Drosophila'nın Dendritlerinde ve Nöromüsküler Kavşaklarında Sinaptik Mikrotübül Dinamiklerinin İnvaziv Olmayan İnvaziv İn Vivo Analizi için 3D Parçacık İzleme

Özet

Bu çalışma, Drosophila'nın duyusal dendritlerinde ve nöromüsküler kavşaklarında in vivo mikrotübül (MT) artı uç dinamiklerinin otomatik, tarafsız izlenmesini ve analizini sağlamak için yeni bir yazılım stratejisiyle birleştirilmiş noninvaziv bir intravital nöronal görüntüleme stratejisi sunmaktadır.

Özet

Mikrotübüller (MT'ler) nöronal gelişimde kritik roller oynar, ancak regülasyonlarının ve işlevlerinin moleküler mekanizmaları hakkında birçok soru devam etmektedir. Ayrıca, postsinaptik MT'lerin anlaşılmasındaki ilerlemeye rağmen, presinaptik MT'lerin nöronal morfogeneze katkıları hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Özellikle, Drosophila duyusal dendritlerindeki in vivo MT dinamikleri üzerine yapılan çalışmalar, polimer düzeyinde davranış hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, sinek nöromüsküler kavşağının (NMJ) canlı görüntülenmesi ile ilişkili teknik ve analitik zorluklar, presinaptik MT dinamikleri ile ilgili karşılaştırılabilir çalışmaları sınırlamıştır. Ayrıca, MT dinamiklerinin in vitro ve ex vivo otomatik analizi için oldukça etkili birçok yazılım stratejisi olsa da, in vivo veriler, görüntülerdeki doğal olarak düşük sinyal-gürültü oranı ve karmaşık hücresel morfoloji nedeniyle genellikle önemli operatör girdisi veya tamamen manuel analiz gerektirir.  Bunu ele almak için bu çalışma, otomatik ve tarafsız in vivo parçacık tespiti için yeni bir yazılım platformunu optimize etti. EB1-GFP işaretli MT'lerin canlı hızlandırılmış konfokal görüntülerinin multiparametrik analizi, hem dendritlerde hem de Drosophila larvalarının NMJ'sinde gerçekleştirildi ve MT davranışlarında çarpıcı farklılıklar buldu. MT dinamikleri ayrıca, Drosophila sinaps gelişiminin önemli bir düzenleyicisi olan MT ile ilişkili protein (MAP) dTACC'nin yıkılmasının ardından analiz edildi ve vahşi tipe kıyasla MT dinamiklerinde istatistiksel olarak anlamlı değişiklikler tespit edildi. Bu sonuçlar, polimer düzeyinde hem postsinaptik öncesi hem de postsinaptik MT dinamiklerinin otomatik multiparametrik analizi için bu yeni stratejinin, döngüdeki insan kriterlerini önemli ölçüde azalttığını göstermektedir. Çalışma ayrıca, bu yöntemin dTACC-knockdown üzerine farklı MT davranışlarını tespit etmedeki faydasını göstermektedir ve bu da MT dinamiklerini in vivo olarak düzenleyen faktörlerin fonksiyonel ekranları için gelecekteki olası bir uygulamayı göstermektedir. Bu yöntemin gelecekteki uygulamaları, hücre tipi ve / veya bölmeye özgü MT davranışlarının aydınlatılmasına ve EB1-GFP'nin diğer hücresel ve hücre altı belirteçlerle çok renkli korelasyonlu görüntülenmesine de odaklanabilir.

Giriş

Hücreler, morfogenez yoluyla hücre içi ve hücre içi değişikliklerin koordinasyonu yoluyla fonksiyonel yapılar oluşturmak üzere organize olurlar. Morfogenezin dikkate değer bir örneği, son derece uzmanlaşmış nöronal yapının gelişmesidir. Nöronlar, yapısal ve işlevsel olarak farklı iki işlem türünü, dendritleri ve aksonları¹ genişlettikleri ve muazzam uzunluklara ulaşabildikleri dikkate değer bir polarizasyon sergilerler. Nöronal gelişimin karmaşıklığı, yalnızca dendritlerin ve aksonların büyüklüğünden değil, aynı zamanda karmaşık dallara ayrılmış geometrilerini oluşturmadaki zorluktan da kaynaklanmaktadır

Protokol

1. Drosophila örneklerinin üretilmesi

1. Uygun bir MT artı uç işaretçisi seçin. Bu çalışmada, güçlü, net bir sinyale^11,12 sahip, iyi karakterize edilmiş bir artı uç işaretleyici olan GFP etiketli EB1 kullanılmıştır. Alternatifler arasında EB3 ^10,13, CLASP/Orbit⁵³ ve CLIP-170⁵⁴ gibi diğer +TIP'ler bulunur.
2. Bir UAS promotörünün( örneğin, UAS-EB1-GFP) kontrolü altındaki MT işaretleyicisi ile sinekler elde edin veya üretin.
3. Dokuya özel

Sonuçlar

Sinekler, UAS-EB1-GFP transgenini pan-nöronal olarak (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)^58,59 veya duyusal nöronlarda (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)^60,61. EB1 bu çalışma için seçilmiştir, çünkü özellikle büyüyen uçlara lokalize olur ve duraklama ve büzülme^14,15 üzerine hemen ayrışır ve Drosophila 22,23,24,25,26,27,35 dahil olmak üzere çok sayıda ç.......

Tartışma

Bu makale, dendritlerde ve gelişim sırasında NMJ'de MT dinamiklerinin noninvaziv intravital görüntülemesini gerçekleştirmek için bir protokolü tartışmaktadır. Görüntülenecek hayvanların seçilmesi gibi deneysel adımlar sırasında insan girdisi gereklidir ve veri toplama sürecinde makul bir şekilde ortadan kaldırılamayan önyargılara neden olabilir. Bu nedenle, protokolün temel amacı, in vivo verilerin doğasında bulunan düşük sinyal-gürültü oranını işlemek için optimize edilmiş yeni bir yazı.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,5 mL mikrosantrifüj tüpü	Eppendorf	21008-959	Numune hazırlama
1000 & mikro; L TipOne pipet uçları	USA Scientific	1111-2721	Numune hazırlama
200 & mikro; L TipOne pipet uçları	USA Scientific	1120-8710	Numune hazırlama
221-Gal4 uçar	Bloomington Drosophila Stok Merkezi (ABD)	26259	Drosophila genetiği/çaprazları
60x Objektif Lens	Nikon	Plan Apo 60x Yağlı Boya	Görüntü alımı
6 kuyulu plaka	BD Falcon	353224	Numune hazırlama
Agar	MoorAgar	41084	Drosophila yemeği
Aivia	DRVision LLC		Bu çalışmanın bir parçası olarak optimize
edilmiştir Kloroform (amilenlerle stabilize edilmiş)	Sigma-Aldrich	C2432	Numune hazırlama
CO2 üfleme tabancası (melezler için sinek seçimi için)	Genesee	54-104	Drosophila genetiği/çaprazları
CO2 fıskiyesi (melezler için sinek seçimi için)	Genesee	59-180	Drosophila genetiği/melezleri
Soğutmalı CCD kamera	Hamamatsu	ORCA-R2	Görüntü alma
Mısır unu	Genesee	62-101	Drosophila yemeği
Damıtılmış Su			Drosophila yemeği
Çift taraflı bant	Scotch		Numune hazırlama
Drosophila şişeleri	Genesee	32-109	Drosophila yemeği
Droso-tapalar (köpük tapalar şişeler için)	Genesee	59-200	Drosophila gıda
Dumont #5 Biologie Inox Forseps	Güzel Bilim Araçları	11252-20	Numune hazırlama
elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 uçar	Melissa Rolls'un Hediyesi (Penn State Üniversitesi)	N/A	Drosophila genetiği/çaprazları
Etanol (%95)	VWR	75811-022	Drosophila gıda
Stereomikroskop için fiber optik aydınlatıcı/ışık kaynağı	Nikon	NI-150	Numune hazırlama
Flypad (haçlar için sinek seçimi için)	Genesee	59-172	Drosophila genetiği/melezleri
Forma Çevre Odası/İnkübatör	ThermoFisher	3940	Drosophila genetik/melezler
Halokarbon yağı 700	Sigma-Aldrich	H8898	Numune hazırlama
Daldırma Yağı	Nikon	MXA22168	Görüntü elde
etme Kimwipe Hassas Mendil	Fisher Scientific	34120	Numune hazırlama
Lazer Birleştirme	Modülü Spektral Uygulamalı Araştırma	LMM-5	Görüntü elde etme
Konfokal	Lümencor	SOLA 54-10021	Görüntü elde etme
MetaMorph Mikroskobu Otomasyon ve Görüntü Analiz Yazılımı	Moleküler Cihazlar		Görüntü elde etme
Mikro Kapak Camları, Kare, No. 1 1/2 (# 1.5)	VWR	48366-205	Numune hazırlama
Mükemmel Odak Sistemli motorlu ters mikroskop	Nikon	TI-ND6-PFS-S	Görüntü toplama
Motorlu sahne ve panjurlar	Önceki	Proscan III	Görüntü elde etme
Çok amaçlı makas	Scotch MMM1428		Numune hazırlama
Oje	Sally Hansen	784179032016 074170382839	Numune hazırlama
Optik Filtre	Chroma	ET480/40m	Görüntü alma
P1000 Pipetman	Gilson	F123602	Numune hazırlama
P200 Pipetman	Gilson	F123601	Numune hazırlama
PBS (10X) ph 7.4	ThermoFisher	70011044	Numune hazırlama
Propiyonik Asit	Fisher	A258-500	Drosophila gıda
Dönen disk konfokal tarayıcı ünitesi	Yokagawa	CSU-X1	Görüntü elde etme
Stereomikroskop	Nikon	SMZ800N	Numune hazırlama
Şeker (Sükroz)	Genesee	62-112	Drosophila gıda
Superfrost Slide	VWR	48311-600	Numune hazırlama
Tegosept	Genesee	20-258	Drosophila gıda
UAS-dtacc-RNAi Viyana uçuyor	Drosophila Kaynak Merkezi (Viyana, Avusturya)	VDRC-101439	Drosophila genetiği/çaprazları
Vazelin vazelin	WB Mason	DVOCB311003	Numune hazırlama
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Boyut 0	Zımba	5012000	Drosophila genetiği/melezleri
Maya	VWR	Torula Mayası IC90308580	Drosophila gıda
Yokogawa dikroik ışın ayırıcı	Semrock	Di01-T405 / 488/568 / 647-13x15x0.5	Görüntü elde etme

için Işık Kaynağı