Protokolün amacı, diferansiyel kaplamanın indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) büyüme hızını nasıl etkilediğini değerlendirmek için farklı hücre dışı matris (ECM) kaplama koşullarını karşılaştırmaktır. Özellikle, iPSC kültürlerinin optimum büyümesini sağlamak için koşullar oluşturmayı amaçlıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Otomatik Görüntüleme Sistemi kullanarak iPSC'lerin Birleşme Noktasının Ölçülmesi.
Bu makalede
Özet
Özet
Bu çalışma, farklı ECM kaplama substratları üzerinde büyüyen iPSC'lerin hücre birleşmesini nasıl etkileyebileceğini anlamaya odaklanmaktadır. Herhangi bir büyüme bozulmasını önlemek için tek hücre süspansiyonundaki hücreleri saymaya gerek kalmadan iPSC birleşmesini gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için bir protokol oluşturulmuştur. Zaman içinde 4 farklı ECM'de iPCS birleşimini otomatik bir şekilde değerlendirmek için yüksek içerikli bir görüntü analiz sistemi kullanılmıştır. Yapışkan iPSC'lerin hücre birleşimini değerlendirmek için farklı analiz ayarları kullanılmış ve %60, 80 veya 100 maske uygulanıp uygulanmadığına dair sadece küçük bir fark (laminin ile 24 ve 48 saatte) gözlenmiştir. Ayrıca lamininin Matrigel, vitronektin ve fibronektin ile karşılaştırıldığında en iyi birleşmeye yol açtığını gösteriyoruz.
Giriş
İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) somatik hücrelerden elde edilir ve farklı hücre tiplerine ayrılabilir. Genellikle hastalık patogenezini modellemek veya ilaç taraması yapmak için bir sistem olarak kullanılırlar ve ayrıca kişiselleştirilmiş tıp bağlamında kullanılma potansiyeli sunarlar. iPSC'ler büyük bir potansiyele sahip olduklarından, güvenilir bir model sistemi olarak kullanılmak üzere onları tam olarak karakterize etmek önemlidir. Daha önce hipoksik bir ortamda iPSC'lerin yetiştirilmesinin önemini göstermiştik, çünkü bu hücreler glikolize dayanır ve aerobik bir ortam redoks dengesizliğine neden olabilir1. iPSC'ler ayrıca diğ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. 96 kuyu plakalarının kaplanması
NOT: Farklı kaplamalar aynı plakada ancak ayrı kuyucuklarda test edilmiştir ( Ek Dosyaya bakınız).
- DMEM'de Matrigel 1:100'ü seyreltin. 96 kuyucuk plakasına kuyu başına 100 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Bunu takiben, çözeltiyi çıkarın ve kuyucukları iki kez 100 μL DMEM ile yıkayın.
- PBS'de laminini (20 μg / mL, LN-521) seyreltin (kalsiyum ve magnezyum ile). Kuyuya 100 μL ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri tohumlamadan önce DMEM ile iki yıkama yapın.
- Vitronektini (10 μg/mL) seyreltme tamponunda seyreltin....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu çalışmada, iPSC'lerin farklı kaplama koşullarında yetiştirildiğinde birleşimini araştırdık. Bir sitometre kullanarak, 5 gün içinde üçlü olarak kolayca bilgilendirici sonuçlar elde edebildik. iPSC'ler plastik kaplara neredeyse hiç yapışmadığından ve çoğalmalarını desteklemek için bir kaplama gerektiğinden, hücre kültürünün sağlığının bir göstergesi olduğu ve farklılaşma potansiyellerini yansıtabileceği için insan iPSC'lerinin birleşmesini izlemeye karar verdik. İn vitro genişlemeden sonra, iPSC'leri farklı ECM substrat.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hastalık modelleme ve gelecekteki ilaç taraması için iPSC'lerin kullanımı, hassas tıpta olası uygulamaları ile birlikte onu büyük önem taşıyan bir teknoloji haline getirmektedir ve bu nedenle embriyonik kök hücrelerin fizyolojik durumuna daha iyi benzeyen in vitro kültürleme durumunu açıkça anlamanın gerekli olduğuna inanıyoruz. Bu bağlamda, hücrelerin sağlıklı ve farklılaşmamış bir durumda kalmasına izin veren koşulları anlamak için vahşi tip iPSC'ler kullanarak farklı ECM kaplamalarını test ettik. Buna ek olarak, kriti.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Çalışma, Fondazione Bambino Gesù ve Ricerca Corrente'den (İtalya Sağlık Bakanlığı) C.C.'ye yapılan hibelerle desteklendi. Dr. Enrico Bertini'ye (Nörobilim Dalı, Nöromüsküler ve Nörodejeneratif Hastalıklar Birimi, Moleküler Tıp Laboratuvarı, Bambino Gesù Çocuk Araştırma Hastanesi), Dr. Stefania Petrini'ye (Konfokal Mikroskopi Çekirdek Tesisi, Araştırma Laboratuvarları, Bambino Gesù Çocuk Araştırma Hastanesi), Giulia Pericoli'ye (Onko-hematoloji, Gen ve Hücre Terapisi Bölümü, Çocuk Araştırma Hastanesi Bambino Gesù) teşekkür ederiz. ve Roberta Ferretti (Onko-hematoloji, Gen ve Hücre Terapisi Bölümü, Çocuk Araştırma Hastane....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10 mL Stripette Serolojik Pipetler, Polistiren, Ayrı Ayrı Kağıt/Plastik Ambalajlı, Steril | Corning | 4488 | Alet |
| 15 mL yüksek berraklıkta polipropilen (PP) konik santrifüj tüpleri | Falcon | 352097 | Aleti |
| 1x PBS (Ca2+ ile; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Orta |
| 1x PBS (Ca2+ olmadan; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Orta |
| 5 mL Stripet Serolojik Pipetler, Polistiren, Ayrı Ayrı Kağıt/Plastik Ambalajlı, Steril | Corning | 4487 | Takım |
| Hücresi kültürü mikroplakası, 96 KUYU, PS, F-Alt | Greiner Bio One | 655090 | Destek |
| Hücre kültürü plakası, 6 kuyulu | Costar | 3516 | Desteği |
| DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Eagle'ın Orta-yüksek glikozu) | Sigma | D5671 | Orta |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reaktif |
| Epi Epizomal iPSC Yeniden Programlama Kiti | Invitrogen | A15960 | Reaktif |
| HIZLI - OKUYUN 102 | Biosigma | BVS100 | Aracı |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Gibco | 10270106 | Orta |
| Fibronektin | Merck | FC010 | Kaplama |
| Gliserol | Sigma | G5516 | Reaktif |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reaktif |
| Laminin 521 | Kök Hücre Teknolojileri | 77003 | Kaplama |
| L-Glutamin (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reaktifi |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC Nitelikli Matriks | 354277 | |
| Kaplama Fare embriyonik fibroblastları (MEF) | Yaşam Teknolojileri | A24903 | Kaplama |
| MTESR1 Orta | Kök Hücre Teknolojileri | 85851 | Orta |
| MTESR1 Takviyesi | Kök Hücre Teknolojileri | 85852 | Orta |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reaktifi |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reaktif |
| Vitronektin | Kök Hücre Teknolojileri | 7180 | Kaplama |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reaktifi |
Kaynaklar
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated hu....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
