Yöntem makalesi

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

DOI:

10.3791/61190

⸱

2 Haziran 2020

 , 
1Wuhan Center for Disease Control and Prevention, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada embriyonik kök hücrelerden nöronlara hızlı ve verimli farklılaşmayı yönlendiren düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir yöntem kurduk. Bu yöntem laboratuvarlar arasında popülerleşmeye uygundur ve nörolojik araştırmalar için yararlı bir araç olabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC' ler) nöral farklılaşması, nörogenezde yer alan temel mekanizmaların aydınlatıcı ve rejeneratif tıbba potansiyel olarak yardımcı olan potansiyel bir araçtır. Burada, kombinatoryal tarama stratejisinikullanarak mESC in vitro'dan nöronal farklılaşma için verimli ve düşük maliyetli bir yöntem oluşturduk. Burada tanımlanan koşullar altında, 2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük retinoik asit indüksiyon protokolü, Nestin pozitif olan iyi istiflenmiş ve neurit benzeri A2lox ve 129 türevin oluşumunda görüldüğü gibi, MESC'lerden sinirsel öncül hücrelere (NPC' ler) hızlı ve verimli bir şekilde farklılaşmaya izin sağlar. Embriyoid cisimlerin sağlıklı durumu ve retinoik asidin (RA) uygulandığı zaman noktası ve RA konsantrasyonları bu süreçte kritik öneme sahiptir. Daha sonraki NPC'lerden nöronlara farklılaşmada, N2B27 orta II (Nörobakal ortam tarafından desteklenmiştir) nöronal hücrelerin uzun süreli bakımını ve olgunlaşmasını daha iyi destekleyebilir. Sunulan yöntem yüksek verimlilik, düşük maliyetli ve kullanımı kolaydır ve nörobiyoloji ve gelişimsel biyoloji araştırmaları için güçlü bir araç olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik kök hücreler (ESC' ler) pluripotenttir ve nöral öncül hücrelere (NPC' ler) ve daha sonra belirli koşullar altında nöronlara farklılaşabilir1. ESC tabanlı nörogenez, nörogenez taklit etmek için en iyi platformu sağlar, böylece gelişimsel biyoloji çalışmaları için yararlı bir araç olarak hizmet eder ve rejeneratif tıpta potansiyel olarak yardımcıolunur 2,3. Son on yıllarda, transgenik yöntem 4 , küçük moleküller5,3Dmatris mikroçevrimi 6 ve ortak kültür tekniği7gibi embriyoniknörogenez indüklenmesi için birçok strateji bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokollerin çoğu koşul sınırlı veya kullanımı zordur, bu nedenle çoğu laboratuvarda kullanım için uygun değildir.

MESC'lerden verimli nöral farklılaşma elde etmek için kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir yöntem bulmak için burada bir kombinatoryal tarama stratejisi kullanılmıştır. Şekil 1'deaçıklandığı gibi embriyonik nörogenezin tüm süreci 2 faza ayrılmıştır. Aşama I, MESC'lerden NPC'lere farklılaşma sürecini ifade eder ve faz II, NPC'lerden nöronlara sonraki farklılaşma ile ilgilidir. Kolay kullanım, düşük maliyetli, kolay kullanılabilen malzemeler ve yüksek farklılaşma verimliliği ilkelerine dayanarak, Geleneksel yapışık monolayer kültür sistemine veya embriyoid vücut oluşum sistemine göre Faz I'de yedi protokol ve Faz II'de üç protokol seçilmiştir8,9. Her iki fazda da protokollerin farklılaşma verimliliği hücre morfolojisi gözlemi ve immünofluoresans tahlilleri kullanılarak değerlendirildi. Her aşamanın en verimli protokolünü birleştirerek, mESC'lerden nöral farklılaşma için optimize edilmiş yöntemi oluşturduk.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fare embriyonik kök hücre kültürü

  1. % 0.1 jelatin kaplı hücre kültürü yemekleri veya tabakları hazırlayın.
    1. 60 mm hücre kültürü yemeklerine 2 mL sterilize edilmiş %0,1 jelatin (suda %0,1 w/v) ekleyin. Hücre kültürü yemeklerinin eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için hafifçe sallayın.
    2. Bulaşıkları 37 °C'de % 5 CO2 inkübatöre koyun ve 1 saat boyunca kaplamaya izin verin.
    3. Hücreleri tohumlamadan önce% 0.1 jelatin çözeltisini çıkarın.
      NOT: Jelatin çıkarıldıktan sonra, kaplanmış bulaşıkları kurutmaya veya yıkamaya gerek yoktur.
  2. Fare embriyonik kök hücreleri (A2lox ve 129) kültürü
    1. %0,1 jelatin kaplı 60 mm hücre kültürü yemeklerindeki mESC hücrelerini sırasıyla %5 CO2 inkübatöründe 37 °C'de 37 °C'de kuluçkaya yatırın. mESC büyüme ortamı% 85 nakavt DMEM / F12, 15% Nakavt serum replasmanı (KSR), 0.1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, %1 esansiyel olmayan amino asit (NEAA), %1 penisilin/streptomisiyan (P/S), 1000 U/mL lösemi inhibitör faktörü (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3 inhibitörü) ve 0,33 nM PD0325901 (MEK inhibitörü).
      DİkKAT: β-mercaptoethanol yanıcıdır ve soluma toksisitesi vardır. Yangın kaynaklarından uzak durun ve kullanırken teneffüsten kaçınmak için maske takın.
    2. A2lox ve 129'un daha iyi büyümesi için mESC büyüme ortamını günlük olarak değiştirin.
    3. Hücreler% 80 izdihama ulaştığında, ortamı çıkarın ve yemeğe% 0.1 tripsin 1 mL ekleyin. Tüm hücrelerde tripin kapağını bile sağlamak için 30 sn hafifçe sallayın.
    4. Trypsinize için hücreleri yaklaşık 1 dakika bekletin ve ardından 1 mL pipet kullanarak tripsin çıkarın.
    5. Yemeğe 2 mL mL mESC büyüme ortamı ekleyin, tek bir hücre süspansiyonu yapmak için birkaç kez pipet yukarı ve aşağı.
    6. Hemositometre kullanarak süspansiyondaki hücrelerin yoğunluğunu mümkün olduğunca doğru bir şekilde sayın.
    7. Hücreleri 7 gruba ayırın ve Tablo 1'degösterilen farklı protokolleri kullanarak farklılaşmaya neden olan.

2. MESC'lerden NPC'lere farklılaşma (Aşama I)

  1. % 0.1 jelatin kaplı hücre kültürü plakaları veya kapak örtüleri hazırlayın.
    1. Kullanmadan önce, adım 1.1'deki gibi% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları veya kapaklar hazırlayın.
  2. Protokol 1 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)
    1. %0,1 jelatin kaplı 6 kuyulu plakalarda kuyu başına 2 mL bazal farklılaşma ortamında yaklaşık 2 x 104 mESC tohum. Mikroskop altında hücre yoğunluğunu kontrol edin.
    2. Hücreleri 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörde 6 saat boyunca inkübatöre sokun.
    3. Bağlanmadan sonra, inkübatörden hücreleri çıkar ve hücreleri 2 mL PBS ile iki kez yıkayın.
    4. Her kuyuya 2 mL bazal farklılaşma ortamı I (Tablo 1) ekleyin ve hücreleri tekrar inkübatöre koyun.
    5. Hücreleri 8 gün boyunca farklılaşma için bırakın. Bazal farklılaşma ortamı I'yi her 2 günde bir değiştirin.
  3. Protokol 2 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)
    1. %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de embriyoid vücut oluşumuna izin vermek için 10 mL bazal farklılaşma ortamı I'de yapışkan olmayan bir bakteri kabına 1,5 x 106 mESC ekleyin.
    2. 2 gün sonra, hücre agregalarını 15 mL santrifüj tüplerine aktarın ve yerçekimi ile yerleşmelerini bırakın.
    3. Süpernatant çıkarın ve embriyoid vücutları yeniden depolamak için 10 mL taze bazal farklılaşma ortamı I ekleyin. Onları yeni bir nonadhesive bakteri kabına yeniden dikin ve 2 gün daha farklılaşmaya izin verin.
    4. Mikroskop altında embriyoid cisimlerinin oluşumunu kontrol edin (Şekil 2A).
    5. Embriyoid cisimleri 2.3.2-2.3.3 adımlarında açıklandığı gibi toplayın. %0,1 jelatin kaplı 6 kuyu plakası üzerine kuyu başına 2 mL bazal farklılaşma ortamında yaklaşık 50 embriyoid cisim tohum.
    6. 1 mM all-trans RA stoğu hazırlayın (DMSO'da) ve alt ambalajdan sonra -80 °C dondurucuda ışıktan uzak saklayın.
      NOT: RA kararsızdır ve RA stoğunun hazırlanması sırasında ışıktan uzak tutmaya ve hava temasını azaltmaya dikkat edilmelidir.
    7. RA indüksiyonu için, 1 μM'lik son bir konsantrasyon yapmak için her kuyuya 2 μL RA stoğu ekleyin.
    8. Plakayı 37 °C'de % 5 CO2 inkübatöre yerleştirin ve 4 gün daha ayırt edin.
    9. 2 mL bazal farklılaşma ortamı I'nin tamamını (1 μM RA ile) her 2 günde bir değiştirin.
  4. Protokol 3 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)
    1. Bitki 1.5 x10 6 mESC'yi 10 mL bazal farklılaşma ortamında yapışkan olmayan bir bakteri kabına yerleştirin I. %5 CO 2 inkübatörde 37 °C'de embriyoid vücut oluşumu için2 gün bekletin.
    2. Mikroskop altında embriyoid cisimlerinin oluşumunu kontrol edin (Şekil 2B).
    3. Hücre agregalarını 15 mL santrifüj tüplerine aktarın ve yerçekimi ile yerleşmelerine izin verin.
    4. Süpernatant'ı dikkatlice çıkarın ve yeniden depolamak için 10 mL taze bazal farklılaşma ortamı I ekleyin.
    5. Yaklaşık 50 embriyoid cisimini% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakalarına kuyu başına 2 mL bazal farklılaşma ortamına tohumlayın.
    6. RA indüksiyonu için, 1 μM'lik son bir konsantrasyon yapmak için her kuyuya 2 μL RA stoğu ekleyin.
    7. Plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin ve 6 gün daha ayırt edin. Tüm bazal farklılaşma ortamı I'yi (1 μM RA ile) her 2 günde bir değiştirin.
  5. Protokol 4 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)
    1. Tohum yaklaşık 2 x10 4 mESC içinde 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin.
    2. Bağlanmadan sonra, hücreleri 2 mL PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyuya 2 mL bazal farklılaşma ortamı I ekleyin ve 37 °C'deki %5 CO 2 inkübatörde4 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.
    3. RA indüksiyonu için, 4 gün daha farklılaşmayı teşvik etmek için her kuyuya 2 μL all-trans RA stoğu ekleyin (çalışma konsantrasyonu 1 μM'dir).
    4. Tüm süreçte, tüm ortamı her 2 günde bir değiştirin.
  6. Protokol 5 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)
    1. Tohum yaklaşık 2 x10 4 mESC içinde 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin.
    2. Hücreleri 2 mL PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyuya 2 mL bazal farklılaşma ortamı I ekleyin ve 37 °C'deki %5 CO 2 inkübatörde2 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.
    3. Sonraki RA indüksiyonu için, 1 μM'lik son bir konsantrasyon yapmak için her kuyuya2 μL RA stoğu ekleyin.
    4. Tüm süreçte, tüm ortamı her 2 günde bir değiştirin.
  7. Protokol 6 (Tablo 1) kullanılarak Aşama I farklılaşması
    1. Embriyoid cisimlerin oluşumuna izin vermek için10 mL N2B27 orta II 'de (Tablo 1) yapışkan olmayan bir bakteri kabına1,5 x 10 6mESC yerleştirin.
    2. 2. günde, 2.3.2-2.3.3 adımlarında açıklandığı gibi hücre agregalarını toplayın ve 10 mL taze N2B27 orta II kullanarak embriyoid gövdeleri yeniden uygulayın.
    3. Onları yeni bir nonadhesive bakteri kabına yeniden dikin ve 37 °C'deki% 5 CO 2 inkübatörde2 gün daha farklılaşmaya izin verin. Mikroskop altında embriyoid cisimlerinin oluşumunu kontrol edin.
    4. 4. günde embriyoid vücutları toplayın. 2 mL N2B27 orta II ile% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine kuyu başına yaklaşık 50 embriyoid gövdesi tohumlayın.
    5. Her kuyuya 2 μL all-trans RA stoğu ekleyin ve 4 gün daha farklılaşmaya neden olan. Her iki günde bir tüm ortamı (N2B27 orta II, 1 μM RA ile) değiştirin.
  8. Protokol 7 kullanılarak Aşama I farklılaşması (Tablo 1)
    1. Tohum yaklaşık 2 x10 4 mESC içinde 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin.
    2. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, her kuyuya 2 mL N2B27 orta II ekleyin ve% 5 CO 2 inkübatörde 37 ° C'de8 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.
    3. N2B27 orta II'nin tamamını her 2 günde bir değiştirin.

3. Hücre morfolojisi gözlemi

  1. Ters faz kontrastı ışık mikroskobu altında yukarıda belirtilen 7 grubun günlük farklılaşma durumunu kontrol edin.
  2. En az 12 alanı rastgele seçin ve her grubun morfolojik değişikliklerini D8'e kaydetmek için fotoğraf çekin.

4. İmmünofluoresans boyama

  1. Örnek hazırlama: %0,1 jelatin kaplı kapaklarda tohum mESC'leri ve adım 2'de belirtilen protokolleri kullanarak 8 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.
  2. Durulama:8. günde, örnekleri inkübatörden çıkarın ve ayırma ortamını aspirasyonla çıkarın. Hücreleri 1 mL PBS ile bir kez 5 dakika boyunca hafifçe durulayın.
  3. Fiksasyon: Her numuneye 1 mL%4 paraformaldehit ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında (RT) 20 dakika sabitleyin.
  4. Durulama: Sabitlemeden sonra, hücreleri her biri 5 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.
  5. Permeabilizasyon: Pbs'de %0,2 TritonX-100'ün 1 mL'sini her örneğe ekleyin ve RT'de 8 dakika bekletin.
  6. Durulama: Permeabilizasyondan sonra, hücreleri her biri 5 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.
  7. Engelleme: Her örneğe PBS'de %10 keçi serumunun 1 mL'sini ekleyin ve spesifik olmayan etkileşimleri engellemek için RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  8. Primer antikor ile inkübasyon
    1. PBS'de %5 keçi serumu kullanarak anti-Nestin antikoru 1:100 oranında seyreltin.
    2. Farklı örneklere 500 μL seyreltilmiş antikor uygulayın ve 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
  9. Durulama: Antikoru çıkarın ve örnekleri her biri 8 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.
  10. sekonder antikor ile inkübasyon
    1. PBS'de %5 keçi serumu kullanarak Alexa Fluor 488 etiketli keçi fare önleyici IgG'yi 1:500 oranında seyreltin.
    2. Farklı örneklere 500 μL seyreltilmiş antikor uygulayın ve RT'de 2 saat boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın.
      NOT: Floresan sekonder antikor uyguladıktan sonra, floresan söndürmeyi önlemek için karanlıkta sonraki tüm adımları uygulayın.
  11. Durulama: İkincil antikoru çıkarın ve örnekleri her biri 8 dakika boyunca 3 kez 1 mL PBS ile hafifçe durulayın.
  12. Nükleer boyama ve montaj
    1. Temiz mikroslide üzerine bir damla DAPI montaj ortamı yerleştirin.
    2. Plakalardan numuneleri dikkatlice alın ve numuneyi hücre yüzü aşağı bakacak şekilde DAPI montaj ortamının üzerine yerleştirin. RT'de 5 dakika karanlıkta bırakın.
    3. Fazla DAPI montaj ortamını emici kağıtla çıkarın.
  13. Floresan mikroskopi gözlemi
    1. Numuneleri floresan mikroskopinin altına yerleştirin ve uygun filtreler kullanarak DAPI ve Alexa Fluor 488 sinyalini algılayın.
    2. Her örnek için eşit ve rastgele 10-15 farklı görsel alan seçin ve görüntüleri bir CCD kamera ile kaydedin.

5. NPC'lerden nöronlara farklılaşma (Faz II)

  1. MESC türevlerini, en yüksek farklılaşma verimliliğine sahip adım 2.4'te ayrıntılı olarak belirtildiği gibi protokol 3 (8 gün, Tablo 1)kullanarak Faz I farklılaşması altında hazırlayın (Bkz. Şekil 3).
    NOT: Faz I farklılaşmasından sonra, sağlıklı ve yüksek verimli bir NPC sağlamak için yukarıda belirtilen hücre morfolojisi gözlemi ve immünofluoresans tahlil kullanılarak kalite kontrolü yapılmalıdır.
  2. Tohum yaklaşık 5 x10 5 mESC türevleri 2 mL bazal farklılaşma ortamı I kuyu başına% 0.1 jelatin kaplı 6 kuyu plakaları üzerine. mESC türevlerini sırasıyla Aşama II protokol 1, protokol 2 ve protokol 3 olarak rastgele 3 gruba ayırın.
  3. Plakayı 6 saat boyunca bağlanmaya izin vermek için 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörüne yerleştirin. 2 mL PBS ile iki kez yıkayın.
  4. Yukarıdaki grupların her kuyusuna sırasıyla 2 mL bazal farklılaşma ortamı I, N2B27 orta I veN2B27orta II ( Tablo 2 ) ekleyin.
  5. Plakaları inkübatöre yerleştirin ve 10 gün daha ayırt etmeye bırakın. İlgili ortamı her 2 günde bir değiştirin.
  6. Farklılaşma durumunu denetleyin ve 3.
  7. 18. günde, nöronların neslini değerlendirin (β-Tubulin III pozitif) ve 4.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük RA indüksiyonu, mESC'lerin farklılaştırılmasını NPC'lere (Faz I) yönlendirmede en iyi şekilde çalışır. MESC'lerin NPC'lere (Aşama I) farklılaştırılmasını en iyi şekilde destekleyen en uygun protokolü belirlemek için, hem A2lox hem de 129 mESC 'de(Tablo 1)7 protokol test edildi ve her grubun farklılaşma durumu ışık mikroskobu kullanılarak izlendi. Şekil 3A'dagösterildiği gibi , "2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük RA indüksi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, düşük maliyetli ve kolayca elde edilen malzemelerle, mESC'lerden nöronal farklılaşma için basit ve etkili bir yöntem oluşturduk. Bu yöntemde, 2 günlük embriyoid vücut oluşumu ve ardından 6 günlük RA indüksiyonu, MESC'lerin NPC'lere farklılaştırılmasını etkili bir şekilde teşvik edebilir (Faz I-protokolü 3). Faz II farklılaşması için, N2B27 orta II (Faz II-protokol 3) NPC'lerden nöronlara farklılaşmayı en etkili şekilde teşvik eder. Başarıyı sağlamak için birkaç kritik adıma daha fazla dikkat edilmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31501099) ve Hubei Eyaleti Eğitim Departmanı Orta Yaşlı ve Genç (No. Q20191104). Wuhan Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'nden Profesör Wensheng Deng'e fare embriyonik kök hücre çizgileri A2lox'u sağladığı için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-Nestin antikoru [Rat-401]AbcamAb11306-80 ° C'de saklanır; C, tekrarlanan donma ve çözülme
Anti-β-Tubulin III antikoruSigma AldrichT2200'deüretilen -80 ° C'de saklanır; C, tekrarlanan donma ve çözülmeden kaçının
Alexa Fluor 488 Etiketli Keçi Anti-Fare IgGBeyotimeA0428-20 ° C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun
B-27 Takviyesi (50X), serumsuzGibco17504044-20 ° C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun
CHIR-99021 (CT99021)SelleckS1263-20 ° C'de saklanır; C
LamellerNEST801007
Cy3 Etiketli Keçi Anti-Tavşan IgGBeyotimeA0516-20 °C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun
DME/F-12 1: 1 (1x)HyCloneSH30023.01B, 4 > C
Fetal sığır serumuHyCloneSH30084.03-20 ° C'de saklanır; C, tekrarlanan donma ve çözülmeyi önleyin
Floresan mikroskobuOlympusCKX53
JelatinGibcoCM0635Boda sıcaklığında saklanır
GlutaMAX TakviyesiGibco350500614 ° C'de saklanır; C
İmmünol Boyama Birincil Antikor seyreltme TamponuBeyotimeP01034 & °C'de saklanır; C
KnockOut DMEM/F-12Gibco126600124 >'de saklanır; C
KnockOut Serum ReplasmanıGibco10828028-20 ° C'de saklanır; C,
Lösemi İnhibitör Faktörü insanSigmaL5283'ün;
DAPI'li C Montaj Ortamı - Sulu, FluoroshieldAbcamab1041394 ° C'de saklanır; C ve hafif MEM'den koruyun
Esansiyel olmayan amino asit çözeltisiGibco111400764 ° C'de saklanır; C
N-2 Takviyesi (100X)Gibco17502048-20 °C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun
Normal keçi serumuJackson005-000-121-20 ° C'de saklanır; C
Neurobazal MediumGibco211030494 &°C'de saklanır; C
Yapışkan olmayan bakteri kabıCorning3262
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1X)HyCloneSH30256.01B, 4 &°C'de saklanır; C
Penisilin / Streptomisin ÇözeltisiHyCloneSV300104 ° C'de saklanır; C
PD0325901 (Mirdametinib)SelleckS1036-20 ° C'de saklanır; C
Retinoik asitSigmaR2625-80 ° C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun
Suşu 129 Fare Embriyonik Kök HücreleriSiyajenMUAES-01001Besleyicisiz kültür sisteminde muhafaza edilir
Kök Hücre Bankacısı (DMSO içermez)ZENOAQkök hücre bankacısı DMSO içermez-20 ° C'de saklanır; C, tekrarlanan donma ve çözülme işleminden kaçının
Tripsin% 0.25 (1X) ÇözeltiHyCloneSH30042.014 & ° C'de saklanır; C
Triton X-100SigmaT8787
2-MerkaptoetanolGibco219850234 ° C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun
%4 paraformaldehitBeyotimeP0098-20 ° C'de saklanır; C
6 - kuyu plakasıCorning3516
60 mm hücre kültürü kabıCorning430166
15 ml santrifüj tüpüNUNC339650
tavşan -20 ° C'de saklanan tekrarlanan dondurulmasını ve çözülmesini önleyin

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
  2. Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
  3. Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
  4. Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
  5. Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
  6. Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
  7. Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
  8. Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
  9. Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823(2015).
  10. Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486(2020).
  11. Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
  12. Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57(2009).
  13. Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
  14. Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
  15. Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
  16. Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953(2017).
  17. Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
  18. Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
  19. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  20. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174(2011).
  21. Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Embriyoid G vde Olu umuRetinoik Asit nd ksiyonuN ral Prek rs r H crelerN2B27 Ortammm nofloresan AnaliziNestin Pozitif H crelerBeta T b linJelatin Kapl Plakalar

İlgili makaleler