Farelerde Afferent Lenfatik Damarlar Dikerek Lenf Akışını Engelleme

Lenfatik sistemin mekansal organizasyonu, hücre dışı sıvıyı verimli bir şekilde çıkarmak ve antijenleri ve antijen sunan hücreleri (AAP'ler) drenaj lı LN'lere verimli bir şekilde çıkarmak için yapısal ve fonksiyonel destek sağlar. İlk lenfatik damarlar (lenfatik kılcal damarlar olarak da adlandırılır) sıvıların, hücrelerin ve diğer malzemelerin çevredeki hücre dışı alanlardan etkili bir şekilde toplanmasını kolaylaştıran kesintisiz hücreler arası kavşakları nedeniyle son derece geçirbilebilirdir¹. İlk lenfatik damarlar sıkı hücreler arası kavşaklar, sürekli bir bazal membran ve lenfatik kas kapsama sahip lenfatik damarları toplama içine birleştirmek. Lenfatik damarların toplanması, toplanan lenflerin drenaj LN'lerine taşınmasından ve sonunda lenflerin dolaşıma geri dönmesinden sorumludur^2,3. Drenaj LN içine lenf itmek toplama lenf damarları afferent lenfatik damarlar^4,5,6,7. Afferent lenfatik damarların tıkanıklığı LNs içine lenf akışını engelleyebilir, hangi lenf akışının işlevini incelerken yararlı bir tekniktir.

Önceki çalışmalar lenf akımı antijenler ve AAP'ler taşıma önemli bir rol oynadığını göstermiştir, yanı sıra LN homeostazı korumak. Doku kaynaklı AKO'ların, tipik olarak aktif olarak göç eden dendritik hücreler (DCs) ile T hücrelerini aktive etmek için LN'ye giden varlıklı lenfatik damarların t hücreleri^8. Fikir serbest form antijenler, mikroplar veya çözünür antijenler gibi, ln yerleşik AAP'leri etkinleştirmek için LN lenf ile pasif akış^sonon yıl içinde kabul kazanıyor olmuştur 9^,10,11,12. Lenf ile seyahat serbest form antijenler LN seyahat enfeksiyon dan sonra dakika sürer, ve LN-yerleşik hücre aktivasyonu 20 dakika içinde stimülasyon oluşabilir. Bu çok göç DC'lerin aktivasyonu daha hızlıdır, hangi drenaj LN girmek için 8 saatten fazla sürer^9. Bağışıklık koruma başlatmak için antijenler taşıma yanı sıra, lenf de mikroortamını korumak için LN sitokinler ve DCs taşır, ve bağışıklık hücresi homeostaz desteklemek için^13,14. Daha önce, afferent lenfatik damarları dikerek lenf akışını engelleme lenf^{ln 15, 16,17}homeostatik T hücre ve B hücre homing desteklemek için gerekli HEV fenotip korumak için gerekli olduğunu gösterdi . CCL21^LNDC ve T hücre konumlandırma yönlendirir kritik bir kemokin 8^,18. Lenf akışının engellenmesi LN'deki CCL21 ekspresyonunu kesintiye uğratur ve LN^19'dakiDC ve T hücre konumlandırmasını ve/veya etkileşimini potansiyel olarak kesintiye uğratur. Böylece, lenf akışını niçin bloke etmek, LN'deki bağışıklık yanıtlarını düzenleyen LN mikroortamını bozarak antijen/DC'nin drenaj LN'ye erişimini doğrudan veya dolaylı olarak engelleyebilir. Lenf akışının işlevini daha iyi araştırmak için, pediyeden pLN'ye kadar olan afferent lenfatik damarları dikerek farelerdeki lenf akışını engellemek için deneysel bir protokol(Şekil 1)sunulur. Bu yöntem sağlıklı ve hastalıklı koşullarda lenfatik fonksiyon üzerinde gelecekteki çalışmalar için önemli bir teknik olabilir.

Tüm hayvan çalışmalarının kurumsal ve devlet etiği ve hayvan işleme komitesi tarafından onaylanması gerekmektedir.  Bu sağkalım dışı bir ameliyat.

1. Malzemelerin hazırlanması

1. 70 mL 100 etanol ile %100 etanol karıştırılarak 100 mL 70 etanol hazırlayın. Ameliyat öncesi tüm cerrahi araçları otoklav ve sterilizasyon korumak için ameliyat öncesi ve sırasında% 70 etanol araçları tutmak.
2. Bir enjeksiyon cihazı hazırlayın.
   1. Yaklaşık 30 cm polietilen boru (0,28 mm çapında) kesin. 30 G x 1/2 iğnenin ucunu (a iğnesi) polietilen tüpün bir ucuna bağlayın. Dikkatle başka bir 30 G x 1/2 iğne (iğne B) yerinden ve polietilen boru diğer ucuna kırık tarafı bağlayın.
   2. İğne A'yı 1 mL'lik tüberkülin şırıngasına takın.
      NOT: Bu polietilen boru için, tüpteki 1,6 cm sıvı 1 μL^20'yekarşılık gelmektedir.
3. Tuzlu (bakteriyostatik %0.9 [w/v] sodyum klorür) 10:1 ketamin/ksilazin karışımını (10 mg/mL ketamin ve 1 mg/mL ksilazin) hazırlayın. Kullanmadan önce çözümü taze olarak hazırlayın.

2. Hayvanın ameliyata hazırlanması

NOT: 6−10 haftalık fareler kullanın. Hem dişi hem de erkek fareler kullanılabilir. Bu çalışmada 6−10 haftalık, C57BL/6 dişi fare kullanıldı. Bu yöntem farelerin diğer suşları için uyarlanabilir.

1. Ketamin/ksilazin karışımının intraperitoneal 250 μL enjekte ederek fareyi anestezi k. Fare tamamen uyuyana kadar bekleyin. Tam anesteziyi algılamak için farenin parmak kıskacına tepki vermemesini sağlayın.
2. Saç makası ile bacaklar etrafında kürk tıraş.
3. Bacak etrafında tüydökücü krem uygulayın ve 5 dakika bekleyin. Artık kürk ve pilatif krem nemli bir doku kullanarak silin ve steril su ile bacak temizleyin. Çalışma alanını sterilize etmek için bacağın etrafına %70 etanol püskürtün. Etanol kesi bölgesiyle sınırlı.

3. Afferent lenfatik damarların cerrahi dikiş

NOT: Sağ bacak dikişli ve sol bacak sham kontrol olarak kullanılır. Lenfatik sütür protokolü (adım 3.1−3.8) 20−30 dk sürer.

1. Fareyi yatkın bir pozisyonda tutun ve sağ bacaktaki operasyon alanını ortaya çıkarmak için cerrahi bantla düzeltin.
2. Intradermally 5 μL enjekte 1% Evans mavi boya veya 9 cm enjeksiyon cihazı tüp sıvısı ayak takımı içine. Evans mavilenfatik damarlara girmesine yardımcı olmak için ayak yastığına hafifçe masaj yapabilirsiniz.
   NOT: İnsülin şırınga küçük hacimli enjeksiyon için kontrol etmek kolay değildir. Hacim enjeksiyon cihazı kullanılarak daha doğru bir şekilde kontrol edilebilir. Lenfatik damarlar deri altında mavi boya ile görselleştirilmiş. Kapsamlı eğitim ile, her iki afferent lenfatik damarlar yağ dokusunda şeffaf damarlar olarak çıplak gözle görülebilir, Saphenous arter paralel. Kapsamlı eğitim ile, boya potansiyel rahatsızlıkları endişeleri olduğu durumlarda Evans Mavi boya enjekte etmeden damarları dikiş mümkündür.
3. Bir diseksiyon mikroskobu altında, popliteal fossa alt kenarından 5 mm bir kesi sitesi seçin. Makasla deride küçük bir kesi (~5 mm) yapın. İnce çalışma forsepsleri kullanarak, kesi germek ve toplama lenfdamarları ortaya çıkarmak(Şekil 1A).
   NOT: Gerekirse, lenfatik damarları ortaya çıkarmak için küçük bir deri parçası çıkarılabilir.
4. Diseksiyon mikroskobu altında pLN'lere giden her iki afferent lenfatik damarı tanımlayın(Şekil 1B).
   NOT: Pedten pLN'ye kadar iki tane varlıklı lenfatik damar vardır. Her ikisi de tamamen lenf akışını engellemek için dikişli olması gerekir.
5. Bir iğne tutucu kullanarak, ihtiyatlı bir şekilde sütür iğnesini (0.7 metrik veya daha küçük) afferent lenfatik damar ile Safenöz arter arasına yerleştirin ve iğneyi afferent lenfatik damarın etrafına hafifçe çekin. Yavaşça dikiş dizesini çekin ve arkasında dikiş ipi yaklaşık 2 cm bırakın. İğne tutucuyu kullanarak ipi sıkıca bir cerrahın düğümü ile bir lenfatik damarı dikmeye yardımcı olun(Şekil 1C).
   NOT: Kesinin altındaki doku, uzun süre havaya maruz kalarak kuruyabilir. Kesimümkün olduğunca küçük yapmak ve sütürü hızlı bir şekilde yapmak (yani, 5 dk içinde) dokunun kurumasını önleyecektir. Bir pamuklu bez ile tuzlu küçük bir hacim uygulayarak doku nemini koruyun.
6. Yavaşça hiçbir Evans Mavi boya dikiş site geçer ve daha sonra makas ile aşırı dize kesmek sağlamak için ayak takımı masaj.
7. Diğer afferent lenfatik damarda(Şekil 1D)aynı dikiş adımlarını (yani, 3.5 ve 3.6 adımlarını) gerçekleştirin. 3.5'te damarları dikmek için kullanılan dikişle deri kesisini kapatın(Şekil 1E).
8. Sham kontrolü için, intradermally sol ayak takımı% 1 Evans mavi boya 5 μL enjekte ve lenfdamarları görselleştirmek için ayak takımı masaj. Bir eksizyon ile cildi açın ve daha sonra damar(Şekil 1F)dikiş olmadan yara kapatın.
9. İsteğe bağlı olarak, çalıştırılan fareleri 2−4 saat boyunca izleyin. Bacağın dikiş tarafı uyluk yayılmış Evans Mavi ile ödem göstermelidir, kontrol bacak ayak sınırlı Evans mavi boya gösterecektir. Fareler uyanırsa, ötanaziye kadar anestezi kılması için ek bir ketamin/ksilazin karışımı enjekte edilir.

4. Lenf akışının takibi

1. Ameliyattan hemen sonra, hem kontrol hem de lenfatik dikişli bacağın ayak altına %2 floresan iyotiyosiyanat (FITC) enjekte edilir.
2. 400 μL ketamin/ksilazin karışımı ile fareleri ötenazi yapın ve fareler tamamen anestezi aldığında servikal çıkık yapın.
3. Popliteal fossa dan pLNs toplamak ve dikkatle 2, 6 ve 12 saat FITC enjeksiyonu sonrası diseksiyon mikroskobu altında pLNs etrafında perinodal yağ dokusu kaldırın.
4. PLN'leri, kriyomold'un yan tarafına bakan medüller sinüs bölgesine en uygun kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğiyle gömün (Şekil 1G,H).
5. Bir kriyotom kullanarak 20 μm dondurulmuş bölüm hazırlayın.
6. FITC dağılımını belirlemek için kriyokesitleri konfokal mikroskop altında görüntüleyin.

Lenfatik damar sütür önceki çalışmalarda kullanılmıştır15,16,17,19, lenfatik damarların moleküler biyoloji daha iyi anlaşılmadan önce lenf akışının işlevini incelemek için önemli bir araç olarak görev yaptı. Bloke lenf akımı LN homeostazı keser, Hangi HEVs LN optimal lenfosit homing için gerekli kritik gen ekspresyonu kaybetmeyol açar15,16,17. O zamandan beri, lenf ile seyahat DCs HEV gen ekspresyon profili ve Lenfositler LN13homing bakımında çok önemli olduğunu göstermek için başka bir yirmi yıl sürdü. Lenf akımı tarafından sağlanan kesme stresi LN kemokin ekspresyonu uyarmak için önemlidir. Lenf akışının bloke ln kemokin CCL21 ekspresyonu keser19, LN DC ve T hücre konumlandırma yönlendirmede kritik olan. Bu nedenle, kesintiye akış LN8,18'dedcs ve T hücrelerinin konumlandırılması tehlikeye atabilir.

Ameliyattan hemen sonra, lenf akışını izlemek için küçük bir molekül ağırlığı floresan izleyici, FITC, kullanıldı. FITC (10 μL% 2 FITC) sham kontrol ve lenfatik sütürli bacak ayak takımı intradermally enjekte edildi. Drenaj pLN'leri 2, 6 ve 12 saat sonra toplandı. Drenaj pLN'leri OCT'ye gömülmüş ve 20 μm dondurulmuş kesitler hazırlanmıştır. Konfokal görüntüler, sütür den sonra pLN'lerde FITC birikiminin önemli ölçüde azaldığını gösterdi. PLN'lerde kalan FITC tercihen LN sinüslerde birikmişti (Şekil 2).

LN çevreleyen yağ dokusu üzerinden lenf akar nasıl lenfatik sütür kullanılarak araştırıldı. PLN'lere giden afferent lenfatik damarlar lenf akışını engellemek için dikildi ve lenf damarları bloke edildiğinde perinodal yağ dokusunun az miktarda lenf akışını destekleyebileceği belirlendi21. LN kapsüle yağ dokusu ile lenf akışı eşlenen oldu; LN sinüslerine yem oldu. Az miktarda lenf zamanla LN sinüslerine akmış olabilir(Şekil 3).

Şekil 1: Popliteal LN (pLN) afferent lenfatik damar sütür adımları. Kısaca, fareler ketamin ve ksilazin karışımı ile anestezi edildikten sonra, bacakları tıraş edildi ve artık kürk bir tüy dökücü krem ile kaldırıldı. Sağ bacak dikiş için kullanıldı ve sol bacak sahte kontrol oldu. Ayak takımının sağ tarafına PBS'de hazırlanan %1 Evans Blue boyasının 5 μL'si enjekte edildi. (A) yavaşça ayak takımı masaj tarafından, Evans Mavi boya afferent lenfatik damarları doldurdu. (B) İki beyaz okla gösterilen lenfatik damarları ortaya çıkarmak için pLN'den 5 mm uzakta küçük bir deri kesimi yapıldı. (C,D) Her iki afferent lenfatik damarlar dikişli edildi. (E) Deri eksizyonu dikişlerle kapatılmıştır. (F) Kontrol bacağı nda Lenfdamarları dikmeden Evans mavi enjeksiyonu, deri eksizyonu ve dikiş kapanması saptırı. (G) Lenf akımı tıkanıklığının başarısı, kontrol bacağının pLN'sine giren ancak sütürlü bacağın pLN'sine girilen Evans mavi boyası ile endikedir. (H,I) Toplanan pLN'ler, sıvı nitrojende anımalmadan önce kriyomold'un yan tarafına bakan subkapsüler sinüs (SCS) ve medüller sinüs (MS) ile OCT bileşkesine gömülmüştür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Sahte veya dikişli bacağın drenaj pLN'lerinde FITC dağılımı. FITC enjeksiyonundan sonra 2, 6 ve 12 saat toplanan pLN'lerin konfokal görüntüleri, dikiş sonrası pLN'lerde FITC birikiminin önemli ölçüde azaldığını gösterdi. PLN'lerde kalan FITC tercihen LN sinüslerde bulundu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Perinodal yağ dokusunda FITC dağılımı (PAT), sham veya dikişli bacağın drenaj pLNs etrafında. PAT ve LN konfokal görüntüleri FITC PAT ve LN sinüsler girer ama etkili lenfatik damarlar bloke zaman LN boyunca dağıtılan olmadığını gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.