Heterolog Hücre Sisteminde Protein Toplama Yoluyla Hücrelerarası Etkileşimlerin Ölçülmesi

Summary

Burada, floresan mikroskopisi kullanarak heterolog bir hücre sisteminde transta ligand-reseptör etkileşimlerini hızlı ve yarı niteliksel olarak ölçmek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Hücresel arayüzlerdeki protein etkileşimleri, doku gelişimi ve kanserin ilerlemesinden sinaps oluşumu ve bakımına kadar çok sayıda biyolojik sonucu belirler. Bu temel etkileşimlerin çoğu transta gerçekleşir ve tipik olarak membran bağlantılı bağlama çiftlerini ifade eden hücreler arasındaki heterofilik veya homofilik etkileşimler tarafından indüklenir. Hastalıkla ilgili mutasyonların bu temel protein etkileşimlerini nasıl bozduğunun aydınlatıcı olması, sayısız hücre biyolojisi alanı hakkında fikir verebilir. Birçok protein-protein etkileşim tahlilleri tipik olarak cis ve trans etkileşimleri arasında ayrım yapmaz, bu da potansiyel olarak in vivo olarak meydana gelen ve protein ve / veya özel izleme ekipmanının emek yoğun saflaştırılmasını içeren bağlama kapsamının aşırı tahmin edilmesine yol açar. Burada, uzun protein saflaştırmalarına veya özel ekipmanlara ihtiyaç duymadan sadece trans etkileşimlerin gözlemlenmesine ve ölçülmesine izin veren optimize edilmiş basit bir protokol sunuyoruz. HEK hücre toplama tahlili, her biri membran bağlı konyak ligandlarını ifade eden iki bağımsız HEK hücresi popülasyonunun karıştırılmasıdır. Kısa bir kuluçka süresinden sonra, örnekler görüntülenir ve elde edilen agregalar ölçülür.

Introduction

Sinaptik yapışma molekülleri tarafından kolaylaştırılan sinaptik etkileşimler, sinapsların gelişimi, organizasyonu, spesifikasyonu, bakımı ve işlevi ve sinir ağlarının üretimi için temeldir. Bu transsynaptik hücre yapışma moleküllerinin tanımlanması hızla artmaktadır; bu nedenle, bağlayıcı ortakları tanımlamak ve bu yeni yapışma moleküllerinin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini anlamak temel olarak önemlidir. Ek olarak, genom dizilimi, yaygın olarak çok sayıda nörogelişimsel, nöropsikiyatrik ve bağımlılık bozukluğu ile bağlantılı olan bu yapışma moleküllerinin çoğunda mutasyonlar tanımlamıştır¹. Sinaptik hücre yapışma moleküllerini kodlay....

Protocol

1. Hücre kültürü ve transfeksiyon

1. DMEM, 1x (Dulbecco'nun Eagle's Medium Modifikasyonu) ile 4,5 g/L glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat ve %10 FBS ile desteklenmiş HEK hücre ortamı yapın. Steril filtre.
2. Toplama tahlilleri için predetermin uygun ligandlar ve reseptörler.
   NOT: Bu çalışmada Neurexin3α SS4+/- ve bilinen ligandlarından biri olan LRRTM2 kullanılmıştır. Ligandlar ve ilgi reseptörleri pcDNA3.1'deki cDNA'lardan ifade edildi. Neurexin3α'yı pcDNA3.1^12'yeyerleştirmek için bir Gibson montajı kullanıldı. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATCTGCAGAATTCTT....

Results

A687T mutasyonu Neurexin3α SS4'ü artırır- LRRTM2 7'ye bağlanma
Bilinen iki sinaptik proteinin hücreler arası etkileşimlerinin, zihinsel engelli ve epilepsili bir hastada bulunan bir nokta mutasyonunun ortaya girmesinden nasıl etkilendiğini araştırmak için yukarıdaki HEK hücre toplama testini kullandık (Şekil 1). Hücreler bölüm 1'e göre trans enfekte olmuş ve protokolün 1. ve 2. bölümlerine göre görüntüleme için hazırlanmıştır. Hücreler, beklendiği gibi toplanma.......

Discussion

Hücre yapışması sırasında transta meydana gelen protein-protein etkileşimlerinin parçalanması, olgunlaşma ve yeniden şekillendirme sırasında sinapsların oluşumu, işlevi ve bakımı da dahil olmak üzere temel hücresel süreçlerin altında bulunan moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına neden olabilir. Hücreden hücreye etkileşimlerin etkileri nörobiyolojinin ötesine genişler ve sinyal transdüksiyonunda, hücre göçünde ve doku gelişiminde daha geniş rollere sahiptir¹⁴. Hücre yapışmasındaki sapmala.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL geçmeli kapaklı tek kullanımlık mikrotüpler	VWR	89000-028	HEK hücrelerinin karışık popülasyonunun inkübasyonu
1000 mL Rapid— Akış Filtre Ünitesi, 0.2 um aPES membran	Thermo Fisher	567-0020	HEK ortamının sterilizasyonu
15 mL SpectraTube santrifüj tüpleri	Koğuş s Science	470224-998	HEK hücrelerinin toplanması
6 kuyulu steril doku kültürü plakaları	VWR	100062-892	HEK hücrelerinin kültürlenmesi
Kalsiyum Klorür	Sigma	223506-500G	Kalsiyum fosfat transfeksiyonu, HEK hücre resüspansiyonu
Santrifüj- Sorvall Legend RT	Kendro Laboratuvar Ürünleri	75004377	HEK hücrelerinin toplanması
CO2 hücre inkübatörü	Thermo Scientific	HERACELL 150i	Büyüme sırasında HEK hücrelerinin inkübasyonu
DMEM, 1x (Dulbecco'nun Eagle's Medium'un Modifikasyonu) 4.5 g / L glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat ile	Corning	10-013-CV	HEK hücre bakımı
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu PBS (1X)	Gibco	14190-144	Geçiş/hasat HEK hücresi
Etilendiamintetraasetik asit	Sigma	ED-500G	HEK hücrelerinin toplanması
Falcon Havalandırmalı kültür şişeleri, 75cm2 büyüme alanı	Corning	9381M26	HEK hücrelerinin kültürlenmesi
Fetal Sığır	Serumu Sigma	17L184	HEK hücre bakımı
HEK293T hücreleri	ATCC		Model sistemi
ImageJ	NIH	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	Görüntü analizi
Magnezyum Klorür hekzahidrat	Sigma	M9272-500G	HEK hücre resüspansiyonu
Sodyum fosfat dibazik susuz	Fisher BioReagents	BP332-500	Kalsiyum fosfat transfeksiyonu
Tripsin %0.25 (1X) Çözüm	GE Healthcare Life Fen Bilimleri	SH30042.01	HEK hücrelerinin geçirilmesi
Tüp döndürücü			HEK hücrelerinin karışık popülasyonunun inkübasyonu
, UltraClear Mikroskop slaytları. Beyaz buzlu, pozitif şarjlı	Denville Scientific Inc.	M1021	Görüntü elde
etme Geniş alan mikroskobu	Zeiss	Axio Vert 200M	Görüntü alma