Bu protokol hücre içinde hücre altı bölmesi özgü redoks durumunun değerlendirilmesi açıklanır. Redoksduyarlı floresan prob bozulmamış hücrelerde uygun oranmetrik analiz sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücre altı kompartmana özgü Redoksduyarlı Yeşil Floresan Protein kullanılarak Hücresel Oksidasyonun Değerlendirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre içi oksidasyon/redüksiyon dengesinin ölçülmesi, bir organizmanın fizyolojik ve/veya patofizyolojik redoks durumuna genel bir bakış sağlar. Tiyoller, azaltılmış dithiol ve okside disülfür oranları ile hücrelerin redoks durumunu aydınlatmak için özellikle önemlidir. Tasarlanmış sistein içeren floresan proteinler redoksduyarlı biyosensörler için yeni bir dönem açar. Bunlardan biri olan redoksduyarlı yeşil floresan protein (roGFP), adenoviral transdüksiyonlu hücrelere kolayca girilebilir ve hücre altı bölmelerin redoks durumunun hücresel süreçleri bozmadan değerlendirilmesine olanak sağlar. RoGFP azaltılmış sistein ve oksitlenmiş sistinler sırasıyla 488 nm ve 405 nm, emisyon ile 525 nm uyarma maxima var. Bu indirgenmiş ve oksitlenmiş formların oranlarının değerlendirilmesi hücre içinde redoks dengesinin uygun hesaplanmasına olanak sağlar. Bu yöntemde canlı hücre içindeki redoks durumunu değerlendirmek için ölümsüzleştirilmiş insan üçlü negatif meme kanseri hücreleri (MDA-MB-231) kullanılmıştır. Protokol adımları sitosolik roGFP ifade etmek için adenovirüs ile MDA-MB-231 hücre hattı transdüksiyon, H2O2ile tedavi ve hem akış sitometri ve floresan mikroskopi ile sistein ve sistin oranının değerlendirilmesi içerir.
Giriş
Oksidatif stres 1985 yılında Helmut Sies tarafından "eski lehine prooksidant-antioksidan dengesi nde bir bozukluk" olarak tanımlanmıştır1, ve araştırma bir bolluk organizmaların hastalık elde etmek için yapılmıştır-, beslenme-, ve organizmaların yaşlanmaya özgü redoks durumu1,2,3. O zamandan beri, oksidatif stres anlayışı geniş hale gelmiştir. Hastalıklara ve/veya yaşlanmaya karşı antioksidan kullanma hipotezlerinin test edilmesi oksidatif stresin sadece zarar vermekle kalmamış, aynı zamanda hücrelerde başka rolleri de olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bilim adamları serbest radikallerin sinyal iletimi için önemli bir rol oynadığını göstermiştir2. Tüm bu çalışmalar makromoleküllerin redüksiyon-oksidasyon (redoks) oranındaki değişikliklerin belirlenmesinin önemini güçlendirmiştir. Enzim aktivitesi, antioksidanlar ve/veya oksidanlar ve oksidasyon ürünleri çeşitli yöntemlerle değerlendirilebilir. Bunlar arasında, thiol oksidasyonunu belirleyen yöntemler tartışmasız en çok kullanılan lar dır çünkü hücrelerdeki antioksidanlar ve prooksidantlar arasındaki dengeyi veorganizmaları4 . Özellikle glutatyon (GSH)/glutatyon disülfür (GSSG) ve/veya sistein (CyS)/sistin (CySS) arasındaki oranlar organizmaların redoks durumunu izlemek için biyobelirteç olarak kullanılmaktadır2.
Prooksidantlar ve antioksidanlar arasındaki dengeyi dengelemek için kullanılan yöntemler esas olarak hücrelerdeki azaltılmış/oksitlenmiş proteinlerin veya küçük moleküllerin seviyelerine dayanır. Batı lekeleri ve kütle spektrometresi, azaltılmış/okside makromoleküllerin (protein, lipidler vb.) oranlarını genel olarak değerlendirmek için kullanılır ve GSH/GSSG oranları spektrofotometri ile değerlendirilebilir5. Bu yöntemlerin ortak bir özelliği, hücre lisisi ve/veya doku homojenizasyonu ile sistemin fiziksel tedirginliğidir. Bu analizler, farklı hücresel bölmelerin oksidasyon durumunu ölçmek gerektiğinde de zorlaşır. Tüm bu tedirginlikler, adak ortamında eserlere neden olur.
Redoks duyarlı floresan proteinler hücrelerde bir rahatsızlık neden olmadan redoks dengesini değerlendirmek için avantajlı bir dönem açtı6. Hücre içi bölmeleri hedefleyerek, hücre içi aktivitelerin ölçülmesine izin verebilirler (örneğin, mitokondri ve sitosolun redoks durumunu atayarak) hücresel organeller arasındaki çapraz konuşmayı araştırmak için. Sarı floresan protein (YFP), yeşil floresan protein (GFP) ve HyPeR proteinleri Meyer ve meslektaşları tarafından gözden geçirilir6. Bu proteinler arasında, redoks duyarlı GFP (roGFP) onun CyS farklı floresan okumalar nedeniyle benzersizdir (ör. 488 nm / em. 525 nm) ve CySS (ör. 405 nm/525 nm) kalıntılar, hangi oranmetrik analiz izin, Y7FPgibi diğer redoks duyarlı proteinlerin aksine,8. Oranmetrik çıktı, ifade düzeyleri, algılama hassasiyetleri ve fotobeyaztma8arasındaki farkları dengelediği için değerlidir. Hücrelerin hücre altı bölmeleri (sitosol, mitokondri, çekirdek) veya farklı organizmalar (bakteri yanı sıra memeli hücreleri) roGFPdeğiştirerekhedef olabilir 7,9,10.
roGFP tahlilleri, özellikle gerçek zamanlı görselleştirme deneyleri için floresan görüntüleme teknikleri kullanılarak gerçekleştirilmektedir. RoGFO'ların akış sitometrik analizleri, önceden belirlenmiş zaman noktalarına sahip deneyler için de mümkündür. Bu makalede, adenoviral transdüksiyon yoluyla roGFP (sitosol hedefli) aşırı ifade memeli hücrelerinde redoks durumunun ratiometrik bir değerlendirme yapmak için floresan mikroskopi ve akış sitometri sitometri kullanımı hem de açıklanmaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Bu protokol p-80 eşzamanlı MDA-MB-231 hücreleri için optimize edildi. Diğer hücre hatları için, hücre sayısı ve enfeksiyon çokluğu (MOI) yeniden optimize edilmelidir.
1. Hücrelerin hazırlanması (gün 1)
- MDA-MB-231 hücre hattını 75 cm2 şişede, 10 mL'lik Dulbecco modifiye Kartal ortamı (DMEM) ile fetal büyükbaş serum (FBS) ile %5 CO2 nemli bir atmosferde 37 °C'de muhafaza edin.
NOT: Tüm protokol boyunca tüm ek ve tedavi kuluçkaları için FBS, 37 °C ve %5 CO2 nemlendirilmiş atmosfer ile desteklenen DMEM kullanılmaktadır. - Deney için MDA-MB-231 hücrelerini hazırlayın.
- Şişeiçindeki ortamı aspire edin, 2 mL 2 mL ile hücreleri 2 dk için %0,25 tripsin-EDTA çözeltisi ile ayırın ve 6 mL tam orta (DMEM% 10 FBS) ile tripsin aktivitesini inaktive edin. Hücreleri 150 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı aspire edin ve 5 mL tam ortamda hücreleri askıya alın.
- Eşit hacimli hücre süspansiyonu ve %0,4 trypan mavisini karıştırın. Bu karışımın 10 μL alın ve otomatik hücre sayacı ile hücreleri saymak.
NOT: Hücre sayımı için bir Coulter sayacı veya hemositometre de kullanılabilir. - Akış sitometri analizleri için hücreleri 6 kuyuplakasına tohumlayın ve 1 mL'lik 150.000 hücreyi kuyu başına orta tohumlayın. Hücre eki için 16 saat bekleyin.
- Hücreleri floresan görüntüleme için 4 kuyuluk slaytIçine tohum ve tohum 25,000 hücreleri 0.5 mL orta başına kuyu başına. Hücre eki için 16 saat bekleyin.
NOT: Tohum kontrol kuyuları tedavi kuyularına ek olarak. Hücre numarasını belirlemek için kontrol kuyularından birini kullanın (isteğe bağlı: hücrelerin bağlanma süresi iki katına kadar kısaysa, hücre numarasının tohumlama yoğunluğuyla aynı olduğu varsayılabilir) ve diğeri de virüssüz kontrol (0 MOI) için.
2. Adenoviral roGFP transdüksiyonu (gün 2 ve 3)
DİkKAT: Adenovirüsler hastalıklara neden olabilir. Hücreleri transducing ederken, filtrelenmiş ipuçları kullanın ve dekontamine ipuçları, Pasteur pipetler, ve mikrosantrifüj tüpleri ile 10% çamaşır suyu.
NOT: Bu protokol sitosol spesifik roGFP ile gösterilmiştir, ancak diğer hücresel bölmeler (örneğin, mitokondri veya mitokondriyal intermembran uzay) aynı protokol ile hedeflenebilir.
- MDA-MB-231 hücre hattı için her MOI değeri için gerekli adenovirüs (mL) hacmini hesaplayarak EN yüksek transdüksiyon verimliliğini elde etmek için MOI için bir doz-yanıt eğrisi oluşturma(Tablo 1):
NOT: ML başına plak şekillendirme ünitesi (PFU) olarak ifade edilen adenoviral stoğun her bir partisinin fonksiyonel titreti şirket tarafından sağlanmaktadır. Transdüksiyon için optimum MOI hücre tipleri arasında farklılık gösterir. Çoğu memeli hücresi için optimum MOI aralığı 10 ile 300 arasındadır. Hücresel yanıta göre, MOI değerleri yeniden hesaplanmalıdır (örneğin, hücrelerde sitotoksik yanıt varsa MOI aralığı azaltılmalıdır veya hücreler düşük transdüksiyon verilicisi varsa aralık artırılmalıdır). - Güvenilir pipetleme için hücre kültürü ortamı ( FBS ile DMEM) ile 6 x 1010 PFU/mL adenoviral roGFP çözeltisinin 1:100 seyreltilmesini yapın.
- Pipet ve 0.0125 mL (12.5 μL), 0.025 mL (25 μL), 0.05 mL (50 μL) adenoviral roGFP seyreltme eklemek amacıyla 50, 100 ve 200 MOI sırasıyla 50, 100 ve 200 MOI ile 100 MOI ile 150.000 hücreleri transduce için 6 kuyu nun her kuyusu ( sitome analizi için).
- Pipet ve 4 odalı slayt kuyularında 0.0042 mL (4.2 μL) adenoviral roGFP seyreltme ekleyin floresan görüntüleme için 100 MOI ile 25.000 hücre transduce(Tablo 1).
NOT: Adenoviral roGFP yapısı ve hücreleri arasında en yüksek etkileşimi sağlamak için kuyularda en az miktarda ortam kullanılmalıdır. Yüksek serum düzeyleri bazı hücre tiplerinde transdüksiyon verimliliğini olumsuz etkileyebileceğinden, kültür ortamının serum içeriğinin farklı hücre hatları için azalması gerekebilir. - Hücre bakım koşulları altında 16-24 saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın. Ertesi gün (gün 3), hücre kültür ortamına (DMEM % 10 FBS ile) değiştirilerek hücre kurtarmasına izin verin 24 saat. hücreler morfolojik değişiklikler olsa bile roGFP ifade edebilir.
NOT: 3. günde hücreler roGFP'yi ifade etmeye başlamalıdır; bu nedenle transdüksiyon verimliliği floresan mikroskobu (ex. 488/em. 525 filtreleri) kullanılarak izlenebilir. Tutarlı tahkikat sonuçları elde etmek için faz kontrast mikroskobu altındaki morfolojik değişikliklerin farkında olun ve belgeleyin ve transdüksiyon verimliliğini değerlendirirken morfolojiyi gözlemleyin. - Adım 2.3'te hazırlanan 50, 100 ve 200 MOI numunesini ve bunların akış sitometri analizinden elde edilen transdüksiyon verimliliği sonuçlarını (adım 3.1 ve 4.1) kullanarak bir doz yanıt eğrisi oluşturun. Morfolojik değişikliklerin (adım 2.5) ve MOI'nin doz-yanıt eğrisinin belgelenmesi yle optimal transdüksiyon verimliliğini değerlendirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
CyS/CySS'nin redoks durumu transdükse roGFPs ile kolayca tetkik edilir. Floresan prob, azaltılmış ve oksitlenmiş formlar arasındaki oranı ölçer (uyarma dalga boyları sırasıyla 488 nm ve 405 nm). Floresan verileri hem akış sitometrisi hem de mikroskopi ile elde edilebilir.
Çok sayıda hücre sürekli ve uygun akış sitometri sitometri kullanılarak elde edilebilir. Analiz 3 ana adımdan oluşur: 1) FSC alan filtresi ile ilgi hücre popülasyonu seçin (Şekil 1A); 2) eski 488...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bir organizmadaki tiyol/disülfür dengesi hücrelerin redoks durumunu yansıtır. Yaşayan organizmalar glutatyon var, sistein, protein tiyolleri, ve düşük molekül ağırlıklı tiyoller, hepsi oksidasyon düzeyi etkilenir ve hücrelerin redoks durumunu yankı4. Mühendislik roGFPs kendi CySartıkları7 ile tiol / disülfür dengesinin non-yıkıcı nicel izin verir. roGFP'nin oranmetrik özelliği memeli hücreleri için güvenilir redoks ölçümleri sağlar. roGFP transfeksiyon yöntemleri ve/veya tr...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Hücrelerde sitosol spesifik roGFP ifade etmek için yapı ve rekombinant adenovirüs Paul T. Schumacker, Doktora, Freiberg Tıp Fakültesi, Northwestern Üniversitesi ve ViraQuest Inc, sırasıyla laboratuvarda oluşturuldu. Bu çalışma, NIH Ulusal Biyomedikal Araştırma Mükemmeliyet Merkezleri Enstitüsü (COBRE NIGMS), Ulusal Genel Tıp Bilimleri Sistemleri Farmakoloji ve Toksikoloji Eğitim Programı Hibe T32 GM106999, UAMS Vakfı / Tıbbi Araştırma Bağış Ödülü AWD00053956, UAMS Yıl Sonu Şansölye Ödülleri AWD00053484. Akış sitometri çekirdek tesisi kısmen Mikrobiyal Patogenez Merkezi tarafından desteklendi ve Cobre NIGMS aracılığıyla P20GM103625'e Ev Sahipliği Yaptı Inflamatuar Yanıtlar hibe sitometrisi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. ATA, Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurulu (TÜBİTAK) 2214-A bursu ile desteklendi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.25 Tripsin-EDTA | Gibco, Yaşam Bilimleri | 25200-056 | Hücre kültürü |
| 4 oyuklu odacıklı slayt | Thermo Scientific | 154526 | Floresan görüntüleme için hücre tohumlama malzemesi |
| hücre süzgeç kapaklı 5 ml'lik tüpler | Falcon | 352235 | Akış sitometrisi analizi için tek hücreli süspansiyon tüpü |
| 6 oyuklu plaka | Corning | 353046 | Akış sitometrisi analizi için hücre tohumlama materyali |
| 15 ml konik tüpler | MidSci | C15B | Hücre kültürü |
| 75 cm2 havalandırmalı kapaklı doku kültürü şişeleri | Corning | 4306414 | Hücre kültürü |
| Adenoviral sitozole özgü roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP yapısı Dr. Schumaker tarafından nazikçe sağlanmıştır |
| Sınıf II, Tip A2 Güvenlik Davlumbaz Dolabı | Thermo Scientific | 1300 Serisi A2 | Hücre kültürü |
| Kontes otomatik hücre sayacı | Invitrogen | C10227 | Hücre sayımı |
| Kontes hücre sayacı odası slaytları | Invitrogen | C10283 | Hücre sayımı |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Hücre kültürü |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Hücre kültürü |
| Filtreli pipet uçları, steril, 20 & l | Fisherbrand | 02-717-161 | Hücre kültürü |
| Filtreli pipet uçları, steril, 1000 ve mikro; l | Fisherbrand | 02-717-166 | Hücre kültürü |
| Akış Sitometresi | BD Biosciences | LSRFortessa | Cihazı, akış sitometrisi analizleri için FITC ve BV510 bant geçiren filtrelerle donatılmıştır |
| Floresan Mikroskop | Gelişmiş Mikroskopi Grubu (AMG), | Evos FL | Floresan görüntüleme |
| Hidrojen Peroksit, %30 | Fisher Scientific | H325-100 | Pozitif kontrol |
| Light Cube, Özel | Yaşam Bilimleri | CUB0037 | roGFP eksprese eden hücrelerin floresan görüntülemesi (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | roGFP eksprese eden hücrelerin floresan görüntülemesi (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | Amerikan Doku Kültürü Koleksiyonu | HTB-26 | İnsan epitelyal meme kanseri hücre hattı |
| Mikrosantrifüj tüpleri, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Hücre kültürü |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Hücre kültürü |
| Pipet kontrolörü | Drummond | Hood Mate Model 360 | Hücre kültürü |
| Serolojik pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Hücre kültürü |
| Serolojik pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Hücre kültürü |
| Serolojik pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Hücre kültürü |
| Doku Kültürü İnkübatörü | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 hücre kültürü için inkübatör |
| Tripan mavisi leke %0.4Invitrogen | T10282 | Hücre sayımı |
Kaynaklar
- Sies, H. Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Jones, D. P. Redefining Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).
- Pizzino, G., et al. Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763(2017).
- Go, Y. M., Jones, D. P. Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).
- Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).
- Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Björnberg, O., Østergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).
- Bhaskar, A., et al. Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902(2014).
- Loor, G., et al. Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Loor, G., et al. Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis. Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).
- Esposito, S., et al. Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).
- Meyer, A. J., et al. Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer. Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).
- Galvan, D. L., et al. Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy. Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).
- Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology. Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).
- Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes. Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
