Burada embriyonik kök hücrelerden nöronlara hızlı ve verimli farklılaşmayı yönlendiren düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir yöntem kurduk. Bu yöntem laboratuvarlar arasında popülerleşmeye uygundur ve nörolojik araştırmalar için yararlı bir araç olabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC' ler) nöral farklılaşması, nörogenezde yer alan temel mekanizmaların aydınlatıcı ve rejeneratif tıbba potansiyel olarak yardımcı olan potansiyel bir araçtır. Burada, kombinatoryal tarama stratejisinikullanarak mESC in vitro'dan nöronal farklılaşma için verimli ve düşük maliyetli bir yöntem oluşturduk. Burada tanımlanan koşullar altında, 2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük retinoik asit indüksiyon protokolü, Nestin pozitif olan iyi istiflenmiş ve neurit benzeri A2lox ve 129 türevin oluşumunda görüldüğü gibi, MESC'lerden sinirsel öncül hücrelere (NPC' ler) hızlı ve verimli bir şekilde farklılaşmaya izin sağlar. Embriyoid cisimlerin sağlıklı durumu ve retinoik asidin (RA) uygulandığı zaman noktası ve RA konsantrasyonları bu süreçte kritik öneme sahiptir. Daha sonraki NPC'lerden nöronlara farklılaşmada, N2B27 orta II (Nörobakal ortam tarafından desteklenmiştir) nöronal hücrelerin uzun süreli bakımını ve olgunlaşmasını daha iyi destekleyebilir. Sunulan yöntem yüksek verimlilik, düşük maliyetli ve kullanımı kolaydır ve nörobiyoloji ve gelişimsel biyoloji araştırmaları için güçlü bir araç olabilir.
Giriş
Embriyonik kök hücreler (ESC' ler) pluripotenttir ve nöral öncül hücrelere (NPC' ler) ve daha sonra belirli koşullar altında nöronlara farklılaşabilir1. ESC tabanlı nörogenez, nörogenez taklit etmek için en iyi platformu sağlar, böylece gelişimsel biyoloji çalışmaları için yararlı bir araç olarak hizmet eder ve rejeneratif tıpta potansiyel olarak yardımcıolunur 2,3. Son on yıllarda, transgenik yöntem 4 , küçük moleküller5,3Dmatris mikroçevrimi 6 ve ortak kültür tekniği7gibi embriyoniknörogene....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Fare embriyonik kök hücre kültürü
- % 0.1 jelatin kaplı hücre kültürü yemekleri veya tabakları hazırlayın.
- 60 mm hücre kültürü yemeklerine 2 mL sterilize edilmiş %0,1 jelatin (suda %0,1 w/v) ekleyin. Hücre kültürü yemeklerinin eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için hafifçe sallayın.
- Bulaşıkları 37 °C'de % 5 CO2 inkübatöre koyun ve 1 saat boyunca kaplamaya izin verin.
- Hücreleri tohumlamadan önce% 0.1 jelatin çözeltisini çıkarın.
NOT: Jelatin çıkarıldıktan sonra, kaplanmış bulaşıkları kurutmaya veya yıkamaya gerek yoktur.
- Fare embriyonik kök hücreleri (A2lox ve 129) kültürü
- %0,1 jelat....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük RA indüksiyonu, mESC'lerin farklılaştırılmasını NPC'lere (Faz I) yönlendirmede en iyi şekilde çalışır. MESC'lerin NPC'lere (Aşama I) farklılaştırılmasını en iyi şekilde destekleyen en uygun protokolü belirlemek için, hem A2lox hem de 129 mESC 'de(Tablo 1)7 protokol test edildi ve her grubun farklılaşma durumu ışık mikroskobu kullanılarak izlendi. Şekil 3A'dagösterildiği gibi , "2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük RA indüksi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada, düşük maliyetli ve kolayca elde edilen malzemelerle, mESC'lerden nöronal farklılaşma için basit ve etkili bir yöntem oluşturduk. Bu yöntemde, 2 günlük embriyoid vücut oluşumu ve ardından 6 günlük RA indüksiyonu, MESC'lerin NPC'lere farklılaştırılmasını etkili bir şekilde teşvik edebilir (Faz I-protokolü 3). Faz II farklılaşması için, N2B27 orta II (Faz II-protokol 3) NPC'lerden nöronlara farklılaşmayı en etkili şekilde teşvik eder. Başarıyı sağlamak için birkaç kritik adıma daha fazla dikkat edilmelidir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31501099) ve Hubei Eyaleti Eğitim Departmanı Orta Yaşlı ve Genç (No. Q20191104). Wuhan Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'nden Profesör Wensheng Deng'e fare embriyonik kök hücre çizgileri A2lox'u sağladığı için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anti-Nestin antikoru [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | -80 ° C'de saklanır; C, tekrarlanan donma ve çözülme |
| Anti-β-Tubulin III antikoru | Sigma Aldrich | T2200'de | üretilen -80 ° C'de saklanır; C, tekrarlanan donma ve çözülmeden kaçının |
| Alexa Fluor 488 Etiketli Keçi Anti-Fare IgG | Beyotime | A0428 | -20 ° C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun |
| B-27 Takviyesi (50X), serumsuz | Gibco | 17504044 | -20 ° C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | -20 ° C'de saklanır; C |
| Lameller | NEST | 801007 | |
| Cy3 Etiketli Keçi Anti-Tavşan IgG | Beyotime | A0516 | -20 °C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun |
| DME/F-12 1: 1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | , 4 > C |
| Fetal sığır serumu | HyClone | SH30084.03 | -20 ° C'de saklanır; C, tekrarlanan donma ve çözülmeyi önleyin |
| Floresan mikroskobu | Olympus | CKX53 | |
| Jelatin | Gibco | CM0635B | oda sıcaklığında saklanır |
| GlutaMAX Takviyesi | Gibco | 35050061 | 4 ° C'de saklanır; C |
| İmmünol Boyama Birincil Antikor seyreltme Tamponu | Beyotime | P0103 | 4 & °C'de saklanır; C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | 4 >'de saklanır; C |
| KnockOut Serum Replasmanı | Gibco | 10828028 | -20 ° C'de saklanır; C, |
| Lösemi İnhibitör Faktörü insan | Sigma | L5283'ün | ; |
| DAPI'li C Montaj Ortamı - Sulu, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | 4 ° C'de saklanır; C ve hafif MEM'den koruyun |
| Esansiyel olmayan amino asit çözeltisi | Gibco | 11140076 | 4 ° C'de saklanır; C |
| N-2 Takviyesi (100X) | Gibco | 17502048 | -20 °C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun |
| Normal keçi serumu | Jackson | 005-000-121 | -20 ° C'de saklanır; C |
| Neurobazal Medium | Gibco | 21103049 | 4 &°C'de saklanır; C |
| Yapışkan olmayan bakteri kabı | Corning | 3262 | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1X) | HyClone | SH30256.01B | , 4 &°C'de saklanır; C |
| Penisilin / Streptomisin Çözeltisi | HyClone | SV30010 | 4 ° C'de saklanır; C |
| PD0325901 (Mirdametinib) | Selleck | S1036 | -20 ° C'de saklanır; C |
| Retinoik asit | Sigma | R2625 | -80 ° C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun |
| Suşu 129 Fare Embriyonik Kök Hücreleri | Siyajen | MUAES-01001 | Besleyicisiz kültür sisteminde muhafaza edilir |
| Kök Hücre Bankacısı (DMSO içermez) | ZENOAQ | kök hücre bankacısı DMSO içermez | -20 ° C'de saklanır; C, tekrarlanan donma ve çözülme işleminden kaçının |
| Tripsin% 0.25 (1X) Çözelti | HyClone | SH30042.01 | 4 & ° C'de saklanır; C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Merkaptoetanol | Gibco | 21985023 | 4 ° C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun |
| %4 paraformaldehit | Beyotime | P0098 | -20 ° C'de saklanır; C |
| 6 - kuyu plakası | Corning | 3516 | |
| 60 mm hücre kültürü kabı | Corning | 430166 | |
| 15 ml santrifüj tüpü | NUNC | 339650 |
Kaynaklar
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
