Yöntem makalesi

Farelerde Afferent Lenfatik Damarlar Dikerek Lenf Akışını Engelleme

6.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61178

⸱

14 Mayıs 2020

 ,  , 
1Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin Medical University, 2Inflammation Research Network, Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Snyder Institute for Chronic Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Bu makalede

Özet

Afferent lenfatik damarların cerrahi dikiş ile lenf akışını engellemek için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Lenfatik damarlar doku sıvıdengesini korumak ve antijenler, sitokinler ve hücreleri drenaj lenf düğümleri (LNs) taşıyarak bağışıklık koruma optimize kritik öneme vardır. Lenf akıtıcıdamarların işlevini incelerken lenf akışının kesilmesi önemli bir yöntemdir. Murine footpad popliteal lenf düğümleri için afferent lenf damarları (pLNs) iyi pLNs içine lenf drenaj için tek yol olarak tanımlanır. Bu afferent lenfatik damarları niçin seçici olarak pLN'lere lenf akışını önleyebilir. Bu yöntem drenaj pLN lenfatik endotel hücrelerine minimal hasar ile lenf akışında girişim sağlar, afferent lenfatik damarlar, yanı sıra alan etrafında diğer lenfatik damarlar. Bu yöntem lenf etkileri yüksek endotel venülleri nasıl çalışma için kullanılmıştır (HEV) ve LN kemokin ekspresyonu, ve nasıl lenf fonksiyonel lenfatik damarların yokluğunda LN çevreleyen yağ dokusu ile akar. Lenfatik fonksiyonun öneminin giderek daha fazla tanınması ile, Bu yöntem ln mikroçevre ve bağışıklık yanıtları düzenleyen lenfatik damarların işlevini daha da çözmek için daha geniş uygulamalar alacaktır.

Giriş

Lenfatik sistemin mekansal organizasyonu, hücre dışı sıvıyı verimli bir şekilde çıkarmak ve antijenleri ve antijen sunan hücreleri (AAP'ler) drenaj lı LN'lere verimli bir şekilde çıkarmak için yapısal ve fonksiyonel destek sağlar. İlk lenfatik damarlar (lenfatik kılcal damarlar olarak da adlandırılır) sıvıların, hücrelerin ve diğer malzemelerin çevredeki hücre dışı alanlardan etkili bir şekilde toplanmasını kolaylaştıran kesintisiz hücreler arası kavşakları nedeniyle son derece geçirbilebilirdir1. İlk lenfatik damarlar sıkı hücreler arası kavşaklar, sürekli bir bazal membran ve lenfatik kas kapsama sahip lenfatik damarları toplama içine birleştirmek. Lenfatik damarların toplanması, toplanan lenflerin drenaj LN'lerine taşınmasından ve sonunda lenflerin dolaşıma geri dönmesinden sorumludur2,3. Drenaj LN içine lenf itmek toplama lenf damarları afferent lenfatik damarlar4,5,6,7. Afferent lenfatik damarların tıkanıklığı LNs içine lenf akışını engelleyebilir, hangi lenf akışının işlevini incelerken yararlı bir tekniktir.

Önceki çalışmalar lenf akımı antijenler ve AAP'ler taşıma önemli bir rol oynadığını göstermiştir, yanı sıra LN homeostazı korumak. Doku kaynaklı AKO'ların, tipik olarak aktif olarak göç eden dendritik hücreler (DCs) ile T hücrelerini aktive etmek için LN'ye giden varlıklı lenfatik damarların t hücreleri8. Fikir serbest form antijenler, mikroplar veya çözünür antijenler gibi, ln yerleşik AAP'leri etkinleştirmek için LN lenf ile pasif akışsonon yıl içinde kabul kazanıyor olmuştur 9,10,11,12. Lenf ile seyahat serbest form antijenler LN seyahat enfeksiyon dan sonra dakika sürer, ve LN-yerleşik hücre aktivasyonu 20 dakika içinde stimülasyon oluşabilir. Bu çok göç DC'lerin aktivasyonu daha hızlıdır, hangi drenaj LN girmek için 8 saatten fazla sürer9. Bağışıklık koruma başlatmak için antijenler taşıma yanı sıra, lenf de mikroortamını korumak için LN sitokinler ve DCs taşır, ve bağışıklık hücresi homeostaz desteklemek için13,14. Daha önce, afferent lenfatik damarları dikerek lenf akışını engelleme lenfln 15, 16,17homeostatik T hücre ve B hücre homing desteklemek için gerekli HEV fenotip korumak için gerekli olduğunu gösterdi . CCL21LNDC ve T hücre konumlandırma yönlendirir kritik bir kemokin 8,18. Lenf akışının engellenmesi LN'deki CCL21 ekspresyonunu kesintiye uğratur ve LN19'dakiDC ve T hücre konumlandırmasını ve/veya etkileşimini potansiyel olarak kesintiye uğratur. Böylece, lenf akışını niçin bloke etmek, LN'deki bağışıklık yanıtlarını düzenleyen LN mikroortamını bozarak antijen/DC'nin drenaj LN'ye erişimini doğrudan veya dolaylı olarak engelleyebilir. Lenf akışının işlevini daha iyi araştırmak için, pediyeden pLN'ye kadar olan afferent lenfatik damarları dikerek farelerdeki lenf akışını engellemek için deneysel bir protokol(Şekil 1)sunulur. Bu yöntem sağlıklı ve hastalıklı koşullarda lenfatik fonksiyon üzerinde gelecekteki çalışmalar için önemli bir teknik olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan çalışmalarının kurumsal ve devlet etiği ve hayvan işleme komitesi tarafından onaylanması gerekmektedir.  Bu sağkalım dışı bir ameliyat.

1. Malzemelerin hazırlanması

  1. 70 mL 100 etanol ile %100 etanol karıştırılarak 100 mL 70 etanol hazırlayın. Ameliyat öncesi tüm cerrahi araçları otoklav ve sterilizasyon korumak için ameliyat öncesi ve sırasında% 70 etanol araçları tutmak.
  2. Bir enjeksiyon cihazı hazırlayın.
    1. Yaklaşık 30 cm polietilen boru (0,28 mm çapında) kesin. 30 G x 1/2 iğnenin ucunu (a iğnesi) polietilen tüpün bir ucuna bağlayın. Dikkatle başka bir 30 G x 1/2 iğne (iğne B) yerinden ve polietilen boru diğer ucuna kırık tarafı bağlayın.
    2. İğne A'yı 1 mL'lik tüberkülin şırıngasına takın.
      NOT: Bu polietilen boru için, tüpteki 1,6 cm sıvı 1 μL20'yekarşılık gelmektedir.
  3. Tuzlu (bakteriyostatik %0.9 [w/v] sodyum klorür) 10:1 ketamin/ksilazin karışımını (10 mg/mL ketamin ve 1 mg/mL ksilazin) hazırlayın. Kullanmadan önce çözümü taze olarak hazırlayın.

2. Hayvanın ameliyata hazırlanması

NOT: 6−10 haftalık fareler kullanın. Hem dişi hem de erkek fareler kullanılabilir. Bu çalışmada 6−10 haftalık, C57BL/6 dişi fare kullanıldı. Bu yöntem farelerin diğer suşları için uyarlanabilir.

  1. Ketamin/ksilazin karışımının intraperitoneal 250 μL enjekte ederek fareyi anestezi k. Fare tamamen uyuyana kadar bekleyin. Tam anesteziyi algılamak için farenin parmak kıskacına tepki vermemesini sağlayın.
  2. Saç makası ile bacaklar etrafında kürk tıraş.
  3. Bacak etrafında tüydökücü krem uygulayın ve 5 dakika bekleyin. Artık kürk ve pilatif krem nemli bir doku kullanarak silin ve steril su ile bacak temizleyin. Çalışma alanını sterilize etmek için bacağın etrafına %70 etanol püskürtün. Etanol kesi bölgesiyle sınırlı.

3. Afferent lenfatik damarların cerrahi dikiş

NOT: Sağ bacak dikişli ve sol bacak sham kontrol olarak kullanılır. Lenfatik sütür protokolü (adım 3.1−3.8) 20−30 dk sürer.

  1. Fareyi yatkın bir pozisyonda tutun ve sağ bacaktaki operasyon alanını ortaya çıkarmak için cerrahi bantla düzeltin.
  2. Intradermally 5 μL enjekte 1% Evans mavi boya veya 9 cm enjeksiyon cihazı tüp sıvısı ayak takımı içine. Evans mavilenfatik damarlara girmesine yardımcı olmak için ayak yastığına hafifçe masaj yapabilirsiniz.
    NOT: İnsülin şırınga küçük hacimli enjeksiyon için kontrol etmek kolay değildir. Hacim enjeksiyon cihazı kullanılarak daha doğru bir şekilde kontrol edilebilir. Lenfatik damarlar deri altında mavi boya ile görselleştirilmiş. Kapsamlı eğitim ile, her iki afferent lenfatik damarlar yağ dokusunda şeffaf damarlar olarak çıplak gözle görülebilir, Saphenous arter paralel. Kapsamlı eğitim ile, boya potansiyel rahatsızlıkları endişeleri olduğu durumlarda Evans Mavi boya enjekte etmeden damarları dikiş mümkündür.
  3. Bir diseksiyon mikroskobu altında, popliteal fossa alt kenarından 5 mm bir kesi sitesi seçin. Makasla deride küçük bir kesi (~5 mm) yapın. İnce çalışma forsepsleri kullanarak, kesi germek ve toplama lenfdamarları ortaya çıkarmak(Şekil 1A).
    NOT: Gerekirse, lenfatik damarları ortaya çıkarmak için küçük bir deri parçası çıkarılabilir.
  4. Diseksiyon mikroskobu altında pLN'lere giden her iki afferent lenfatik damarı tanımlayın(Şekil 1B).
    NOT: Pedten pLN'ye kadar iki tane varlıklı lenfatik damar vardır. Her ikisi de tamamen lenf akışını engellemek için dikişli olması gerekir.
  5. Bir iğne tutucu kullanarak, ihtiyatlı bir şekilde sütür iğnesini (0.7 metrik veya daha küçük) afferent lenfatik damar ile Safenöz arter arasına yerleştirin ve iğneyi afferent lenfatik damarın etrafına hafifçe çekin. Yavaşça dikiş dizesini çekin ve arkasında dikiş ipi yaklaşık 2 cm bırakın. İğne tutucuyu kullanarak ipi sıkıca bir cerrahın düğümü ile bir lenfatik damarı dikmeye yardımcı olun(Şekil 1C).
    NOT: Kesinin altındaki doku, uzun süre havaya maruz kalarak kuruyabilir. Kesimümkün olduğunca küçük yapmak ve sütürü hızlı bir şekilde yapmak (yani, 5 dk içinde) dokunun kurumasını önleyecektir. Bir pamuklu bez ile tuzlu küçük bir hacim uygulayarak doku nemini koruyun.
  6. Yavaşça hiçbir Evans Mavi boya dikiş site geçer ve daha sonra makas ile aşırı dize kesmek sağlamak için ayak takımı masaj.
  7. Diğer afferent lenfatik damarda(Şekil 1D)aynı dikiş adımlarını (yani, 3.5 ve 3.6 adımlarını) gerçekleştirin. 3.5'te damarları dikmek için kullanılan dikişle deri kesisini kapatın(Şekil 1E).
  8. Sham kontrolü için, intradermally sol ayak takımı% 1 Evans mavi boya 5 μL enjekte ve lenfdamarları görselleştirmek için ayak takımı masaj. Bir eksizyon ile cildi açın ve daha sonra damar(Şekil 1F)dikiş olmadan yara kapatın.
  9. İsteğe bağlı olarak, çalıştırılan fareleri 2−4 saat boyunca izleyin. Bacağın dikiş tarafı uyluk yayılmış Evans Mavi ile ödem göstermelidir, kontrol bacak ayak sınırlı Evans mavi boya gösterecektir. Fareler uyanırsa, ötanaziye kadar anestezi kılması için ek bir ketamin/ksilazin karışımı enjekte edilir.

4. Lenf akışının takibi

  1. Ameliyattan hemen sonra, hem kontrol hem de lenfatik dikişli bacağın ayak altına %2 floresan iyotiyosiyanat (FITC) enjekte edilir.
  2. 400 μL ketamin/ksilazin karışımı ile fareleri ötenazi yapın ve fareler tamamen anestezi aldığında servikal çıkık yapın.
  3. Popliteal fossa dan pLNs toplamak ve dikkatle 2, 6 ve 12 saat FITC enjeksiyonu sonrası diseksiyon mikroskobu altında pLNs etrafında perinodal yağ dokusu kaldırın.
  4. PLN'leri, kriyomold'un yan tarafına bakan medüller sinüs bölgesine en uygun kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğiyle gömün (Şekil 1G,H).
  5. Bir kriyotom kullanarak 20 μm dondurulmuş bölüm hazırlayın.
  6. FITC dağılımını belirlemek için kriyokesitleri konfokal mikroskop altında görüntüleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Lenfatik damar sütür önceki çalışmalarda kullanılmıştır15,16,17,19, lenfatik damarların moleküler biyoloji daha iyi anlaşılmadan önce lenf akışının işlevini incelemek için önemli bir araç olarak görev yaptı. Bloke lenf akımı LN homeostazı keser, Hangi HEVs LN optimal lenfosit homing için gerekli kritik gen ekspresyonu kaybetmeyol açar15,16

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Lenf akışını niçin bloke etmek, sağlıklı ve hastalıklı koşullarda LN'ye antijen teslimatını manipüle etmede geniş uygulamalara sahip olacaktır. Sürekli lenf akışının NN'lerin boşaltIlmesinde bağışıklık yanıtını nasıl düzenlediğini incelemek için antijen doğumunun zamanlamasını kontrol etmek için bu yöntemi kullanmak mümkündür. Lenf akışı kesinti Bu yöntem de lenf etkileri hücre komedizasyonu, hücre aktivasyonu, hücre göçü ve LN hücre hücre etkileşimleri nasıl çalışma için kullanılabilir.

Özell...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Teşekkürler

Yazarlar ava Zardynezhad'a el yazmasının okunması için teşekkür ediyor. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (CIHR, PJT-156035) ve Kanada Yenilik Vakfı SL (32930) ve Yujia Lin için Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81901576) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.9 Sodyum Klorür Salin< / güçlü >BaxterJB1323
< güçlü>% 100 etanol< / güçlü >Greenfield GlobalCalgary Üniversitesi dağıtım hizmetleri UN1170.
< güçlü > tüy dökücü krem< / güçlü >NairNair Hassas Formül Epilasyon Cr & egrave; Tatlı Badem Yağı ve Bebek Yağı ile, 200 ml. Veya benzer bir ürün.
Evans Blue boyaSigma Life ScienceE2129-10G1 ml Evans mavi boya için 10 ml PBS'ye 0,1 g Evans mavisi ekleyin. Evens Blue solüsyonu 0,22 mm'lik filtrelerden süzülecek ve 1 ml'lik alikotlarda steril tutulacaktır.
Floresein izotiyosiyanat izomeri I (FITC)Sigma Yaşam BilimleriF7250-1G
<>güçlüForseps Dumont #3WPI500337
Forseps Dumont #5WPI500233
Enjeksiyon aparatıPolietilen borunun bir ucunu 30G ve zamanlara bağlayın; ½ iğne. İğneye 1 ml'lik bir TB şırınga takın. İğne milini başka bir 30G ve kezden çıkarın; ½ iğne. 30G'nin kör ucunu yerleştirin ve kez; ½ iğne mili borunun diğer ucuna. Bu borunun iç çapı 0,28 mm'dir. Bu nedenle, borudaki 1,6 cm sıvı 1 μl'dir.
İnsülin şırıngası< / güçlü>Becton Dickinson and Company (BD)329461
IRIS Forcep düzWPI15914
IRIS makasWPI14218-G
KetaminNarketanDIN 02374994Ketamin ve Xylazine tedarikçileri genellikle kurumsal ve resmi düzenlemelere tabidir.
< güçlü > İğneler (26Gx3 / 8) < / güçlü >Becton Dickinson ve Şirketi (BD)305110
< güçlü > İğneler (30Gx1 / 2) < / güçlü >Becton Dickinson ve Şirketi (BD) 305106
< güçlü > Paton İğne Tutucu< / güçlü >ROBOZRS6403Düz, Kilitsiz; Tırtıklı
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Sigma Life ScienceP4417-100TAB
Polietilen boruBecton Dickinson and Company (BD)427401
Cerrahi bant (1.25cmx9.1m)Transpore1527-0
Cerrahi bant (2.5cmx9.1m)Transpore1527-1
SütürDavis ve Geck CYANAMID Kanada11/040.7 metrik monofilament polipropilen
Şırınga (1ml)Becton Dickinson and Company (BD)309659
VANNAS makasDünya Hassas Aletleri (WPI)14122-G
Ksilazin< / güçlü>RompunDIN02169606Ketamin ve Ksilazin tedarikçileri genellikle kurumsal ve hükümet düzenlemesi altındadır.
Ekipman< / güçlü >
< güçlü >Diseksiyon mikroskobu< / güçlü >OlympusOlympus S261 (522-STS OH141791) ışık kaynağı ile: Olympus Highlight 3100
Konfokal mikroskop< / güçlü >LeicaSP8

Kaynaklar

  1. Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
  2. Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
  3. Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
  4. Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
  5. Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
  6. Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
  7. Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
  8. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
  9. Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
  10. Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
  11. Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
  12. Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
  13. Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
  14. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
  15. Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
  16. Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
  17. Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
  18. Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
  19. Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
  20. Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6(2014).
  21. Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
  22. Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lenfatik Ak BlokajPopliteal Lenf NodlarFare Ayak TabanS tur Tekni iKonfokal MikroskopiFITC Da l mLenf Nodu Sin sleriPerinodal Adipoz Doku

İlgili makaleler