aşı seviyeleri kullanılabilir, ancak fillosfer izole 10 gün içinde lahana bulamacı 104 ila 108 CPU/mL büyüyebilir.
    2. Steril pompa şişesine seyreltilmiş gliserol stok 10 mL ekleyin ve şişe pompası bileşeni herhangi bir artık PBS kaldırmak için büyük bir atık toplama kabı içine pompa 5 spreyler.
    3. Lahana tüpünden kapağı çıkarın, lahanayı sprey şişesine doğru yatırın ve her lahanayı ~600 μL inoculum sağlayan aşı çözeltisinin 3 pompasıyla püskürtün.
    4. Aşılama dan sonra, gerçek giriş aşılama konsantrasyonu değerlendirmek için lahana bir alt kümesi hasat. Sterilize forceps ile bir tüp lahana çıkarın. Steril diseksiyon makası ile kökleri kesin ve daha sonra lahanayı önceden tartılmış steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe dikkatlice yerleştirin. Hesaplamalar için CFO'lar/g lahana gerekiyorsa, lahananın ağırlığını gelecekteki hesaplamalar için kaydedin.
    5. Lahana içeren her 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 400 μL 1x PBS ekleyin ve lahanayı 30 x öğüterek 1x PBS'ye homojenize etmek için steril bir mikrokol kullanın.
    6. Seyreltin lahana homojenate (gerekirse) ve kabare lahana karışımı dışarı plaka. Kalın ve bitki doku parçaları dolu olacak, çünkü lahana bulamaç pipetting için geniş delik ipuçları kullanın.

3. Steril sebze özü hazırlama

NOT: Bu yöntem lahana steril medya üretimi18,,19değiştirilmiş bir sürümüdür.

  1. Süpermarketten lahana al. Laboratuvarda, lahananın en dıştaki yapraklarını çıkarın ve atın. Kalan tüm lahanayı blender'a sığdırmak için doğrayın ve lahanayı ince bir hamura homojenize edin, yani lahana daha fazla karıştırma ile daha ince olmayacaktır.
    NOT: Lahanayı düzgün homojen bir hamurla doğrayabilen her blender bu yöntem için uygun olmalıdır.
  2. Harmanlanmış lahanahomojen tartın ve lahana gram başına distile su 2 mL ekleyin. Karıştırılmış lahana bulamacını 2 kat sepet kahve filtrelerinden (ağartılmamış kağıt) süzün.
  3. Santrifüj tüpler (boyutu santrifüj bağlıdır) içine lahana bulamaç dağıtın. Büyük parçacıklar çözeltidışında yerleşene kadar 20.000 x g'de filtrelenmiş lahana bulamacını 20 dk için santrifüj edin.
    NOT: Lahana parçacıkları filtre sterilizatörü hızla tıkarken lahana bulamacını uzun süre santrifüj etmek esastır.
  4. Serolojik pipet kullanarak, peletli lahana enkazından süpernatantı çıkarın ve peletli lahanayı rahatsız etmemeye özen tinleyin. Standart tuz konsantrasyonlarının kullanıldığı fermantasyon koşullarını yeniden oluşturmayı hedefliyorsa, bu adımda (örneğin, filtre sterilizasyonundan önce) %2 w/v NaCl ekleyin.
  5. Filtre, vakuma bağlı 0,2 μm filtre (500 mL veya 1 L) kullanarak sebze ekstresini sterilize edin. Steril tüplere (50 mL santrifüj tüpleri veya 15 mL santrifüj tüpler) dağıtın ve kullanıma kadar -80 °C'de donun.

4. Steril sebze ekstresinin aşılanması

  1. SVE'yi eritin ve 490 μL'yi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe dağıtın. Her zaman noktası ölçümü yıkıcı olduğundan, zaman noktası başına tedavi başına en az beş kopyaya sahip olmak için yeterli tüpler kullanın.
  2. Mikrobiyal eritme gliserol stokları buz üzerinde izole ve istenilen konsantrasyona 1x PBS ile seyreltmek. Laktik asit bakterilerinin konsantrasyonu SVE mL başına 5.000 CFU kadar düşük olabilir. Bu konsantrasyonu elde etmek için, toplam 500 μL'lik hacmin aşılanmasında 10°L kullanılacağı için stokları 250 CPU/l'ye seyreltin.
  3. 10 μL seyreltilmiş mikrobiyal izole ile SVE aşılamak. Pipet yukarı ve aşağı iyice karıştırmak için birkaç kez. İstenilen sıcaklıkta kuluçka (kimchi üretim sıcaklığı için 14 °C veya en sıcak lahana turşusu fermantasyonu için 24 °C).
  4. 1. gün, 2. gün, 4.
    NOT: Fermantasyon başlangıçta hızla ilerler ve zamanla yavaşlar. Bu nedenle, daha fazla başlangıç zaman noktalarına sahip olmak fermantasyonun nasıl devam ettiğine ilişkin dinamiklere daha fazla çözünürlük sağlar.
  5. Her zaman diliminde, aşılanmış SVE'yi birkaç kez yukarı ve aşağı boruhaline vererek iyice karıştırın. 1x PBS'de aşılanmış SVE'yi seri olarak seyreltin ve agar plakaları üzerine plaka. Kolonileri saymadan önce agar plakalarını 4−7 gün kuluçkaya yatırın.
    NOT: Man, Rogosa ve Sharpe (MRS) agar tüm laktik asit bakterileri saymak için kullanılmalıdır, maya peptone dekstroz (YPD) maya için kullanılmalıdır, ve ts agar diğer bakteriler için phyllosphere izole.
  6. Bir mikro pH probu kullanarak her zaman noktasında numunelerin pH'ını kaydedin.
    NOT: PH probu hücreleri tüpler/tedaviler arasında aktaracağı için bu adım kaplamadan sonra yapılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Napa lahanabüyüme oranları
Tohum sterilizasyon yöntemi birkaç farklı Napa lahanası ile test edildi (B. rapa var pekinese; Ek Şekil 1) farklı tedarikçilerin bir dizi ve tüm benzer büyüme oranları ile tutarlı büyüdü. Ancak, Brassica farklı türleri ile yöntemleri test (B. rapa: Şalgam Mor Top; B. oleracea: Kahire Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. campestris: Pak Choi Oyuncak Choy Hybrid; B. juncea: Harda...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikropsuz Napa lahana bitkileri Napa lahana phyllosphere17laktik asit bakterilerin dağılım sınırlaması incelemek için kullanılmıştır. Mikropsuz Napa lahanalar da fillosferde bireysel veya çift-bilge büyüme test etmek için kullanılabilir (Şekil 1). Kırmızı, yeşil ve Napa: steril sebze özü yapmak için yöntemler lahana üç farklı çeşitleri için test edilmiştir. Bu SVE'lerin her biri güvenilir bir büyüme ortamı olarak hareket eder; aşılanmış mikroplar sürekli farklı medya ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma USDA-NIFA hibesi ile desteklenmiştir: 2017-67013-26520. Tracy Debenport ve Claire Fogan teknik destek sağladı ve Ruby Ye ve Casey Cosetta bu el yazmasının erken sürümleri hakkında yararlı yorumlar sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleriVWR20170-650
15 mL konik tüplerFalcon352096
7 tepsi tepsisiSigma MacentaT8654
Amber Yuvarlak Boston Cam ŞişeGPS 712OZSPPK12BRÇeşitli tedarikçilerden Amazon.com tarihinde sipariş edildi
Sepet kahve filtreleriEğer önemsiyorsan(ağartılmamış kağıt) Wholefoods Bleach'ten
(cıva içermez)Austin'in50-010-45
Borosilikat Cam tüpleriVWR47729-586
Kalsine kilTurfaceMVPRoot Natural'dan Amazon.com Olarak Sipariş Edildi 6 Quart Torbalar. Parçacık boyutu yaklaşık 3-5 mm
Cuisinart blenderCuisinartCuisinart Mini-Prep Plus Mutfak Robotu, 3 Fincan
Diseksiyon makası7-389-AAmerikan Eğitim ÜrünleriAmazon.com
EthanolVWR89125-172
ForsepsAven18434Sipariş Edildi Amazon.com
Glycerol Fisher Scientific56-81-5
KleenGuard M10Kimberley-Clark64240
Büyük plastik kapRubbermaidAmazon.com
Light raflardaGardner's Supply39-357tam spektrumlu T5 floresan ampuller
Macenta tm 2 kapaklarMillipore SigmaC1934
Man, Rogosa ve SharpeFisher ScientificDF0881-17-5Bu ortam et suyu içindir ve plaka yapmak için 15 g agar eklenir
Mikro pH probuThermo Scientific8220BNWP
MicropestleCarolina215828Pelet Havaneli
MS besin suyuMillipore SigmaM5519Murashige ve Skoog Bazal Orta
NaClSigma AldrichS9888
Napa lahana tohumlarıJohnny'nin Seçilmiş Tohumları2814GB. rapa var pekinensis (Bilko)
Petri kabı 100 mm x 15 mmFisherFB0875712Agar plakaları yapmak için kullanılır
Fosfat tampon salinFisher Scientific50-842-941Teknova
Bitki doku kültürü kutusuSigmaMagenta GA-7
Serolojik pipetlerVWR89130-900
Steril dübelPüriten10805-018sterilize etmek için kullanmadan önce otoklav
; m filtresiNalgene974103
Triptik soya agarFisher ScientificDF0370-17-3Bu ortam et suyu içindir ve plakalar yapmak için 15 g agar eklenir
Geniş delikli pipet uçlarıRainin17007102
Maya, pepton ve dekstrozFisher ScientificDF0428-17-5Bu ortam uygundur ancak maya, pepton ve dekstroz kullanılarak da ortam yapılabilir, plaka yaparken 15 g agar ekleyin
satın alındı, sipariş edildi olarak da adlandırılır Sterilizasyon 0.2 ve mikroyu

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135(2019).
  2. Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
  3. Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
  4. Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
  5. Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
  6. Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
  7. Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
  8. Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486(2015).
  9. Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682(2014).
  10. Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
  11. Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
  12. Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
  13. Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564(2014).
  14. Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
  15. Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461(2019).
  16. Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
  17. Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269(2019).
  18. Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
  19. Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
  20. Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77(2018).
  21. Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871(2015).
  22. Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
  23. Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
  24. Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134(2018).
  25. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
  26. Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Filosfer MikrobiyomuMikrobiyal Topluluk KurulumuMikropsuz BitkilerSteril Sebze EkstresiTohum SterilizasyonuKalsiyum Kil SubstratMS Besiyerinok lasyon ProtokolFermantasyon Analizi

İlgili makaleler