Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Otomatik Görüntüleme Sistemi kullanarak iPSC'lerin Birleşme Noktasının Ölçülmesi.

2.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61225

⸱

10 Haziran 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genetics and Rare Diseases Research Division, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS, 2Department of Science, University Roma Tre, 3Department of Onco-hematology, Gene and Cell Therapy, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS

Bu makalede

Özet

Protokolün amacı, diferansiyel kaplamanın indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) büyüme hızını nasıl etkilediğini değerlendirmek için farklı hücre dışı matris (ECM) kaplama koşullarını karşılaştırmaktır. Özellikle, iPSC kültürlerinin optimum büyümesini sağlamak için koşullar oluşturmayı amaçlıyoruz.

Özet

Bu çalışma, farklı ECM kaplama substratları üzerinde büyüyen iPSC'lerin hücre birleşmesini nasıl etkileyebileceğini anlamaya odaklanmaktadır. Herhangi bir büyüme bozulmasını önlemek için tek hücre süspansiyonundaki hücreleri saymaya gerek kalmadan iPSC birleşmesini gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için bir protokol oluşturulmuştur. Zaman içinde 4 farklı ECM'de iPCS birleşimini otomatik bir şekilde değerlendirmek için yüksek içerikli bir görüntü analiz sistemi kullanılmıştır. Yapışkan iPSC'lerin hücre birleşimini değerlendirmek için farklı analiz ayarları kullanılmış ve %60, 80 veya 100 maske uygulanıp uygulanmadığına dair sadece küçük bir fark (laminin ile 24 ve 48 saatte) gözlenmiştir. Ayrıca lamininin Matrigel, vitronektin ve fibronektin ile karşılaştırıldığında en iyi birleşmeye yol açtığını gösteriyoruz.

Giriş

İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) somatik hücrelerden elde edilir ve farklı hücre tiplerine ayrılabilir. Genellikle hastalık patogenezini modellemek veya ilaç taraması yapmak için bir sistem olarak kullanılırlar ve ayrıca kişiselleştirilmiş tıp bağlamında kullanılma potansiyeli sunarlar. iPSC'ler büyük bir potansiyele sahip olduklarından, güvenilir bir model sistemi olarak kullanılmak üzere onları tam olarak karakterize etmek önemlidir. Daha önce hipoksik bir ortamda iPSC'lerin yetiştirilmesinin önemini göstermiştik, çünkü bu hücreler glikolize dayanır ve aerobik bir ortam redoks dengesizliğine neden olabilir1. iPSC'ler ayrıca diğer kültür koşullarına, özellikle de hücre dışı ortama karşı savunmasızdır. Kültür koşullarının optimizasyonu, onları sağlıklı ve çoğalır tutmak için kilit bir konudur. Sağlıklı bir iPSC kültürü, genellikle belirli insan bozukluklarının veya hücresel süreçlerin moleküler, hücresel ve fonksiyonel özelliklerini anlamak için kullanılan modelin son noktası olan sağlıklı farklılaşmış hücrelere yol açacaktır.

Bu çalışmada, ayrı kuyucuklarda farklı kaplama koşulları kullanarak iPSC'lerin birleşmesini test etmek için basit bir protokol kullanılmıştır. iPSC'ler, düzgün bir şekilde bağlanması için bir murin embriyonik fibroblast (MEF) besleyici tabakasına ihtiyaç duyar, ancak iPSC'lerin ve MEF'in bir arada bulunması, iki hücre popülasyonu bulunduğundan RNA veya protein ekstraksiyonu gibi analizlerin yapılmasını zorlaştırır. Besleyici tabakadan kaçınmak için, doğal hücre nişini yeniden oluşturmak ve besleyicisiz iPSC kültürüne sahip olmak için hücre dışı matrise (ECM) ait farklı proteinler kullanılmıştır. Özellikle, Matrigel, hücre dışı matriks proteinleri (yani laminin, kollajen IV, heparan sülfat proteoglikanlar, entactin / nidogen ve büyüme faktörleri) ile zenginleştirilmiş Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkomundan ekstrakte edilen çözünür bir bazal membran preparatıdır 2,3. Kullanılan diğer kaplama koşulları, ECM'lerin yapımında bilinen alakası olan saflaştırılmış proteinlerdir: laminin-521'in, embriyonun iç hücre kütlesindeki insan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) tarafından salgılandığı bilinmektedir ve doğumdan sonra vücuttaki en yaygın lamininlerden biridir 4,5,6,7,8,9, 10,11; vitronektin, hPSC 12,13,14,15,16'nın büyümesini ve farklılaşmasını desteklediği bilinen kseno içermeyen bir hücre kültürü matrisidir; fibronektin, omurgalı gelişimi ve embriyonik kök hücrelerin pluripotent bir durumda bağlanması ve bakımı için önemli bir ECM proteinidir 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Farklı kaplama koşulları mevcut olduğundan, bunları iPSC'lerin birleşmesi üzerindeki etkileri açısından karşılaştırıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. 96 kuyu plakalarının kaplanması

NOT: Farklı kaplamalar aynı plakada ancak ayrı kuyucuklarda test edilmiştir ( Ek Dosyaya bakınız).

  1. DMEM'de Matrigel 1:100'ü seyreltin. 96 kuyucuk plakasına kuyu başına 100 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Bunu takiben, çözeltiyi çıkarın ve kuyucukları iki kez 100 μL DMEM ile yıkayın.
  2. PBS'de laminini (20 μg / mL, LN-521) seyreltin (kalsiyum ve magnezyum ile). Kuyuya 100 μL ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri tohumlamadan önce DMEM ile iki yıkama yapın.
  3. Vitronektini (10 μg/mL) seyreltme tamponunda seyreltin. 96 kuyucuklu plakaya kuyu başına 100 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Hücreleri kaplamadan önce kuyucukları PBS (kalsiyum ve magnezyum olmadan) ile yıkayın.
  4. HU-Fibronektini (30 μg / mL) ddH2O'da seyreltin Kuyucuklara 100 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Bunu takiben, hücreleri tohumlamadan önce kuyucukları ortamla yıkayın.

2. Kültürde iPSC'lerin bakımı

NOT: iPSC'ler ticari olarak satın alınmıştır. iPSC'ler sağlıklı insan fibroblastlarından türetildi ve epizomal teknoloji kullanılarak yeniden programlandı.

  1. -80 °C dondurucudan veya sıvı azottan, kriyokorunmuş iPSC'leri 37 °C'lik bir su banyosunda çözün. Hücreleri içeren şişeyi biyolojik güvenlik kabinine taşımadan önce% 70 etanol ile temizleyin.
  2. Hücre süspansiyonunu, 15 mL'lik steril konik bir tüp içinde 1000 μL'lik bir pipetle 5 mL'lik önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamına (örneğin, mTeSR1) damla damla ekleyin.
  3. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 304 x g'de santrifüj yapın.
  4. Medyayı çıkarın ve hücre peletini 4 mL hücre kültürü ortamında yeniden askıya alın.
  5. Hücre süspansiyonunu, fare embriyonik fibroblastlarının (MEF'ler) daha önce kaplandığı 6 kuyucuklu hücre kültürü kabı başına 10 5 iPSC) iki kuyucuğuna (6 kuyucuklu hücre kültürü kabı başına 105 iPSC) yerleştirin. DMEM'de 2.4 x 104/cm2 yoğunlukta iPSC'lerin kaplanmasından iki gün önce tohum MEF'leri (% 10 Fetal Sığır Serumu,% 1 L-glutamin ve% 1 Penisilin-Streptomisin içerir).
  6. Tohumlamadan sonra, hücre ortamını 10 μM ROCK inhibitörü Y-27632 ile destekleyin.
  7. iPSC'leri ilk 4-5 hafta boyunca MEF'lerde ve daha sonra mTeSR1'deki ilgili kaplamalardan birini (bkz. adım 1 ve Tablo 1) kullanarak besleyicisiz durumda (MEF içermeyen koşul) büyütün.
  8. iPSC'ler% 70-80 birleştiğinde, RT'de 3-5 dakika boyunca 0,5 mM EDTA işlemi kullanarak 1:4 geçiş. 6 kuyucuklu bir plaka için 1 mL 0,5 mM EDTA ekleyin (veya diğer plaka türleri için orantılı miktarlar). Besleyicisiz koşullarda yeni kuyulara aktarın ve 37 °C, %5 CO2, %20 O2'de inkübeedin.
  9. Medyayı her gün taze mTeSR1 ile değiştirin ve hücreleri her 2 günde bir bölün.

3. Hücre birleşmesinin karakterizasyonu

  1. Deneyler için 96 kuyu plakası kullanın.
  2. MEF'lerin geçmediğinden emin olmak için besleyicisiz durumda en az 1 aylık kültürlemenin ardından kuyu başına 10.000 hücre tohumlayın. Optik mikroskopla hücreleri saymak için tek kullanımlık sayma slaytları kullanın.
  3. Deneyleri üçlü olarak gerçekleştirin. Bu nedenle, her tohumlama durumunu üç kuyucukta test edin.
  4. Parlak alan modunda bir sitometre kullanarak tohumlamayı takip eden 1. günden itibaren otomatik görüntü alma işlemini gerçekleştirin. 5 gün boyunca her 24 saatte bir otomatik görüntü alma işlemi gerçekleştirin. Deneysel parametreler hakkında ayrıntılı bilgi için, Ek Dosya'ya bakın.
  5. Hücreleri daha iyi görselleştirmek için otomatik kontrast ve otomatik pozlamayı kullanın.
  6. Kuyuların sınırındaki ışık kırılması nedeniyle odaktaki değişiklikleri değerlendirmek için kuyu başına %60, %80 ve %100'lük bir maske uygulamak üzere birleşim analizi için analiz ayarını (Ek Dosya'ya bakın) ayarlayın. Her zaman noktasında hücre birleşmesini analiz etmek için yukarıda belirtilen farklı maske analizi ayarını kullanın.

4. İstatistiksel analizler

  1. Kantitatif sonuçları, ortalamanın standart hatası (SEM) ± ortalamalar olarak raporlayın.
  2. Farklı kaplama koşullarının genel farklılıklarını karşılaştırmak için, aynı numuneleri kullanarak veri elde edin ve Öğrencinin çift numune t-testini gerçekleştirin. 0.05'ten küçük P değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir ve bildirilen tüm p değerleri iki taraflıdır.

5. Sitoiskelet mikrofilamentlerinin karakterizasyonu

  1. RT'de 10 dakika boyunca PBS'de% 4 paraformaldehit (% 4 PFA) içeren hücreleri sabitleyin, ardından PBS'de iki yıkama (toplam 10 dakika).
  2. RT'de 1 saat boyunca her bir kuyucuğa 100 μL blokaj çözeltisi (PBS'de %5 BSA, %0,1 Triton'dan oluşur) ekleyin.
  3. Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve numuneleri PBS ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.
  4. Örnek başına 100 μL falloidin-konjugat çalışma çözeltisi ekleyin ve RT'de 1 saat inkübe edin.
  5. PBS ile hücreleri iki kez yıkayın (RT'de 10 dakika).
  6. Hoechst 33342'li leke çekirdekleri, RT'de 10 dakika boyunca PBS'de 1:10000 seyreltildi.
  7. Hoechst çözeltisini çıkarın ve hücreleri her seferinde 10 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın.
  8. NumuneyiH2O ile yıkayın ve kimyasal bir başlık altında kurumaya bırakın.
  9. Hücreleri örtmek ve numunelerin floresansını korumak için 100 μL montaj ortamı (yani PBS: gliserol, 1: 1) ekleyin.
  10. Ex/Em 493/517 nm'deki hücreyi, beyaz ışık lazer (WLL) kaynağı ve 405 nm diyot lazer ile donatılmış lazer taramalı bir konfokal mikroskopta gözlemleyin. HC PLAPO 40x yağa daldırma hedefi kullanarak sıralı konfokal görüntüler elde edin. İncelenen tüm numuneler için aynı lazer gücünü, ışın ayırıcıları, filtre ayarlarını, iğne deliği çaplarını ve tarama modunu kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, iPSC'lerin farklı kaplama koşullarında yetiştirildiğinde birleşimini araştırdık. Bir sitometre kullanarak, 5 gün içinde üçlü olarak kolayca bilgilendirici sonuçlar elde edebildik. iPSC'ler plastik kaplara neredeyse hiç yapışmadığından ve çoğalmalarını desteklemek için bir kaplama gerektiğinden, hücre kültürünün sağlığının bir göstergesi olduğu ve farklılaşma potansiyellerini yansıtabileceği için insan iPSC'lerinin birleşmesini izlemeye karar verdik. İn vitro genişlemeden sonra, iPSC'leri farklı ECM substrat...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hastalık modelleme ve gelecekteki ilaç taraması için iPSC'lerin kullanımı, hassas tıpta olası uygulamaları ile birlikte onu büyük önem taşıyan bir teknoloji haline getirmektedir ve bu nedenle embriyonik kök hücrelerin fizyolojik durumuna daha iyi benzeyen in vitro kültürleme durumunu açıkça anlamanın gerekli olduğuna inanıyoruz. Bu bağlamda, hücrelerin sağlıklı ve farklılaşmamış bir durumda kalmasına izin veren koşulları anlamak için vahşi tip iPSC'ler kullanarak farklı ECM kaplamalarını test ettik. Buna ek olarak, kriti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Çalışma, Fondazione Bambino Gesù ve Ricerca Corrente'den (İtalya Sağlık Bakanlığı) C.C.'ye yapılan hibelerle desteklendi.  Dr. Enrico Bertini'ye (Nörobilim Dalı, Nöromüsküler ve Nörodejeneratif Hastalıklar Birimi, Moleküler Tıp Laboratuvarı, Bambino Gesù Çocuk Araştırma Hastanesi), Dr. Stefania Petrini'ye (Konfokal Mikroskopi Çekirdek Tesisi, Araştırma Laboratuvarları, Bambino Gesù Çocuk Araştırma Hastanesi), Giulia Pericoli'ye (Onko-hematoloji, Gen ve Hücre Terapisi Bölümü, Çocuk Araştırma Hastanesi Bambino Gesù) teşekkür ederiz. ve Roberta Ferretti (Onko-hematoloji, Gen ve Hücre Terapisi Bölümü, Çocuk Araştırma Hastanesi Bambino Gesù) bilimsel tartışmalar ve teknik yardım için. Maria Vinci, "Kanserli Çocuklar İngiltere bursu" sahibidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 mL Stripette Serolojik Pipetler, Polistiren, Ayrı Ayrı Kağıt/Plastik Ambalajlı, SterilCorning4488Alet
15 mL yüksek berraklıkta polipropilen (PP) konik santrifüj tüpleriFalcon352097Aleti
1x PBS (Ca2+ ile; Mg2+)Thermofisher14040133Orta
1x PBS (Ca2+ olmadan; Mg2+)EurocloneECB4004LOrta
5 mL Stripet Serolojik Pipetler, Polistiren, Ayrı Ayrı Kağıt/Plastik Ambalajlı, SterilCorning4487Takım
Hücresi kültürü mikroplakası, 96 KUYU, PS, F-AltGreiner Bio One655090Destek
Hücre kültürü plakası, 6 kuyuluCostar3516Desteği
DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Eagle'ın Orta-yüksek glikozu)SigmaD5671Orta
EDTASigmaED4SS-500gReaktif
Epi Epizomal iPSC Yeniden Programlama KitiInvitrogenA15960Reaktif
HIZLI - OKUYUN 102BiosigmaBVS100Aracı
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco10270106Orta
FibronektinMerckFC010Kaplama
GliserolSigmaG5516Reaktif
H2OMILLIQ
HoechstThermofisher33342Reaktif
Laminin 521Kök Hücre Teknolojileri77003Kaplama
L-Glutamin (200 mM)GibcoLS25030081Reaktifi
MatrigelCorning Matrigel hESC Nitelikli Matriks354277
Kaplama Fare embriyonik fibroblastları (MEF)Yaşam TeknolojileriA24903Kaplama
MTESR1 OrtaKök Hücre Teknolojileri85851Orta
MTESR1 TakviyesiKök Hücre Teknolojileri85852Orta
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)Gibco15140122Reaktifi
PhalloidinSigmaP1951Reaktif
VitronektinKök Hücre Teknolojileri7180Kaplama
Y-27632SigmaY0503Reaktifi

Kaynaklar

  1. Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
  2. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
  3. Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).
  4. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195(2014).
  5. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  6. Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
  7. Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042(2018).
  8. Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
  9. Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
  10. Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
  11. Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
  12. Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
  13. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
  14. Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
  15. Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
  16. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  17. Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).
  18. Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
  19. Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
  20. Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
  21. Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
  22. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
  23. Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
  24. Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
  25. Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
  26. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
  27. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  28. Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

iPSC KonfluenslemesiECM Kaplama SubstratlarY ksek erikli G r nt AnaliziH cre K lt r ProtokolLaminin KaplamaBazal Membran MatrisiVitronektin KaplamaFibronektin KaplamaKonfokal Mikroskopi
Otomatik Görüntüleme Sistemi kullanarak iPSC'lerin Birleşme Noktasının Ölçülmesi.
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.