Yöntem makalesi

Aspergillus oryzae'nin oksotrofik bir mutantı kullanılarak heterolog proteinlerin üretimini değerlendirmek için doğrudan sıvı kültür taraması

2.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61219

⸱

12 Mayıs 2020

 , 
1Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

Bu makalede

Özet

Heterolog proteinlerin salgı üretiminin değerlendirilmesi için kullanıldığında, filamentli mantar Aspergillus oryzae'nin polietilen glikol (PEG) aracılı protoplast dönüşümü için gereken süreyi önemli ölçüde azaltan bir doğrudan sıvı kültür (DLC) tarama yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntem, değerlendirme protokolünün verimini önemli ölçüde artırır.

Özet

Filamentli bir mantar olan Aspergillus oryzae, büyük ölçekli protein üretimi de dahil olmak üzere endüstriyel uygulamalar için en yaygın kullanılan konakçılardan biridir. Heterolog genlerin A. oryzae'ye sokulması için genellikle polietilen glikol (PEG) aracılı bir protoplast transformasyon yöntemi kullanılır. Konvansiyonel yöntem, uygun dönüştürücülerin taranması için tipik olarak üç hafta gerektirir. Burada, tarama süresini 200 mL'lik bir şişe formatında altı güne veya 24 oyuklu bir mikroplaka formatında 10 güne indiren yeni bir teknik olan doğrudan sıvı kültür (DLC) tarama yöntemi tanıtılmaktadır. DLC tarama yöntemi, bunun için iki ayrı adımın gerekli olduğu geleneksel tarama yönteminden farklı olarak, pozitif transformatörlerin elde edilmesini ve heterolog proteinlerin salgı üretiminin değerlendirilmesini sağlar. Beş adımdan oluşan A. oryzae'nin PEG aracılı protoplast dönüşümü için protokol açıklanmaktadır: taze spor süspansiyonunun hazırlanması, ön kültür, protoplastların hazırlanması, DNA'nın eklenmesi ve DLC taraması. DLC taramasında başarılı sonuçlar için, optimize edilmiş ozmotik basınca sahip, besin açısından zengin bir ortam kullanmak çok önemlidir. Protokol, A. oryzae'nin endüstriyel protein üretiminde tercih edilen bir ev sahibi olarak kullanımını daha da yaygınlaştırmalıdır.

Giriş

Aspergillus oryzae, Japon gıda endüstrisinde 1.000 yılı aşkın bir süredir sake (pirinç şarabı), shoyu (soya sosu) ve miso (soya fasulyesi ezmesi) gibi fermente gıdaların üretiminde kullanılan önemli bir mikroorganizmadır1,2. Proteazlar ve amilazlar gibi büyük miktarda protein salgılama yeteneğine sahiptir3. A. oryzae için genom dizisi bilgisi de mevcuttur4. Ayrıca, bu mantar 5,6,7,8,9,10 için güçlü ve pratik olarak kullanışlı genetik mühendisliği teknikleri kurulmuştur. Uygun transformantlar, heterolog proteinlerin 11,12,13,14 salgı üretimi için konakçı olarak kullanılmıştır.

Elektroporasyon, Agrobakteri aracılı transformasyon ve polietilen glikol (PEG) aracılı protoplast transformasyonu, heterolog genleri A. oryzae 15,16,17'ye sokmak için kullanılan tekniklerdir. PEG aracılı protoplast transformasyon yöntemi, ilk olarak 1979'da Neurospora crassa için bildirildiğinden beri yaygın olarak kullanılmaktadır18. Bu yöntemde protoplastlar hazırlanır ve PEG ve hücrelere verilecek olan heterolog gen ile karıştırılır. Protoplastların duvarları enzimatik olarak tehlikeye girer, bu da hücreleri fiziksel strese ve ozmotik basınçtaki değişikliklere karşı savunmasız hale getirir19,20. Heterolog proteinlerin salgı üretiminde kullanılan geleneksel tarama yöntemi üç adım içerir: pozitif dönüştürücülerin elde edilmesi (yumuşak agar plakası üzerinde), doğru ve yanlış dönüştürücülerin seçimi (agar plakası üzerinde) ve heterolog proteinlerin salgı üretiminin değerlendirilmesi (sıvı kültürde); bu adımların her biri yedi gün sürer (Şekil 1). Bu nedenle, geleneksel yöntem tipik olarak yaklaşık üç hafta gerektirir.

Transforme olmuş A. oryzae hücrelerinin taranması için gereken süre, biyoteknoloji araştırmalarında yaygın olarak kullanılan diğer mikroorganizmalar için gerekenden çok daha uzundur ve bu da süreci daha hantal hale getirir. Örneğin, Escherichia coli'yi bir konakçı olarak kullanırken, DNA'nın girişinden etkisinin doğrulanmasına kadar yaklaşık iki gün sürer21.

Yukarıda belirtildiği gibi A. oryzae'nin kullanımıyla ilişkili sınırlamayı aşmak için, burada, heterolog proteinlerin salgı üretiminin değerlendirilmesi için daha hızlı ve basit bir tarama sağlayan yeni bir doğrudan sıvı kültür (DLC) tarama yöntemi tanıtılmaktadır (Şekil 1). DLC yönteminde, bir üridin oksotrofik mutant ve besin açısından zengin bir sıvı ortam kullanılır. Bu yöntem kullanılarak, tarama adımı, DNA'nın 200 mL'lik bir şişe formatında protoplastlara girmesinden sonraki altı gün içinde veya 24 oyuklu bir mikroplaka formatında 10 gün içinde tamamlanabilir. Ayrıca, bu yöntemde agar plakası ortamının zaman alıcı ve zahmetli bir şekilde hazırlanmasına gerek yoktur. Özellikle geleneksel yöntemin iki farklı ortam gerektirdiği gerçeği göz önüne alındığında, yeni açıklanan yöntemin kullanılmasında büyük bir avantaj vardır: dikkatli kullanım ve sıcaklık kontrolü gerektiren pozitif transformatörlerin elde edilmesi için yumuşak agar plakası ve gerçek dönüştürücülerin seçimi için katı agar plakası.

figure-introduction-1
Şekil 1: Filamentli mantar Aspergillus oryzae'nin polietilen glikol (PEG) aracılı protoplast dönüşümünün şeması.
(Üst panel) Konvansiyonel tarama yöntemi. (Alt panel) Doğrudan sıvı kültür (DLC) tarama yöntemi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Taze spor süspansiyonunun hazırlanması

  1. 20 mM üridin ile Czapek-Dox (CD) ortamı içeren bir kültür plakasının ortasına 20 μL bir stok spor süspansiyonu (1 x 107 spor / mL) aşılayın (20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavlanmış, Tablo 1).
  2. Spor oluşumunu teşvik etmek için 30 ° C'de 7 gün inkübe edin.
  3. Sporları içeren kültür plakasına 1.5 mL %0.01 Tween 20 solüsyonu (121 ° C'de 20 dakika otoklavlanmış) ekleyin ve sporları bir hücre yayıcı ile kazıyarak süspanse edin.
  4. Spor süspansiyonunu bir pipet kullanarak steril bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
  5. Süspansiyonu kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
    NOT: Spor süspansiyonunu 2 hafta içinde aşağıdaki prosedürde kullanın. Uzun süreli depolama için bir stok yapmak için, spor süspansiyonuna %15'lik bir nihai konsantrasyona kadar gliserol ekleyin ve -80 °C'de saklayın.

2. Kültür öncesi

  1. 500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine 100 mL polipton-dekstrin (PD) ortamı (Tablo 2) ekleyin ve 121 ° C'de 20 dakika otoklavlayın.
  2. Ortamın sıcaklığının düştüğünü doğruladıktan sonra, gözenek boyutu 0.22 μm olan bir filtreden geçirilerek sterilize edilen üridin solüsyonunu 20 mM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
  3. Adım 1.4'te hazırlanan 200 μL spor süspansiyonu (1 x 107 spor/mL) ekleyin ve 36 saat boyunca 120 rpm'de çalkalayarak 30 °C'de inkübe edin.

3. Protoplastların hazırlanması

  1. Adım 2.3'te hazırlanan mantar biyokütlesini, gözenek boyutu 30 μm olan bir cam filtrede hasat edin (121 ° C'de 20 dakika boyunca otoklavlanır).
  2. Cam filtrenin üzerine 100 mL damıtılmış su (DW) (121 °C'de 20 dakika otoklavlanmış) dökün ve bir spatula ile birkaç kez karıştırın (121 °C'de 20 dakika otoklavlanmış).
  3. DW ile yıkadıktan sonra, 100 mL sodyum klorür (NaCl) tamponunu (121 °C'de 20 dakika otoklavlanmış, Tablo 3) cam filtreye dökün ve bir spatula ile birkaç kez karıştırın.
  4. Hücrelerin yaklaşık 1-2 mL'sini (ıslak hacim) bir spatula kullanarak 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın (121 ° C'de 20 dakika boyunca otoklavlanır).
  5. 50 mL'lik konik bir tüpe 15 mL enzim çözeltisi (0.22 μm gözenek büyüklüğünde bir filtreden geçirilerek sterilize edilmiş, Tablo 4) ekledikten sonra, toplam hacim 30 mL'ye ulaşana kadar NaCl tamponu ekleyin.
  6. Kapağı kapatın ve parafin film ile kapatın. 30 °C'de 60 rpm'de 2 saat çalkalayarak inkübe edin.
  7. Elde edilen çözeltiyi, reaksiyona girmemiş miseliyi çıkarmak için 50 mL'lik konik tüpe bağlı 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
  8. Protoplast çözeltisini 50 mL'lik bir konik tüpte 2.150 x g ve 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleyin.
  9. Peletin yerinden çıkmasını önlemek için süpernatanı nazikçe atın. 1 mL buz gibi soğuk sterilize çözelti B ekleyin (20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavlanmış, Tablo 5) ve çökelmiş protoplastları pipetleme ile yavaşça süspanse edin.
  10. Askıya alınan protoplastları steril 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
  11. 2.220 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Ardından, 1 mL buz gibi soğuk çözelti B ekleyin ve peleti pipetleyerek nazikçe süspanse edin.
  12. Adım 3.9'u tekrarlayın.
  13. Bir hemositometre kullanarak, mikroskop altında protoplastların sayısını ölçün.
  14. Çözelti B'de bir protoplast süspansiyonu (1−3 x 107 protoplast / mL) hazırlayın ve kullanana kadar buz üzerinde saklayın.
    NOT: Aşağıdaki prosedürde protoplast süspansiyonu hemen kullanın.

4. Proteinin salgı üretimi için DNA'nın tanıtılması

  1. Proteinin salgı üretimi için bir DNA kaseti içeren bir plazmidi şablon olarak kullanarak, salgı üretimi için gerekli DNA fragmanını PCR ile çoğaltın.
  2. PCR ürününü bir PCR saflaştırma kiti kullanarak işleyerek transformasyon için kullanılacak DNA örneğini hazırlayın.
  3. 1 mL protoplast solüsyonu, 200 μL solüsyon C (121 ° C'de 20 dakika otoklavlanmış, Tablo 6) ve 50 μL DNA örneği (0.5-1 μg / μL) steril, önceden soğutulmuş 15 mL konik bir tüpe ekleyin ve çözeltiyi pipetleyerek hafifçe karıştırın.
    NOT: Çözelti C oldukça viskozdur ve kullanımı zor olabilir; Pipetleme ile iyice karıştırdığınızdan emin olun.
  4. Tüpü buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
  5. 1,5 mL C çözeltisi ekleyin, pipetleyerek hafifçe karıştırın ve ardından çözeltiyi oda sıcaklığında 20-30 dakika bekletin.

5. Doğrudan sıvı kültür taraması

NOT: Erlenmeyer şişeleri (bölüm 5.1) veya mikroplakalar (bölüm 5.2) kullanarak kültür sistemini seçin.

  1. 200 mL Erlenmeyer şişesi kullanan kültür sistemi
    1. 200 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine 0.8 M sorbitol içeren 50 mL PD ortamı ekleyin ve 20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavlayarak sterilize edin.
    2. Ortamın sıcaklığının düştüğünü onayladıktan sonra, adım 4.5'te hazırlanan protoplast süspansiyonunu 1 x 105 protoplast / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
    3. Kültürü 30 ° C'de 120 rpm'de çalkalayarak 6 gün boyunca inkübe edin.
    4. Ortamın 1 mL'sini toplayın ve 4 ° C'de 1.5 mL'lik bir tüpte saklayın. Kültür örneğini hemen analiz edilmezse -20 ° C'de saklayın.
    5. 20 μL kültür numunesi ve 20 μL sodyum dodesil sülfat (SDS) numune tamponunu (Tablo 7) 1.5 mL'lik bir tüpte karıştırın ve 95 ° C'de 5 dakika kaynatın.
    6. Buz üzerinde soğuduktan sonra, 20 μL haşlanmış numune ve 5 μL önceden boyanmış protein standardını bir prekast jel üzerine yükleyin ve sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) 10 ile hedef heterolog proteinin salgı üretimini analiz edin.
  2. 24 kuyulu mikroplaka kullanan kültür sistemi
    1. Adım 4.5'te hazırlanan protoplast süspansiyonunu sterilize edilmiş 0.8 M sorbitol içeren PD ortamına 1 x 105 protoplast / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın.
    2. Adım 5.2.1'de hazırlanan çözeltiden 1 mL'yi 24 oyuklu bir mikroplakadaki üç oyuğa ekleyin.
    3. Kapağı kapatın ve 10 gün boyunca 175 rpm'de çalkalanarak 30 °C'de inkübe edin.
    4. 1 mL ortam toplayın ve 4 ° C'de 1.5 mL'lik bir tüpte saklayın Kültür örneğini hemen analiz edilmezse -20 ° C'de saklayın.
    5. 20 μL kültür numunesi ve 20 μL SDS numune tamponunu 1.5 mL'lik bir tüpte karıştırın ve 95 ° C'de 5 dakika kaynatın.
    6. Buz üzerinde soğuduktan sonra, 20 μL haşlanmış numune ve 5 μL önceden boyanmış protein standardını bir prekast jel üzerine yükleyin ve hedef heterolog proteinin salgı üretimini SDS-PAGE10 ile analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Talaromyces cellulolyticus cellobiohydrolaz (CBH: GenBank Erişim Numarası E39854) için kodlayan DNA ekspresyon kasetinin A. oryzae suşu HO422'nin bir üridin oksotrofisine sokulması ve heterolog proteinin salgı üretiminin taranması için sonuçlar aşağıda açıklanmıştır.

Taze spor süspansiyonunun hazırlanması

Bir agar plakasından spor süspansiyonunun nihai verimi 1 mL (1 x 107 spor / mL) idi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Protoplastların sıvı kültürünü gerçekleştirerek A. oryzae transformantlarının konvansiyonel yönteme göre daha hızlı taranmasını sağlayan bir sistem geliştirdik. Bu yöntemin en kritik yönü, sıvı ortamın ozmotik basıncıdır. Sıvı kültür için uygun ozmotik basınç, sorbitol kullanılarak optimize edildi. A. oryzae suşu HO4'ün büyümesi en çok 0.8 M sorbitol varlığında aktifti (Şekil 3A). Yumuşak agar ortamı kullanılan geleneksel yöntemde, 0.5−1.2 ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, deneylerle ilgili yardım için Rinkei Okano'ya teşekkür eder. Yazarlar, Tohoku Üniversitesi'nden Profesör Katsuya Gomi'ye ve Kanazawa Teknoloji Enstitüsü'nden Profesör Masayuki Machida'ya değerli tartışmalar için teşekkür ediyor. Bu çalışma Honda Araştırma Enstitüsü Japan Co., Ltd. tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 M NaOHNACALAI TESQUE, INC.37421-05
1 M Tris-HCl (pH 7.5)FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi318-90225
1 M Tris-HCl (pH 6.8)FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi2106-100
1.5 mL Mikrosantrifüj tüpüAS ONE Corporation1-1600-03
15 mL Konik santrifüj tüpüBecton, Dickinson and Company352196
2- merkaptoetanolBio-Rad Laboratuvarları, Inc.
24 kuyulu MikroplakaAGC TECHNO GLASS CO., LTD.3820-024
50 mL Konik santrifüj tüpüBecton, Dickinson ve Şirketi352070
70-&mikro; m Hücre süzgeciBecton, Dickinson and Company352350
AgarFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation010-15815
OtoklavTOMY SEIKO CO.,LTD.LSX-700
Bromofenol mavisiFUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi021-02911
CaCl2FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi038-24985
Kaamino asitFUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi393-02145
Selülaz R-10Cosmo Bio Co., Ltd.16419
Dekstrin hidratFUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi044-00585
D-SorbitolFUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi191-14735
e-PAGELATTO CORPORATIONE-T/R1020LSDS-PAGE Elektroforez cihazında prekast jel için kullanılır
ATTO CORPORATIONWSE-1150SDS-PAGE
için kullanılırFeSO4&orta nokta; 7H2OFUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi098-01085
Cam filtre 17G3Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd.
GliserolFUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi070-04941
HemositometreFunakoshi Co., Ltd.521-10
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüjKUBOTA CORPORATION778050 mL konik santrifüj tüplerinde numunelerin santrifüjlenmesi için kullanılır
İnkübatörTAITEC CORPORATION.G & orta nokta; BR-200Şişe sıvı kültürü ve protoplastların hazırlanması için kullanılır
: İnkübatörTAITEC CORPORATION.BR-43FLMikroplaka sıvı kültürü ve plaka kültürü için kullanılır
KClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-03545
KH2< / sub>PO4< / sub>NACALAI TESQUE, INC.28721-55
Lizing enzimiSigma-AldrichL1412-10G
MgSO4· 7H2OFUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi131-00405
Mikro soğutmalı santrifüjKUBOTA CORPORATION37401.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde numunelerin santrifüjlenmesi için kullanılır
MikroskopLeica MicrosystemsDMI6000 B
NaClFUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi190-13921
NaH2PO4· 2H2ONACALAI TESQUE, INC.31718-15
NaNO3FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi195-02545
Parafilm MBemis Company, IncPM-996
PCR Arıtma KitiQIAGEN KK28104
Petri kabıSumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-11900Kültür plakası olarak kullanılır
Polietilen glikolSigma-AldrichP3640-500G
Polipepton peptonBecton, Dickinson and Company211910
Protein merdivenleriBio-Rad Laboratories, Inc.161-0377SDS-PAGE
Sodyum dodesil sülfatBio-Rad Laboratories, Inc.
Steril filtreMerck KGaASLGP033RB
SükrozNACALAI TESQUE, INC.30404-45
Tween 20Tokyo Kimya Sanayi A.Ş.T0543
UridineSigma-AldrichU3750-25G
YatalaseTakara Bio Inc.T017
16107100000094147'de moleküler ağırlık belirteci olarak kullanılır.1610301 Serisi

Kaynaklar

  1. Tsuboi, H., et al. Improvement of the Aspergillus oryzae enolase promoter (P-enoA) by the introduction of cis-element repeats. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 69, 206-208 (2005).
  2. Nemoto, T., Maruyama, J. -I., Kitamoto, K. Contribution ratios of amyA, amyB, amyC genes to high-level α-amylase expression in Aspergillus oryzae. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 76, 1477-1483 (2012).
  3. Shinkawa, S., Mitsuzawa, S. Feasibility study of on-site solid-state enzyme production by Aspergillus oryzae. Biotechnology for Biofuels. 13, 31(2020).
  4. Machida, M., et al. Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae. Nature. 438 (7071), 1157-1161 (2005).
  5. Veenstra, A. E., van Solingen, P., Bovenberg, R. A. L., vander Voort, L. H. M. Strain improvement of Penicillium chrysogenum by recombinant DNA techniques. Journal of Biotechnology. 17 (1), 81-90 (1991).
  6. Takahashi, T., Masuda, T., Koyama, Y. Enhanced gene targeting frequency in ku70 and ku80 disruption mutants of Aspergillus sojae and Aspergillus oryzae. Molecular Genetics and Genomics. 275 (5), 460-470 (2006).
  7. Mizutani, O., et al. A defect of LigD (human Lig4 homolog) for nonhomologous end joining significantly improves efficiency of gene-targeting in Aspergillus oryzae. Fungal Genetics and Biology. 45 (6), 878-889 (2008).
  8. Bergès, T., Barreau, C. Isolation of uridine auxotrophs from Trichoderma reesei and efficient transformation with the cloned ura3 and ura5 genes. Current Genetics. 19 (5), 359-365 (1991).
  9. Takeno, S., et al. Cloning and sequencing of the ura3 and ura5 genes, and isolation and characterization of uracil auxotrophs of the fungus Mortierella alpina 1S-4. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (2), 277-285 (2004).
  10. Ji, Y. W., et al. Application of membrane filtration method to isolate uninuclei conidium in Aspergillus oryzae transformation system based on the pyrG marker. Food Science and Biotechnology. 22 (1), 93-97 (2013).
  11. Mitsuzawa, S., Fukuura, M., Shinkawa, S., Kimura, K., Furuta, T. Alanine substitution in cellobiohydrolase provides new insights into substrate threading. Scientific Reports. 7 (1), 16320(2017).
  12. Fleissner, A., Dersch, P. Expression and export: recombinant protein production systems for Aspergillus. Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 1255-1270 (2010).
  13. Yoon, J., Maruyama, J. -I., Kitamoto, K. Disruption of ten protease genes in the filamentous fungus Aspergillus oryzae highly improves production of heterologous proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 89, 747-759 (2011).
  14. Lin, H., et al. Engineering Aspergillus oryzae A-4 through the chromosomal insertion of foreign cellulase expression cassette to improve conversion of cellulosic biomass into lipids. PLoS One. 9, 108442(2014).
  15. Chakraborty, B. N., Patterson, N. A., Kapoor, M. An electroporation-based system for high-efficiency transformation of germinated conidia of filamentous fungi. Canadian Journal of Microbiology. 37 (11), 858-863 (1991).
  16. Sun, Y., et al. A dual selection marker transformation system using Agrobacterium tumefaciens for the industrial Aspergillus oryzae 3.042. Journal of Microbiology and Biotechnology. 29 (2), 230-234 (2019).
  17. Gomi, K., Iimura, Y., Hara, S. Integrative transformation of Aspergillus oryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulans argB Gene. Agricultural and Biological Chemistry. 51 (9), 2549-2555 (1987).
  18. Case, M. E., Schweizer, M., Kushner, S. R., Giles, N. H. Efficient transformation of Neurospora crassa by utilizing hybrid plasmid DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (10), 5259-5263 (1979).
  19. Lim, F. Y., Sanchez, J. F., Wang, C. C., Keller, N. P. Toward awakening cryptic secondary metabolite gene clusters in filamentous fungi. Methods in Enzymology. 517, 303-324 (2012).
  20. Li, D., Tang, Y., Lin, J., Cai, W. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 16 (1), 168(2017).
  21. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (7), 2172-2175 (1989).
  22. Shinkawa, S., et al. Base sequence for protein expression and method for producing protein using same. U.S. Patent. , 15/745,030 Application No. 15/745,030. Minato-Ku, Tokyo, Japan (2018).
  23. Tamano, K., et al. The β-1, 3-exoglucanase gene exgA (exg1) of Aspergillus oryzae is required to catabolize extracellular glucan, and is induced in growth on a solid surface. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 71 (4), 926-934 (2007).
  24. Endo, Y., et al. Novel promoter sequence required for inductive expression of the Aspergillus nidulans endoglucanase gene eglA. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (2), 312-320 (2008).
  25. Kubodera, T., Yamashita, N., Nishimura, A. Pyrithiamine resistance gene (ptrA) of Aspergillus oryzae: cloning, characterization and application as a dominant selectable marker for transformation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (7), 1416-1421 (2000).
  26. Yamada, O., Lee, B. R., Gomi, K. Transformation system for Aspergillus oryzae with double auxotrophic mutations, niaD and sC. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 61 (8), 1367-1369 (1997).
  27. Nødvig, C. S., Nielsen, J. B., Kogle, M. E., Mortensen, U. H. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS One. 10 (7), 0133085(2015).
  28. Shi, T. Q., et al. CRISPR/Cas9-based genome editing of the filamentous fungi: the state of the art. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (20), 7435-7443 (2017).
  29. Katayama, T., et al. Forced recycling of an AMA1-based genome-editing plasmid allows for efficient multiple gene deletion/integration in the industrial filamentous fungus Aspergillus oryzae. Applied Environmental Microbiology. 85 (3), 01896-01918 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

PEG Arac l Protoplast TransformasyonuHeterolog Protein retimiProtoplast Haz rlamaSpor S spansiyonuBesin Bak m ndan Zengin OrtamOzmotik Bas n OptimizasyonuTransformant Tarama
Video yakında

İlgili makaleler