Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Caenorhabditis elegans de novo Protein Sentez Oranlarının Değerlendirilmesi

5.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61170

⸱

12 Eylül 2020

 ,  , 
1Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, Greece, 2Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, Heraklion, 70013, Crete, Greece

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, de novo protein sentezini in vivo değerlendirmek için, fotobeyazrlama (FRAP) sonrası nematod Caenorhabditis elegans ve floresan kurtarma kullanan radyoaktif olmayan ve noninvaziv bir yöntem sınıyoruz ve tanımlıyoruz. Bu yöntem, protein sentezinin yeni modülatörlerini belirlemek için genetik ve/veya farmakolojik ekranlar ile kombine edilebilir.

Özet

Sağlıklı bir proteom bakımı hücre ve organizmahomestaz için gereklidir. Protein çevirikontrolü ile bozulma arasındaki dengenin bozulması yaşa bağlı çok sayıda hastalığı teşvik eder. Proteostaz kalite kontrol mekanizmalarının azalması yaşlanmanın bir özelliğidir. De novo protein sentezini saptamak için biyokimyasal yöntemler hala sınırlıdır, çeşitli dezavantajları vardır ve canlı hücrelerde veya hayvanlarda yapılamaz. Caenorhabditis elegans, şeffaf ve kolayca genetiği değiştirilmiş olmak, görüntüleme teknikleri kullanarak protein sentezoranlarını izlemek için mükemmel bir modeldir. Burada, fotobleaching (FRAP) sonrası floresan kurtarma kullanarak vivo de novo protein sentezini ölçmek için bir yöntem tanıtmak ve tanımlamak. Belirli hücre veya dokularda floresan proteinleri ifade eden transgenik hayvanlar floresan fotobeyazrlama ile sonuçlanan güçlü bir ışık kaynağı tarafından ışınlanır. Buna karşılık, floresan kurtarma değerlendirilmesi hücre ve / veya ilgi dokularda yeni protein sentezi anlamına gelir. Bu nedenle, transgenik nematodların, genetik ve/veya farmakolojik müdahalelerin birleşimi ve protein sentezoranlarının canlı görüntülenmesi yaşa bağlı proteostazın çöküşüne aracılık eden mekanizmalara ışık tutabilir.

Giriş

Protein sentezi ve bozulma organizmahomestazis için gereklidir. Yaşa bağlı hastalıkların çok sayıda kusurlu protein üretimi 11tarafındanteşvik edilir ,2. Küresel protein çeviri oranlarını ölçmek için, ribozomal profilleme gibi biyokimyasal teknikler vardır, hangi ribozom korumalı mRNA parçalarıderin sıralama içeren ifade izlemek için yanı sıra yeni protein sentezi3. Bu yöntem, ribozomlara artan RNA ilişkisi mutlaka artan çeviri anlamına gelmez gibi, çeviri oranları dolaylı bir okuma olmanın yanı sıra, yüksek maliyet ve başlangıç malzeme büyük miktarda bir gereklilik gibi teknik dezavantajları vardır. Öte yandan, proteomik tabanlı yöntemler nabız metabolik profilleme ile doğrudan protein nicelliği için izin kitle spektrometresi analizi4,5. Ancak, bu kolayca in vivo kullanılamaz sınırlı zamansal çözünürlüğe sahip yarı-nicel bir yaklaşımdır. Ayrıca, proteinin etiketlenmesi ilgi hayvan /doku eşit olmayan dağıtılabilir. Daha da önemlisi, bu yöntemlerin her ikisi de dokuya özgü veya hücreye özgü protein çeviri oranlarındaki değişimleri tüm hayvanlarda veya dokularda gizleyebilirsiniz.

Caenorhabditis elegans çok sayıda yetiştirilebilir kolay kullanımlı bir model organizmadır6. Ayrıca, genetik amenability ve şeffaflık vivo canlı görüntüleme için izin verir. Bu protokol, fotobeyazrlama (FRAP) sonrası floresan geri kazanımını kullanarak protein sentezoranlarını saptamak için yapılan metodolojiyi açıklamaktadır. Floresan proteinlerin transgenik ekspresyonundan yararlanıyoruz, ya tüm organizmada ya da belirli dokularda/hücrelerde. Transgenik hayvanlar, yaygın olarak ifade edilen bir genin promoter'ı kullanarak GFP'yi ifade edebilir veya belirli hücre tiplerini hedeflemek için dokuya özgü bir organizatör olabilir. Bu teknik belirli bir proteinprotein sentez oranlarını incelemek için belirli bir organizatör genişletilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Florofororlara hem transkripsiyonel hem de çevirifüzyonu çeşitli dokularda de novo protein çevirisini değerlendirmek için kullanılabilir. Protein sentezi oranları, sitoplazma, mitokondri ve nükleus7gibi farklı hücresel bölmelerde lokalize olan birden fazla protein ailesi için değerlendirilebilir. Aşağıdaki suşlar küresel ve nöronal protein sentezi oranlarını izlemek için kullanılır, N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]

1. De novo protein sentezinin izlenmesi için transgenik nematodların bakımı, senkronizasyonu ve hazırlanması

  1. Yabani tip (wt) ve mutant transgenik nematodların gelişim evrelerini ve büyümesini değerlendirmek için bir diseksiyon stereomikroskop kullanın.
  2. 1. Gün: Escherichia coli (OP50)(Tablo 1)ile tohumlanmış Nematode Büyüme Medya (NGM) plakaları üzerine istenilen floresan muhabiri taşıyan wt ve mutant transgenik hayvanların 10 L4 larvasını seçmek ve aktarmak için solucan toplama kullanın( Tablo 1).
    1. Bir Bunsen brülör üzerinde temas yerinde cam eriterek bir cam Pasteur pipet konik ucuna platin tel takarak bir solucan almak olun. Daha sonra, platin telin ucunu herhangi bir alet (örn. kıskaç veya hafif çekiç) kullanarak spatula şekline düzleştirmek.
    2. E. coli (OP50) bakterisinin tek bir kolonisini 50 mL Luria-Bertani (LB) sıvı ortam içeren bir şişeye dönüştürün ve sallayarak kuvözde 37 °C'de 10 saat büyüyün (200 rpm; Tablo 1). Daha sonra, bakteri kültürü 200 μL ile tohum NGM plakaları. Bakteri çim büyüme sağlamak için oda sıcaklığında bir gecede tohumlu plakalar kuluçka.
  3. Kuluçka ve 20 °C standart sıcaklıkta nematodlar büyümek.
  4. 5. Gün: Plakalar karışık bir transgenik solucan popülasyonu içerir. Taze tohumlu OP50-NGM plakalarında her bir suştan 15 Adet L4 larva seçin ve aktarın.
  5. 6. Gün: FraP tayini yapın ve yetişkinliğin birinci gününde protein sentezhızını izleyin.
  6. Ngm plakaları içeren siklohekmidi olumlu kontrol olarak hazırlayın ve kullanın:
    NOT: Siklohekmidin stok çözeltisini suda 10 mg/mL konsantrasyona seyrelterek hazırlayın. Stok çözeltisi 4 °C'de tutun.
    1. Uv ışığı (222 μW/cm2 yoğunluk) ile tohumlu NGM plakalarını 15 dakika teşhir ederek bakterileri yok edin.
    2. Agar hacminde 500 μg/mL son konsantrasyona bakteriyel tohumlu plakaların üstüne siklohekmid ekleyin.
    3. Tabakların oda sıcaklığında 30 dakika kurumasını bekleyin.
    4. Araç ve siklohekmid içeren plakalarda psod-3GFP ifade eden transgenik nematodların transferi.
    5. 20 °C standart sıcaklıkta 2 saat kuluçka hayvanları.

2. FRAP tsöjen somatik doku muhabirleri pife-2GFP ve psod-3GFP ifade transgenik hayvanlar kullanarak

NOT: Tüm hayvan vücudunda küresel protein sentezhızını izleyin. Bu transkripsiyonel muhabirler farklı ifade düzeyleri mevcut ve her yerde birden fazla somatik dokularda ifade edilir, bağırsak da dahil olmak üzere, farinks ve vücut duvarı kasları.

  1. 1 günlük yetişkin transgenik hayvanları, merkezde 20°L OP50 damlası ile tohumlanmış tek tek NGM plakalarına toplayıp aktarın.
  2. Kapağı çıkarın ve her plakayı bir epifloresan mikroskobunun 20 x objektif lensin altına yerleştirin.
  3. Fotobeyaztlama (ön beyazlatma) yapmadan önce bir referans görüntüsünü odaklayın ve yakalayın.
  4. Photobleach her örnek için 10 dakika.
    NOT: Floresan sinyali ön beyazlatma görüntüsüne göre %30 -%50 yoğunluğuna göre söndürildiğinde fotobeyazlmayı durdurun. Işık yoğunluğu ve beyazlatma süresi muayene altında belirli florofor, hayvan evresi ve hücre veya doku için buna göre ayarlanmalıdır. Farklı numuneler için yeterli miktarda fotobeyazrlama için gerekli ışınlama süresi deneysel olarak belirlenmelidir.
  5. Fotobeyaztma (ağartıcı) sonra bir görüntü yakalayın.
  6. Hayvanları tek tek NGM plakalarında tutun ve onları kurtarın.
  7. Her floresan muhabirin iyileşmesini en az 6 saat boyunca floresan stereomikroskopta görüntüleyin ve kaydedin.
  8. Alternatif olarak, bir epifloresan mikroskobu kullanarak floresan kurtarma değerlendirmesi yapın (örneğin, AksiyoImager Z2).
  9. Önümüzdeki 3 gün boyunca hayvan sağlığını hareket, dokunma hassasiyeti, üreme kapasitesi ve sağkalım larını izleyerek hayvan başına sağlık durumunu dikkatle değerlendirin. Fotobeyaztlama sonrası hasar belirtileri gösteren nematodlar ileri analizdışı bırakıldı.

3. Örneklerin montajı ve pan-nöronal sitoplazmaik GFP, punc-119GFP ifade transgenik nematodlar kullanarak FRAP analizi gerçekleştirmek

NOT: Sinir halkasının bulunduğu baş bölgesinde hedeflenen fotobeyaztlama ile pan-nöronal protein sentezini izleyin.

  1. % 2 agarose pedleri hazırlayın.
  2. Agarose pedin ortasına 10 μL'lik bir M9 arabelleği ekleyin.
  3. Transfer 5 transgenik nematodlar m9 tampon bir damla içine pan-nöronally sitoplazmik GFP ifade.
  4. Sıvı yaymak için bir kirpik kullanın.
    NOT: Hayvanlar agar içine M9 emiciliği nedeniyle 2 dakika içinde azaltılmış hareketleri görüntüler.
  5. Bir "kirpik" çekme kullanarak çakışma önlemek için nematod konumunu değiştirin.
  6. Örneği epifloresan mikroskobunun 40 x objektif lensin altına yerleştirin.
    NOT: Kapak kayması kullanmayın.
  7. Bir referans görüntüsünü odaklayın ve yakalayın (çamaşır suyu).
  8. Photobleach 90 saniye için ilgi hedeflenen alan.
    NOT: Floresan sinyali ön beyazlatma görüntüsüne göre %30 -%50 yoğunluğuna göre söndürildiğinde fotobeyazlmayı durdurun. Işık yoğunluğu ve beyazlatma süresi muayene altında belirli florofor, hayvan evresi ve hücre veya doku için buna göre ayarlanmalıdır. Farklı numuneler için yeterli miktarda fotobeyazrlama için gerekli ışınlama süresi deneysel olarak belirlenmelidir.
  9. Fotobeyaztma (ağartıcı) sonra bir görüntü yakalayın.
  10. Fotobeyaztlı nematodlara 10 μL'lik m9 tamponu ekleyin.
  11. Hayvanlar 5 dakika lığına iyileşsin.
  12. Nematodları merkezde 20 μL OP50 damlaile tohumlanmış tek tek NGM plakalarına aktarmak için "kirpik" pick veya pipet kullanın.
  13. Epifloresan stereomikroskop altında her 1 saatte bir her numunenin görüntüsünü yakalayın.
    NOT: Fotobeyaztlama dan sonraki iyileşme süresi için t=0'ı sayın.

4. FRAP tahlil sırasında yakalanan görüntülerin veri analizi

  1. Edinilen görüntüleri yazılım (örneğin, Fiji) kullanarak analiz edin.
  2. Yazılımla görüntüleri açın.
  3. Görüntü ve Renk açılır menüsünden Kanalları Böl komutunu seçin.
    NOT: Yeşil kanal görüntüsünü saklayın.
  4. Floresan bölgeyi (örn. tüm vücut, baş, bağırsak) manuel olarak ayarlamak için Freehand Selection aracını kullanın.
  5. Her zaman noktası için ilgi alanının ortalama piksel yoğunluğunu ölçmek için Analyze açılır menüsünden Ölçüm komutunu seçin.
    NOT: Floresan geri kazanım yüzdesi fotobeyazlama sonrası çekilen referans görüntüleri kullanılarak hesaplanır.

5. Rapor istatistiksel analiz

  1. Her bir suş ve/veya koşulda en az 20 - 25 nematod kullanın.
    NOT: Üç biyolojik kopya yapılmalıdır.
  2. P < 0.05 ile istatistiksel analiz için istatistiksel analiz için öğrenci t-testi (iki grup arasında karşılaştırma) veya ANOVA (birden fazla grup arasında karşılaştırma) gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada sunulan prosedür kullanılarak, protein sentez oranlarını ilgili protokollere göre değerlendirmek için aşağıdaki somatik muhabirleri ifade eden yabani tip ve mutant transgenik nematodlar, pife-2GFP, psod-3GFP ve punc-119GFP kullanılmıştır. Özellikle ife-2 promotörü kullanılarak somatik dokularında sitoplazmik GFP ifade eden yabani tip ve ife-2 mutant solucanlar fotobeyaztlama dan hemen sonra ve 5 sa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Protein sentezi modülasyonu organizmahomeostaziçin gereklidir. Yaşlanma sırasında, küresel yanı sıra spesifik protein sentezi tedirgin. Son çalışmalar protein çeviri dengesinin yaşlanmayı doğrudan kontrol ettiğini ve yaşlanmanın sadece yaşlanma sürecinin bir yan ürünü olmadığını ortaya koymaktadır. Özellikle, ökaryotik inisiyasyon faktörü 4E (eIF4E) gibi çeviri makinelerinin temel bileşenleri, çeviri başlatma sırasında mRNA kapamasını kolaylaştırır ve böylece kap-bağımlı protein çevirisi oranı oksidatif strese neden olur...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Teşekkürler

Chaniotakis M. ve Kounakis K.'ya video kaydı ve kurgusu için teşekkür ederiz. K.P., Yunanistan Araştırma ve İnovasyon Vakfı (HFRI) ve Araştırma ve Teknoloji Genel Sekreterliği'nin (GSRT) bir bağışı ile finanse edilmektedir. N.T. Avrupa Araştırma Konseyi (ERC – GA695190 – MANNA), Avrupa Komisyonu Çerçeve Programları ve Yunanistan Eğitim Bakanlığı'nın bağışları ile finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgarSigma-Aldrich5040
AgarozBiozym8,40,004
Agaroz pedleri %
Kalsiyum klorür dehidrat (CaCl2?2H2O)Sigma-AldrichC5080
KolesterolSERVA Elektroforezi17101.01
sikloheksimidSigma-AldrichC-7698
Diseksiyon stereomikroskobuNikon CorporationSMZ645
edc-3 (ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4]Tavernarakis labHayvanları 20 derecede koruyun; C
Epifloresan mikroskobuZeissAxio Görüntüleyici Z2
Escherichia coli OP50 suşuCaenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)
Floresan diseksiyon stereomikroskobuZeissSteREO Lumar V12
Greiner Petri kapları (60 x 15 mm)Sigma-AldrichP5237
IFE-2 (OK306); Ex[pife-2GFP, pRF4]Tavernarakis labHayvanları 20 derecede koruyun; C
görüntü analiz yazılımıFijihttps://fiji.sc
KH2PO4EMD Millipore1,37,010
K2HPO<>sub4EMD Millipore1,04,873
LB sıvı ortam
M9 tamponu
Magnezyum sülfat (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
Mikroskop slaytları (75 x 25 x 1 mm)Marienfeld, Lauda-Koenigshofen10 006 12
Microsoft Office 2011 Excel yazılım paketiMicrosoft Corporation, Redmond, USA
em>N2; Ex[pife-2GFP; pRF4]Tavernarakis labHayvanları 20 derecede koruyun; C
N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]Tavernarakis labHayvanları 20 derecede koruyun; C
N2; Ex[punc-119GFP; pRF4]Tavernarakis labHayvanları 20 derecede koruyun; C
Na2HPO4EMD Millipore1,06,586
Nematod büyüme ortamı (NGM) agar plakaları
Nystatin stok çözeltisiSigma-AldrichN3503
PeptonBD, Bacto211677
Fosfat tamponu
Sodyum klorür (NaCl)EMD Millipore1,06,40,41,000
Agar plakaları hazırlamak için standart ekipman (otoklav, Petri kapları, vb.)
Solucanların bakımı için standart ekipman (platin tel çekme, kuluçka makineleri vb.).
istatistiksel analiz yazılımıGraphPad Software Inc., San Diego, ABDGraphPad Prism yazılım paketi
StreptomisinSigma-AldrichS6501
UV CrosslinkerVilber Lourmat BIO-LINK BLX 254
Solucan penası
2<

Kaynaklar

  1. Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
  2. Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).
  3. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  4. Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
  5. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
  6. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  7. Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547(2009).
  8. Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
  9. Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
  10. Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
  11. Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823(2016).
  12. Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648(2019).
  13. Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Protein Sentez HızıFloresan İyileşme FotobeyazlatmaTransgenik SolucanlarFRAP AnaliziSikloheksimid KontrolüEpifloresan MikroskopimRNA TranslasyonuProteostaz YaşlanmasıNöronal GFP Ekspresyonu
Caenorhabditis elegans de novo Protein Sentez Oranlarının Değerlendirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.