Method Article

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

DOI:

10.3791/61152

⸱

May 10th, 2020

 ,  , 
1MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA rehberliğinde Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR)-Cas9 gibi özel olarak tasarlanmış endonükleazlar, memeli hücrelerinde etkili genom düzenlemesini mümkün kılar. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinde bir örnek olarak hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunu sorunsuz bir şekilde genom düzenlemesi için ayrıntılı prosedürleri açıklıyoruz. Domuzcuk bazlı bir donör plazmidi ve CRISPR-Cas9 nickaz mutantını iki aşamalı bir genetik seçimde birleştirerek, HNF4α lokusunun doğru ve verimli bir şekilde hedeflendiğini gösteriyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), araştırma veya klinik1 için sınırsız bir somatik hücre kaynağını temsil eder. hPSC'lerde gen hedefleme, hücre spesifikasyonu sırasında gen fonksiyonunu incelemek ve hastalık mekanizmalarını anlamak için güçlü bir yöntem sunar. Etkili genom düzenleme yöntemleri mevcut olmasına rağmen, hPSC'lerdeki genleri modifiye etmek teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. hPSC'lerde homolog rekombinasyon ile standart gen hedeflemesi düşük frekansta gerçekleşir veya bazı genlerde bile tespit edilemez 2 ve DNA çift iplikçik kırılması (DSB) uyarılmış gen hedeflemesi (gen düzenleme olarak adlandırılır) bu nedenle bu hücrelerde gereklidir 2,3. Ek olarak, hPSC'lerin transfeksiyonu ve ardından tek hücreli klonlama, tek hücreyle ilişkili apoptoz, Rho ile ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü4 kullanılarak azaltılabilse de, çok verimli değildir. Son olarak, ilgilenilen gendeki potansiyel hedef içi ve hedef dışı mutasyonlar da sorunlu olabilir. Bu nedenle, hPSC'lerde özel genetik değişiklikler yapmak için güvenilir bir protokol gereklidir.

RNA rehberliğindeki CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) ve CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) teknolojisi artık gen düzenlemede köklü bir araçtır. Transkribe edilmiş CRISPR RNA (crRNA) ve trans-aktive edici bir RNA (tracrRNA), Cas9 proteini ile kompleksleşen ve genin spesifik bölünmesine izin veren tek kılavuzRNA'yı (sgRNA) oluşturur. CRISPR / Cas9 sistemi, sgRNA'nın 20-bp kılavuz dizisini değiştirerek programlanabilir, yani protospacer-bitişik motif (PAM) gereksinimini karşılayan hemen hemen her lokus düzenlenebilir. Bununla birlikte, vahşi tip Cas9, kılavuz dizisi ile bir DNA hedefi arasındaki bazı uyumsuzlukları tolere edebilir ve bu da istenmeyen hedef dışı etkilere neden olabilir. Özgüllüğünü arttırmak için, bir nickaz mutantı (Cas9n) geliştirilmiştir. D10A veya N863A mutasyonu içeren bir Cas9n sadece bir fonksiyonel nükleaz alanına sahiptir ve sonuç olarak DNA'yı sadece bir iplikçikte parçalayabilir. Uygun şekilde yerleştirilmiş ve yönlendirilmiş bir çift Cas9n, DNA DSB'yi etkili bir şekilde indükleyebilir ve hedef dışı etkiler önemli ölçüde azalır6. Verimli Cas9n modifikasyonu sağlamak için, iki Cas9n-sgRNA'nın ideal olarak -4 ila 20 bp ofset ile yerleştirilmesi ve her zaman 5' çıkıntı6 oluşturması gerektiği gösterilmiştir.

Cas9(n)-sgRNA ile indüklenen DSB, hPSC'lerde genom düzenleme için kullanılabilir 7,8. Homolog olmayan uç birleştirme onarımı yoluyla gen nakavtı oluşturabilir veya bir donör DNA şablonu mevcutsa, homolojiye yönelik onarım (HDR) yoluyla gen modifikasyonu yapabilir. Burada açıklanan protokol, HDR için bir piggyBac transpozon bazlı donör plazmidi (veya hedefleme vektörü) kullanır, burada bir ilaç direnci belirteci transpozon ters çevrilmiş tekrarlarla çevrilidir. Bu yaklaşımın avantajı, ilk olarak Yusa ve ark.9,10 tarafından gösterildiği gibi verimli tarama ve kesintisiz gen düzenlemeyi içerir. İlaç seçim kaseti, hücrelerin entegre vektörle zenginleştirilmesine izin verir, bunlar daha sonra HDR tarafından türetilenleri tanımlamak için bağlantı PCR ile taranır. Ek olarak, ilaç seçim kaseti Cas9 (n) bölünmesi için hedef dizilerin yerini alacak şekilde konumlandırılabilir, böylece HDR'den sonra başka DNA kırılması meydana gelmez, böylece Cas9 (n) yeniden bölünmesinden kaynaklanan 'açık' hedef mutasyonları ortadan kaldırır. Ayrıca, piggyBac transpozaz tarafından katalize edilen hassas eksizyondan yararlanarak, seçim belirteci daha sonra bir yara izi bırakmadan genomdan eksize edilir. İlaç seçim belirteci9'un çıkarılmasından sonra sadece piggyBac yerleştirme için orijinal endojen TTAA dizisi kalır. TTAA sitelerinin ikameler getirilerek oluşturulması gerekse bile, rahatsız edici düzenleyici unsurların olasılığı diğer yöntemlere kıyasla azalır10.

Burada, hPSC'lerde kesintisiz genom düzenlemeyi uygulamak için ayrıntılı prosedürleri açıklıyoruz. Domuzcuk bazlı bir donör plazmidini ve CRISPR-Cas9 nickaz mutantını iki aşamalı bir genetik seçilimde birleştirerek, hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) gen11'e önceden belirlenmiş iki nokta mutasyonu getirdik. Bu yaklaşım güvenilir ve verimlidir ve insan pluripotent kök hücrelerinden endoderm ve hepatosit spesifikasyonunda HNF4α'nın oynadığı önemli rollerin derinlemesineanalizine izin vermiştir 11.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. CRISPR/Cas9n-sgRNA ekspresyon plazmidlerinin tasarlanması ve oluşturulması

  1. Değiştirilecek sitenin yakınındaki herhangi bir 5'-NGG'nin doğrudan yukarı akışındaki 20-bp kılavuz dizilerini arayın. Streptococcus pyogenes'ten Cas9 nickaz (Cas9n) kullanıldığında bir çift tek kılavuzlu RNA'ya (sgRNA) ihtiyaç vardır. SgRNA çifti, -4 ila 20 bp ofset6 ile çentikleme üzerine 5' çıkıntı üretebilmelidir.
  2. Gerekli oligoları ve pSpCas9n-2A-puro vektörünü sipariş edin.
  3. Yayınlanan protokol12'yi takiben Cas9n ile birlikte ekspresyon için sgRNA'yı pSpCas9n vektörüne klonlayın.

2. piggyBac tabanlı bir hedefleme vektörü tasarlamak ve oluşturmak

  1. Hedef gen dizisini indirin ve değiştirilecek sitenin yakınındaki bir TTAA sitesini arayın.
    NOT: TTAA sitesi ile değiştirilecek site arasındaki mesafe mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Kodlama dizisi içinde ve 100-bp mesafede TTAA bölgesi yoksa, eş anlamlı nükleotid ikameleri yaparak bir tane tanıtmak gerekir.
  2. Homoloji kollarını (HA'lar) tasarlayın ve HA'larda istenen nokta mutasyonlarını dahil edin. HA'ların optimal uzunluğu 500 - 1200 bp civarında olmalıdır.
    NOT: Potansiyel Cas9n yeniden bölünmesini önlemek için PAM dizisini mutasyona uğratmak için eş anlamlı nükleotid ikamelerinin uygulanması önerilir.
  3. Belirlenmiş bir protokol10'u izleyerek nihai hedefleme vektörünü oluşturun.
    NOT: Burada kullanılan hedefleme vektöründe, PGK promotör tahrikli puro-deltaTK seçim kaseti transpozon ters tekrarlarla çevrilidir.

3. İnsan pluripotent kök hücrelerinin genetik düzenlemesi

  1. İnsan pluripotent kök hücrelerini (hPSC'ler) nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de ve rekombinant laminin521 kaplı yüzeylerde (5 μg / mL) mTeSR1 ortam13'te %5 CO 2 tutun. Hücreler, 1: 3 bölünme oranını takiben 72 saat sonra% 70-85 akıcılığa ulaşmalıdır.
    NOT: Varsa, günlük ortam değişiminden önce kendiliğinden farklılaşmış hücreleri nazikçe aspire ederek çıkarın.
  2. Transfeksiyon gününde, 24 delikli bir plakanın yeterli kuyularını, 37 ° C'de 300 μL laminin 521 çözeltisi (5 μg / mL) ile en az 2 saat boyunca kaplayın.
  3. Kaplama çözeltisini nazikçe çıkarın ve her bir oyuğa 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 300 μL taze mTeSR1 ortamı ekleyin ve ardından hücreleri almak için plakayı inkübatöre geri koyun.
    NOT: Laminin kaplama çözeltisi çıkarıldığında plakaların herhangi bir noktada kurumasına izin vermeyin.
  4. Stok hPSC'leri inkübatörden hareket ettirin, harcanan ortamı çıkarın ve ardından 1 mL steril 1x DPBS kullanarak hücreleri bir kez yıkayın.
  5. 6 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL yumuşak hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve hücreleri ayırmak için 6-8 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Plakaya hafifçe dokunun ve sindirimin yeterince uzun olup olmadığına karar vermek için hücrelerin kolayca ayrılıp ayrılamayacağını kontrol edin.
  6. Tüm hPSC'leri kaldırmak için bir P1000 ucu kullanarak yavaşça yukarı ve aşağı pipet çekin.
  7. Hücre süspansiyonuna 10 μM ROCK inhibitörü (Y-27632) ile desteklenmiş 2 mL taze mTeSR1 ortamı ekleyerek ayrışmayı sonlandırın.
  8. İyice karıştırın ve tek hücreli süspansiyonu 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.
  9. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 2 mL taze mTeSR1 ortamında iyice askıya alın.
  10. Bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın. Ölü hücreleri boyamak ve dışlamak için Trypan Blue kullanın.
  11. Her nükleofeksiyon reaksiyonu için 8 x 10 5 ila 1 x 106 canlı hücreyi1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. Sonra süpernatanı dikkatlice aspire edin.
  12. Eşleştirilmiş Cas9n-sgRNA ekspresyon plazmidlerinin 3 μg'ını ve 5 μg hedefleme vektörü plazmidini, insan kök hücre nükleofeksiyon kitinden 100 μL karışık nükleofeksiyon çözeltisi / takviyesi içinde karıştırın. Kitteki GFP kontrol plazmidini kullanın ve bir GFP kontrol plazmidi karışımı hazırlayın.
    NOT: Nükleofeksiyondan önce endotoksin kontaminasyonunu azaltmak için tüm plazmidlerin maxi-prep'inin yapılması önemlidir. Plazmidlerin konsantrasyonu yaklaşık 1 μg / μL olmalıdır.
  13. Hazırlanan hücreleri yeniden askıya almak ve herhangi bir kabarcıktan kaçınarak bir elektroporasyon küvetine (nükleofeksiyon kiti ile birlikte verilir) aktarmak için DNA karışımını (hacim ~ 111 μL) kullanın.
  14. İnsan pluripotent kök hücreleri için optimize edilmiş koşulları seçerek nükleofeksiyon cihazını kullanarak hücreleri elektroporat yapın.
    NOT: İnsan pluripotent kök hücreleri için nükleofeksiyon kitini ilk kez kullanıyorsanız, elektroporasyon programını test etmek ve en verimli olanı seçmek gerekir.
  15. Hemen elektroporatörlü hücrelere 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 37 °C mTeSR1 ortamına 500 μL taze ve ılık ekleyin. Karışımı, 3.2 ve 3.3 adımlarından hazırlanan 24 delikli bir plakanın 2 kuyucuğuna aktarın.
  16. Plakayı hızlı bir şekilde 37 °C / % 5 CO2 inkübatöre geri koyun ve hücrelerin iyileşmesine izin verin.
  17. 12-16 saat sonra, hücre bakım ortamını değiştirin. Hücreler hücre-hücre teması kurarsa, ROCK inhibitörünü geri çekin, değilse, ortamı inhibitör ile desteklemeye devam edin.
  18. 24-48 saat arasında, kontrol hücrelerindeki GFP ekspresyonunu inceleyerek nükleofeksiyon etkinliğini kontrol edin. GFP pozitif hücreler en az yüzde 30 olmalıdır.
  19. Nükleofeksiyondan 48 saat sonra, mTeSR1 ortamını 1 μg / mL puromisin ile destekleyerek hücreleri seçmeye başlayın.
  20. Nükleofeksiyondan 72 saat sonra, mTeSR1 ortamını 0.5 μg / mL puromisin ile destekleyin. Hücre akıcılığı% 30'dan düşükse, ortamı 10 μM ROCK inhibitörü ile de destekleyin.
  21. Nükleofeksiyondan 4-6 gün sonra, puromisine dirençli hücreleri 0.8 hücre / kuyu konsantrasyonunda 10-15 x 96 kuyucuklu plakalara geçirin.
    NOT: Ortamın 10 μM ROCK inhibitörü ve 0.5 μg / mL puromisin ile desteklenmesi esastır.
  22. Tek hücreden türetilmiş koloniler oluşturmak için bu hücreleri 10-12 gün boyunca 37 °C / % 10 CO 2'de tutun. Tohumlamadan 7 gün sonra bir kez orta doldurun.
    NOT: Artan CO2 seviyesi, deneyimlerimize göre tek hPSC'lerin koloniler oluşturmasına yardımcı olur.
  23. Tek bir koloni içeren kuyucukları işaretleyin ve ortamı 0.5 μg / mL puromisin içeren ancak ROCK inhibitörü içermeyen taze mTeSR1 ortamı ile değiştirin.
    NOT: Bu noktadan itibaren, hücreler 37 °C / % 5 CO2 altında büyüyecektir.
  24. İki gün sonra, farklılaşmamış koloniler içeren kuyular için ortamı değiştirin. Ortamı 10 μM ROCK inhibitörü ve 0.5 μg / mL puromisin ile destekleyin.
    NOT: Bazı kuyularda, hücreler farklılaşmış olabilir ve atılması gerekebilir.
  25. Kolonileri nazikçe kazımak için P2 pipet uçlarını kullanın. Bir koloniden türetilen hücre süspansiyonunu ayrı 96 kuyucuklu plakalar üzerinde 2 yeni kuyuya aktarın ve birini genotipleme, diğerini de bakım için kullanın.
    NOT: Kolonileri dikkatli bir şekilde korumak ve kendiliğinden farklılaşma seviyesini minimumda tutmak önemlidir.
  26. Genotipleme için hücreleri içeren plakayı, çoğu kuyucuktaki akıcılık% 50 veya daha fazlasına ulaştığında alın. Harcanan ortamı boşaltın ve ardından hücreleri DPBS ile bir kez yıkayın.
  27. Bradley lizis tamponunu kullanarak hücreleri kuyuya alın ve ilişkili protokolü (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate) takiben plakadaki her kuyucuktan genomik DNA'yı izole edin.
  28. Hem sol hem de sağ homoloji kollarını bağımsız olarak10 genotiplemek için üç primer bağlantı PCR yöntemi kullanın.
    NOT: PCR yöntemini gösteren bir şema Şekil 2'de sunulmuştur.
  29. Sanger dizilimi için 4-5 koloniden her iki homoloji kolu için bağlantı PCR ürünlerini gönderin ve dizileri alın.
    NOT: Kurulan 2 koloninin sıralama sonucu Şekil 3A'da gösterilmiştir.
  30. Kolonileri doğru genotipte tutun ve gerisini atın.
  31. Sürekli puromisin seçimi altında doğru kolonileri genişletin ve mümkün olan en erken geçişte dondurun.

4. Transpozonun hedeflenen insan pluripotent kök hücrelerinden çıkarılması

  1. 0.5 μg / mL puromisin seçimi altında doğru genotipe sahip bir koloni tutun.
  2. Yukarıda açıklandığı gibi 5 μg hiperaktif transpozaz (pCMV-hyPBase) içeren 8 x 105 ila 1 x 106 hücreli nükleofect (Bölüm 3, adım 3.4-3.18). Paralel olarak bir GFP kontrol nükleofeksiyonu gerçekleştirin.
    NOT: Puromisin, bu hücrelerin nükleofeksiyonundan hemen sonra mTeSR1 ortamından çıkarılmalıdır.
  3. Yayınlanan prosedürlerin ardından çıkarılan puro-deltaTK seçim kaseti ile hücreleri büyütün ve tarayın10.
    NOT: Orijinal prosedürleri dikkatle takip etmek önemlidir. FIAU veya 1-(2-deoksi-2-floro-β-d-arabinofuranosil)-5-iyodourasil), Herpes simpleks virüsü kaynaklı timidin kinaz (HSV-tk) bazlı negatif seleksiyon için bir timidin analoğu olarak kullanılmıştır.
  4. Transpozonun çıkarılmasını onaylamak için değiştirilen bölgeyi sıralayın.
    NOT: Kurulan 3 koloninin sıralama sonucu Şekil 3B'de gösterilmiştir.
  5. Kolonileri doğru genotipte tutun ve daha fazla kullanım için genişletin.
  6. Daha fazla analiz için kullanmadan önce seçilen kolonilerdeki pluripotens belirteçlerinin karakterizasyonunu gerçekleştirin.
    NOT: Kurulan iki koloninin karakterizasyonu Şekil 4'te gösterilmiştir.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vektör tabanlı zincirleme stratejiyi hedefleme
Hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) geni, ekzon 8'e iki noktalı mutasyonlar getirmek için hedeflenen genom düzenlemesi için seçildi. 11 bp ofsetli bir çift Cas9n-sgRNA, değiştirilecek bölgeye yakın bir yerde tasarlanmıştır. DomuzcukBac tabanlı hedefleme vektörü, istenen nokta mutasyonlarını tanıtmak için homolojiye yönelik onarım şablonu olarak çalıştı. Eş anlamlı nükleotid ikamelerini veya istenen nokta mutasyonlarını içeren bir 967 bp 5'-HA ve bir 1142 bp 3'-HA güçlendirildi ve nihai hedefleme vektörüne klonlandı. DomuzcukBac yerleştirme bölgesi, istenen iki nokta mutasyonundan 16 bp ve 22 bp uzaktaydı. İlk turda puro-deltaTK seçim kasetini içeren koloniler puromisin ile seçildi. Seçim kaseti ikinci turda transpozaz eksizyonu ile çıkarıldıktan sonra, hedeflenen bölge sadece gende dahil edilen istenen nokta mutasyonları ile sorunsuz bir şekilde değiştirildi (Şekil 1).

İnsan pluripotent kök hücrelerinde genetik düzenleme
Doğru hedeflenmiş hücreleri taramak için, genotipleme için üç primer tabanlı bir PCR yöntemi kullanılmıştır (Şekil 2). PCR sonuçlarını doğrulamak için Sanger dizilimi uygulandı (Şekil 3A). Seçim kasetinin çıkarılmasından sonra, modifiye edilen bölge, istenen nokta mutasyonlarının doğru bir şekilde tanıtıldığını doğrulamak için tekrar sıralandı (Şekil 3B).

Koloni kurulması ve düzenlenmiş insan pluripotent kök hücrelerinin karakterizasyonu
Doğru genotipe sahip koloniler seçildi ve gerektiğinde genişletildi. Kurulan kolonilerin daha fazla analiz için kullanılmadan önce karakterize edilmesi gerekir. Düzenlenmiş hücreler, ebeveyn hücrelerle aynı morfolojiye sahiptir (Şekil 4A). Ayrıca, transkripsiyon faktörleri NANOG ve OCT4 (Şekil 4 B) ve ayrıca hücre yüzey belirteçleri SSEA4 ve TRA-1-60 (Şekil 4 C) dahil olmak üzere temsili insan pluripotent kök hücre belirteçlerini ifade ederler.

figure-results-1
Şekil 1: Vektör tabanlı zincirleme stratejiyi hedefleme11. HNF4α geninin ekzon 8'inde DNA çift iplikçik kırılmasını indüklemek için bir çift Cas9n-sgRNA ekspresyon plazmidi kullanıldı. 16 bp ve 22 bp uzaklıkta bulunan önceden belirlenmiş nokta mutasyonlarını tanıtmak için bir seçim kasetine sahip bir hedefleme vektörü kullanıldı. Bu seçim kaseti, yapısal olarak aktif bir promotör (PGK) tarafından tahrik edilen pozitif-negatif bir seçim işaretleyicisinden (puro-deltaTK) oluşan piggyBac transpozonu içinde yer alıyordu. Homolojiye yönelik onarım yolu aracılığıyla, hedeflenen hücreler seçim kasetini içeriyordu. Transpozazın aracılık ettiği transpozon eksizyonu, sadece nokta mutasyonlarının mevcut olduğu dikişsiz bir modifikasyonla sonuçlanır. Kızıl haç, istenen nokta mutasyonlarının yerini gösterir. HA = homoloji kolu; PB = piggyBac; PM = nokta mutasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Üç primer tabanlı PCR yöntemi. Gen hedefli hücreleri taramak için PCR tabanlı genotipleme kullanıldı. Sol homoloji kol bölgesini büyütmek için üç primer, LA-F1, -R1 ve -R2 kullanıldı. Bağımsız olarak, sağ homoloji kol bölgesini yükseltmek için RA-F1, -F2 ve -R1 kullanıldı. Jel elektroforezi sonucuna dayanarak, hedeflenmemiş hücreler ile heterozigot ve homozigot hücreler birbirinden ayırt edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Genetiği değiştirilmiş hücrelerin dizileme sonuçları11. İki klondan elde edilen PCR ürünleri sıralandı ve seçim kasetinin hedeflenen lokusa (A) doğru yerleştirildiği doğrulandı. 5' ve 3' piggyBac ters terminal tekrarları (ITR), TTAA doğrudan tekrarları tarafından kuşatıldı. Transpozon eksizyonu sonrası üç klon sıralandı (B). DNA çift iplikçik kırılmasını sağlamak için 11 bp ofsetli bir çift Cas9n-sgRNA kullanıldı. Önceden belirlenmiş iki nokta mutasyonu (A'dan G'ye ve A'dan C'ye) genin içine sokuldu. Eşanlamlı bir mutasyon, protospacer-bitişik motifi (PAM) mutasyona uğratmak için ve bir diğeri de piggyBac eksizyonu için gerekli TTAA bölgesini oluşturmak için tanıtıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Düzenlenmiş insan pluripotent kök hücrelerinin karakterizasyonu. Düzenlenmiş iki hücre çizgisinin ve ebeveyn hücrelerinin (A) morfolojisi, ölçek çubuğu = 100 μm. Pluripotent kök hücre belirteçleri NANOG ve OCT4'ün ekspresyonu, iki modifiye hücre hattında ve ebeveyn hücrelerde akış sitometrisi (C) ile SSEA4 ve TRA-1-60'a ek olarak immün boyama (B, ölçek çubuğu = 50 μm) ile incelenmiştir. IgG negatif kontrol olarak kullanıldı. DAPI, çekirdeği boyamak için kullanıldı. Yüzdeler, üç bağımsız deneyin ortalaması olarak hesaplandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol, önceden belirlenmiş nokta mutasyonlarını hPSC'lerde endojen bir lokusa sokmak için kullanılabilir. Domuzcuk tabanlı bir hedefleme vektörü ve eşleştirilmiş CRISPR / Cas9n ekspresyon plazmidlerinin kombinasyonunun güvenilir ve verimli olduğu kanıtlandı11. HNF4α gen düzenlemesini takiben, analiz edilen 43 klondan 12'si, bağlantı PCR taraması ile belirlenen şekilde doğru bir şekilde hedeflenmiştir. Spesifik olarak, bialelik hedefleme etkinliği yaklaşık% 21 (9/43) ve monoalelik hedefleme verimliliği% 7 (3/43) civarındaydı.

Hedefleme deneylerini takiben, taramanın ilk turu sırasında hedeflenen lokusun piggyBac transpozazı için erişilebilir olmasını sağlamak için puromisin seçimini sürdürmek çok önemlidir. Bu, PGK promotör güdümlü puro-deltaTK seçim kasetinin susturulmasını en aza indirecek vetarama 10'un ikinci turunda arka planı azaltacaktır. Yakın tarihli bir rapor, CAG promotörünün susturulmaya karşı hPSC14'teki PGK promotöründen daha dirençli olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, seçim kaseti için promotörün değiştirilmesi gelecekte bu sistemi geliştirebilir. HiPBaz ve GFP transfekte hücrelerden dirençli kolonilerin sayısını karşılaştırmak da önemlidir. Transpozonun başarılı bir şekilde çıkarılmasından sonra, hipPBazdan GFP-transfekte hücrelerden daha fazla hayatta kalan koloni olmalıdır. Transpozon eksizyonunun PCR analizine ek olarak, eksizyon doğruluğunu doğrulamak için modifiye bölgenin doğrudan sıralanması gerekir.

Yusa'nın piggyBac transpozon tabanlı hedefleme vektörü stratejisi 9,10'a dayanarak, yukarıda ayrıntılı olarak açıklanan prosedürler hPSC'lerin nükleofeksiyonunu ve tek hücre klonlama verimliliğini artırmaya odaklandı. Hücre tohumlama yoğunluğu, heterojen koloni oluşumu olasılığını azaltmak için optimize edilmiştir. Ayrıca, genotip taraması için koloni üretimini arttırmak için% 10 CO2'nin altında 10-12 günlük kültür kullandık. Deneyimlerimize göre, her 96 kuyucuklu plakadan yaklaşık 20 koloni elde edilebilir. Bu adım diğer yöntemlerden daha fazla zaman alabilse de, güvenilir ve oldukça verimlidir.

İhtiyaca bağlı olarak, hedefleme vektörleri, nokta mutasyonlarını tanıtmak veya düzeltmek, muhabir hücre çizgileri oluşturmak ve nakavt gen ekspresyonu oluşturmak için tasarlanabilir. Sonuç olarak, CRISPR / Cas9 (n) sisteminin ve bir hedefleme vektörünün kombinasyonu, farklı türlerde genetiği değiştirilmiş hPSC'ler sunmanın etkili bir yoludur.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.C.H, Stemnovate Limited'in kurucu ortağı, hissedarı ve yöneticisidir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kosuke Yusa'ya pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK ve pCMV-hyPBase plazmidlerini paylaştığı için teşekkür ederiz. Jia-Yin Yang ve Karamjit Singh-Dolt'a genom düzenleme konusundaki yararlı tartışmaları için teşekkür ederiz. D.C.H. laboratuvarı, Baş Bilim İnsanı Ofisi (TC/16/37) ve İngiltere Rejeneratif Tıp Platformu (MR/L022974/1) tarafından verilen bir ödülle desteklenmektedir. YW, Çin Burs Konseyi ve Edinburgh Üniversitesi tarafından finanse edilen bir doktora bursu ile desteklendi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-İnsan SSEA4 PEeBioscience12-8843-42
Anti-İnsan TRA-1-60 PEeBioscience11-0159-42
DPBSThermo Fisher Scientific14190144
Kalsiyum ve magnezyum içeren DPBSThermo Fisher Scientific14040133
FIAUMoravekM251
Nazik hücre ayrışma reaktifiKök Hücre Teknolojileri07174
H9 insan embriyonik kök hücreleriWiCellWA09
İnsan NANOG antikoruR& D sistemleriAF1997
İnsan OCT4 antikoruAbcamAB19857
İnsan kök hücresi Nükleofektör kiti 1LonzaVPH-5012
Fare IgG3 izotip kontrolü PEeBioscience12-4742-41
mTeSR1 ortaKök Hücre Teknolojileri85850
Nükleofektör 2b cihazıLonzaAAB-1001
pCMV-hyPBaseWellcome Trust Sanger EnstitüsüN/A
pMCS-AAT_PBPGKpuroTKWellcome Trust Sanger EnstitüsüN/A
pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)AddgenePX462
Puromisin dihidroklorürThermo Fisher ScientificA11138-03
QIAprep spin maxiprep kitiQiagen12162
QIAprep spin mini hazırlık kitiQiagen27106
Rekombinant laminin 521BioLaminaLN521
Tripan mavisi çözeltisi, %0,4Thermo Fisher Scientific15250061
Y-27632 (Dihidroklorür)MilliporeSCM075

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rashidi, H., et al. 3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
  2. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
  3. Porteus, M. H., Baltimore, D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science. 300 (5620), 763(2003).
  4. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  5. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
  6. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  7. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-824 (2013).
  8. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  9. Yusa, K., et al. Targeted gene correction of α1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).
  10. Yusa, K. Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon. Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).
  11. Wang, Y., et al. Multiomics Analyses of HNF4α Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation. iScience. 16, 206-217 (2019).
  12. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).
  14. Eggenschwiler, R., et al. Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase. Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsCRISPR Cas9 NickaseSeamless Genome EditingHNF4A LocusPiggyBac Donor PlasmidTwo Step Genetic SelectionNucleofection ProcedurePuromycin SelectionROCK Inhibitor SupplementSanger Sequencing Confirmation

Related Articles