Caenorhabditis elegans de novo Protein Sentez Oranlarının Değerlendirilmesi

Protein sentezi ve bozulma organizmahomestazis için gereklidir. Yaşa bağlı hastalıkların çok sayıda kusurlu protein üretimi 1^1tarafındanteşvik edilir ,². Küresel protein çeviri oranlarını ölçmek için, ribozomal profilleme gibi biyokimyasal teknikler vardır, hangi ribozom korumalı mRNA parçalarıderin sıralama içeren ifade izlemek için yanı sıra yeni protein sentezi³. Bu yöntem, ribozomlara artan RNA ilişkisi mutlaka artan çeviri anlamına gelmez gibi, çeviri oranları dolaylı bir okuma olmanın yanı sıra, yüksek maliyet ve başlangıç malzeme büyük miktarda bir gereklilik gibi teknik dezavantajları vardır. Öte yandan, proteomik tabanlı yöntemler nabız metabolik profilleme ile doğrudan protein nicelliği için izin kitle spektrometresi analizi^4,5. Ancak, bu kolayca in vivo kullanılamaz sınırlı zamansal çözünürlüğe sahip yarı-nicel bir yaklaşımdır. Ayrıca, proteinin etiketlenmesi ilgi hayvan /doku eşit olmayan dağıtılabilir. Daha da önemlisi, bu yöntemlerin her ikisi de dokuya özgü veya hücreye özgü protein çeviri oranlarındaki değişimleri tüm hayvanlarda veya dokularda gizleyebilirsiniz.

Caenorhabditis elegans çok sayıda yetiştirilebilir kolay kullanımlı bir model organizmadır⁶. Ayrıca, genetik amenability ve şeffaflık vivo canlı görüntüleme için izin verir. Bu protokol, fotobeyazrlama (FRAP) sonrası floresan geri kazanımını kullanarak protein sentezoranlarını saptamak için yapılan metodolojiyi açıklamaktadır. Floresan proteinlerin transgenik ekspresyonundan yararlanıyoruz, ya tüm organizmada ya da belirli dokularda/hücrelerde. Transgenik hayvanlar, yaygın olarak ifade edilen bir genin promoter'ı kullanarak GFP'yi ifade edebilir veya belirli hücre tiplerini hedeflemek için dokuya özgü bir organizatör olabilir. Bu teknik belirli bir proteinprotein sentez oranlarını incelemek için belirli bir organizatör genişletilebilir.

NOT: Florofororlara hem transkripsiyonel hem de çevirifüzyonu çeşitli dokularda de novo protein çevirisini değerlendirmek için kullanılabilir. Protein sentezi oranları, sitoplazma, mitokondri ve nükleus⁷gibi farklı hücresel bölmelerde lokalize olan birden fazla protein ailesi için değerlendirilebilir. Aşağıdaki suşlar küresel ve nöronal protein sentezi oranlarını izlemek için kullanılır, N2; Ex[p_ife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[p_ife-2GFP, pRF4], N2; Ex[p_unc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[p_unc-119GFP, pRF4], N2; Ex[p_sod-3GFP; pRF4]

1. De novo protein sentezinin izlenmesi için transgenik nematodların bakımı, senkronizasyonu ve hazırlanması

1. Yabani tip (wt) ve mutant transgenik nematodların gelişim evrelerini ve büyümesini değerlendirmek için bir diseksiyon stereomikroskop kullanın.
2. 1. Gün: Escherichia coli (OP50)(Tablo 1)ile tohumlanmış Nematode Büyüme Medya (NGM) plakaları üzerine istenilen floresan muhabiri taşıyan wt ve mutant transgenik hayvanların 10 L4 larvasını seçmek ve aktarmak için solucan toplama kullanın( Tablo 1).
   1. Bir Bunsen brülör üzerinde temas yerinde cam eriterek bir cam Pasteur pipet konik ucuna platin tel takarak bir solucan almak olun. Daha sonra, platin telin ucunu herhangi bir alet (örn. kıskaç veya hafif çekiç) kullanarak spatula şekline düzleştirmek.
   2. E. coli (OP50) bakterisinin tek bir kolonisini 50 mL Luria-Bertani (LB) sıvı ortam içeren bir şişeye dönüştürün ve sallayarak kuvözde 37 °C'de 10 saat büyüyün (200 rpm; Tablo 1). Daha sonra, bakteri kültürü 200 μL ile tohum NGM plakaları. Bakteri çim büyüme sağlamak için oda sıcaklığında bir gecede tohumlu plakalar kuluçka.
3. Kuluçka ve 20 °C standart sıcaklıkta nematodlar büyümek.
4. 5. Gün: Plakalar karışık bir transgenik solucan popülasyonu içerir. Taze tohumlu OP50-NGM plakalarında her bir suştan 15 Adet L4 larva seçin ve aktarın.
5. 6. Gün: FraP tayini yapın ve yetişkinliğin birinci gününde protein sentezhızını izleyin.
6. Ngm plakaları içeren siklohekmidi olumlu kontrol olarak hazırlayın ve kullanın:
   NOT: Siklohekmidin stok çözeltisini suda 10 mg/mL konsantrasyona seyrelterek hazırlayın. Stok çözeltisi 4 °C'de tutun.
   1. Uv ışığı (222 μW/cm² yoğunluk) ile tohumlu NGM plakalarını 15 dakika teşhir ederek bakterileri yok edin.
   2. Agar hacminde 500 μg/mL son konsantrasyona bakteriyel tohumlu plakaların üstüne siklohekmid ekleyin.
   3. Tabakların oda sıcaklığında 30 dakika kurumasını bekleyin.
   4. Araç ve siklohekmid içeren plakalarda p_sod-3GFP ifade eden transgenik nematodların transferi.
   5. 20 °C standart sıcaklıkta 2 saat kuluçka hayvanları.

2. FRAP tsöjen somatik doku muhabirleri p_ife-2GFP ve p_sod-3GFP ifade transgenik hayvanlar kullanarak

NOT: Tüm hayvan vücudunda küresel protein sentezhızını izleyin. Bu transkripsiyonel muhabirler farklı ifade düzeyleri mevcut ve her yerde birden fazla somatik dokularda ifade edilir, bağırsak da dahil olmak üzere, farinks ve vücut duvarı kasları.

1. 1 günlük yetişkin transgenik hayvanları, merkezde 20°L OP50 damlası ile tohumlanmış tek tek NGM plakalarına toplayıp aktarın.
2. Kapağı çıkarın ve her plakayı bir epifloresan mikroskobunun 20 x objektif lensin altına yerleştirin.
3. Fotobeyaztlama (ön beyazlatma) yapmadan önce bir referans görüntüsünü odaklayın ve yakalayın.
4. Photobleach her örnek için 10 dakika.
   NOT: Floresan sinyali ön beyazlatma görüntüsüne göre %30 -%50 yoğunluğuna göre söndürildiğinde fotobeyazlmayı durdurun. Işık yoğunluğu ve beyazlatma süresi muayene altında belirli florofor, hayvan evresi ve hücre veya doku için buna göre ayarlanmalıdır. Farklı numuneler için yeterli miktarda fotobeyazrlama için gerekli ışınlama süresi deneysel olarak belirlenmelidir.
5. Fotobeyaztma (ağartıcı) sonra bir görüntü yakalayın.
6. Hayvanları tek tek NGM plakalarında tutun ve onları kurtarın.
7. Her floresan muhabirin iyileşmesini en az 6 saat boyunca floresan stereomikroskopta görüntüleyin ve kaydedin.
8. Alternatif olarak, bir epifloresan mikroskobu kullanarak floresan kurtarma değerlendirmesi yapın (örneğin, AksiyoImager Z2).
9. Önümüzdeki 3 gün boyunca hayvan sağlığını hareket, dokunma hassasiyeti, üreme kapasitesi ve sağkalım larını izleyerek hayvan başına sağlık durumunu dikkatle değerlendirin. Fotobeyaztlama sonrası hasar belirtileri gösteren nematodlar ileri analizdışı bırakıldı.

3. Örneklerin montajı ve pan-nöronal sitoplazmaik GFP, p_unc-119GFP ifade transgenik nematodlar kullanarak FRAP analizi gerçekleştirmek

NOT: Sinir halkasının bulunduğu baş bölgesinde hedeflenen fotobeyaztlama ile pan-nöronal protein sentezini izleyin.

1. % 2 agarose pedleri hazırlayın.
2. Agarose pedin ortasına 10 μL'lik bir M9 arabelleği ekleyin.
3. Transfer 5 transgenik nematodlar m9 tampon bir damla içine pan-nöronally sitoplazmik GFP ifade.
4. Sıvı yaymak için bir kirpik kullanın.
   NOT: Hayvanlar agar içine M9 emiciliği nedeniyle 2 dakika içinde azaltılmış hareketleri görüntüler.
5. Bir "kirpik" çekme kullanarak çakışma önlemek için nematod konumunu değiştirin.
6. Örneği epifloresan mikroskobunun 40 x objektif lensin altına yerleştirin.
   NOT: Kapak kayması kullanmayın.
7. Bir referans görüntüsünü odaklayın ve yakalayın (çamaşır suyu).
8. Photobleach 90 saniye için ilgi hedeflenen alan.
   NOT: Floresan sinyali ön beyazlatma görüntüsüne göre %30 -%50 yoğunluğuna göre söndürildiğinde fotobeyazlmayı durdurun. Işık yoğunluğu ve beyazlatma süresi muayene altında belirli florofor, hayvan evresi ve hücre veya doku için buna göre ayarlanmalıdır. Farklı numuneler için yeterli miktarda fotobeyazrlama için gerekli ışınlama süresi deneysel olarak belirlenmelidir.
9. Fotobeyaztma (ağartıcı) sonra bir görüntü yakalayın.
10. Fotobeyaztlı nematodlara 10 μL'lik m9 tamponu ekleyin.
11. Hayvanlar 5 dakika lığına iyileşsin.
12. Nematodları merkezde 20 μL OP50 damlaile tohumlanmış tek tek NGM plakalarına aktarmak için "kirpik" pick veya pipet kullanın.
13. Epifloresan stereomikroskop altında her 1 saatte bir her numunenin görüntüsünü yakalayın.
    NOT: Fotobeyaztlama dan sonraki iyileşme süresi için t=0'ı sayın.

4. FRAP tahlil sırasında yakalanan görüntülerin veri analizi

1. Edinilen görüntüleri yazılım (örneğin, Fiji) kullanarak analiz edin.
2. Yazılımla görüntüleri açın.
3. Görüntü ve Renk açılır menüsünden Kanalları Böl komutunu seçin.
   NOT: Yeşil kanal görüntüsünü saklayın.
4. Floresan bölgeyi (örn. tüm vücut, baş, bağırsak) manuel olarak ayarlamak için Freehand Selection aracını kullanın.
5. Her zaman noktası için ilgi alanının ortalama piksel yoğunluğunu ölçmek için Analyze açılır menüsünden Ölçüm komutunu seçin.
   NOT: Floresan geri kazanım yüzdesi fotobeyazlama sonrası çekilen referans görüntüleri kullanılarak hesaplanır.

5. Rapor istatistiksel analiz

1. Her bir suş ve/veya koşulda en az 20 - 25 nematod kullanın.
   NOT: Üç biyolojik kopya yapılmalıdır.
2. P < 0.05 ile istatistiksel analiz için istatistiksel analiz için öğrenci t-testi (iki grup arasında karşılaştırma) veya ANOVA (birden fazla grup arasında karşılaştırma) gerçekleştirin.

Burada sunulan prosedür kullanılarak, protein sentez oranlarını ilgili protokollere göre değerlendirmek için aşağıdaki somatik muhabirleri ifade eden yabani tip ve mutant transgenik nematodlar, pife-2GFP, psod-3GFP ve punc-119GFP kullanılmıştır. Özellikle ife-2 promotörü kullanılarak somatik dokularında sitoplazmik GFP ifade eden yabani tip ve ife-2 mutant solucanlar fotobeyaztlama dan hemen sonra ve 5 saat iyileşme sonrası karşılaştırıldı. Temsili görüntüler ve niceleme, yabani tip hayvanların tamamen iyileştiğini, ife-2 mutantlarının ise iyileşme kapasitesinin azaldığını göstermektedir(Şekil 1A). Böylece, yabani tip solucanlar fotobeyazlatma sonrası de novo protein biyosentezini başlatırken, mRNA çeviri başlatma faktörü IFE-2'den yoksun solucanlar bunu yapamıyorlar, floresan iyileşme oranının in vivo7'dekiprotein sentezoranını gösterdiğini belirten. Ayrıca, mRNA çevirisinin spesifik bir inhibitörü olan siklohekmid, protein çeviri inhibisyonu için pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Gerçekten de, siklohekamid ile tedavi transgenik hayvanlar sod-3 organizatörü altında sitoplazmik GFP ifade, fotobeyazrlama üzerine floresan kurtarmak yok (Şekil 1B).

Ayrıca bu yöntemi, mRNA işleme cisimlerinin (P cisimlerinin) protein çevirisi oranını nasıl etkilediğini tespit etmek içinuyguladık 8. GFP pan-nöronsal olarak ifade eden yabani tip ve edc-3 (ok1427) mutant nematodlar, baş bölgesinde hedeflenen fotobeyaztlama sırasında iyileşme kapasiteleri incelendi. Floresan geri kazanımı, EDC-3 eksikliği olan hayvanlarda yabani tipe göre çok daha yavaştır(Şekil 1C). Bu, EDC-3 aracılı mRNA cirosunun yeni protein sentezini engellediğini ve sonuçta protein çevirisi başlatmayı bastırdığını gösterir9.

Şekil 1: C. elegansde novo protein sentezinin in vivo değerlendirilmesi . (A) FRAP analizi hem vahşi tip hem de IFE-2 eksik nematodlarda ife-2'ninorganizatörü altında sitoplazmik GFP'yi ifade eder. Transgenik hayvanlar tüm hayvan fotobeyazlasyonuna maruz kalınır. GFP sinyali başlangıç yoğunluğunun 0-50'sine düşürülür. Floresan fotobeyazrlama (ön beyazlatma), fotobeyazrlama süresi (10 dakika; çamaşır suyu) ve 5 saat sonrası kurtarma sonundan önce kaydedilir. (B) Siklohekamid tedavisi, sod-3'ünorganizatörü altında sitoplazmik GFP ifade eden transgenik hayvanların floresan iyileşmesini inhibe eder. Transgenik hayvanlar tüm hayvan fotobeyazlasyonuna maruz kalınır. GFP sinyali başlangıç yoğunluğunun 0-50'sine düşürülür. Floresan fotobeyazrlama (ön ağartıcı) önce kaydedilir, fotobeyazrlama süresi nin bitiminden sonra (10 dk; ağartıcı) ve 5 saat sonrası kurtarma (A, B: AxioImager Z2 mikroskop; objektif lens: 20x, sayısal diyafram 0.8; yüksek güçlü ışık kaynağı, HBO 100; 100 Watt cıva lambası; excitation / e filtermission setleri, Zeis Sets 38 Shift serbest GFP) sonra. Ölçek çubukları, 500μm. (C) EDC-3 eksik nematodlar nöronal hücrelerde azalmış de novo protein sentez oranlarını gösterir. Pan-nöronally sitoplazmik GFP ifade eden yabani tip ve edc-3 (ok1427) hayvanların floresan sinyali fotobeyazrlama (ön beyazlatma) önce yanı sıra fotobeyazrlama dönemi (90sec; çamaşır suyu) aşağıdaki ölçülür. Transgenik hayvanlar baş bölgesinde fotobeyaznmaya maruz (sinir halkası). GFP sinyali başlangıç yoğunluğunun 0-50'sine (AksiyoImager Z2; objektif lens: 40x, sayısal diyafram 0.75; floresan aydınlatma kaynağının 0 parlak gücüne (FI aydınlatma Sistemi X-Cite 120 XL FL PC, 120W metal halogenide lamba) ve tamamen açılmış iris'e indirgenir. Floresan kurtarmanın ortalama piksel yoğunluğu bir saatlik zaman aralıklarında ölçülür. Üç bağımsız deneyin her birinde 20 hayvan her bir zorlanma başına ölçüldü. Veriler, S.E.M., ***P < 0.05, eşleşmemiş t-testi anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Kullanılan reaktifler için önerilen tarifler. Sunulan protokolde kullanılan tüm reaktif tarifleri burada özetlenmiştir.

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.