Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İleri Genetik Ekran Kullanarak Transgenik Kalsiyum Reporter Aequorin Kalsiyum Sinyalyeni Hedefleri Belirlemek için

7.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61259

⸱

1 Ağustos 2020

 ,  ,  , 
1National Institute of Plant Genome Research, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi 110067, India

Bu makalede

Özet

Ca2+ yüksekliğine dayalı ileri genetik ekran, bitkilerde kalsiyuma bağımlı sinyal yollarında yer alan genetik bileşenlerin tanımlanmasına yol açar.

Özet

İleri genetik ekranlar çeşitli biyolojik yollarda yer genetik bileşenlerin tarafsız belirlenmesinde önemli araçlar olmuştur. Ekranın temeli ilgi bir fenotip ile taranabilir bir mutant popülasyon oluşturmaktır. EMS (etil metan sülfonat) herhangi bir süreçte yer alan birden fazla gentanımlamak için klasik ileri genetik ekranda rastgele mutasyon indükleyen yaygın olarak kullanılan bir alkilleyici ajandır. Sitosolik kalsiyum (Ca2+) yükseklik stres algısı üzerine aktive olan önemli bir erken sinyal yoludur. Ancak Ca2+ reseptörlerinin, kanallarının, pompalarının ve ışınlayıcılarının kimliği birçok çalışma sisteminde hala zordur. Aequorin, Aequorea victoria'dan izole edilmiş ve Arabidopsis ile ifade edilen hücresel kalsiyum muhabiri proteindir. Bunu sömürerek, aequorin transgenik eMS-mutajenize bir ileri genetik ekran tasarladık. Mutant bitkilerden elde edilen tohumlar toplandı (M1) ve ilgi fenotip için tarama ayrıştırma (M2)popülasyonunda yapıldı. 96-iyi yüksek-throughput Ca2 + ölçüm protokolü kullanılarak, çeşitli yeni mutantlar farklı bir kalsiyum yanıtı var ve gerçek zamanlı olarak ölçülür tespit edilebilir. İlgi fenotipleri olan mutantlar kurtarılır ve homozigot mutant bitki popülasyonu elde edilene kadar yayılır. Bu protokol, Ca2+ muhabir arka planında ileri genetik ekranlar için bir yöntem sağlar ve yeni Ca2+ düzenlenmiş hedefleri tanımlar.

Giriş

Biyotik veya abiyotik uyarıcı algısı üzerine sitosolik kalsiyum (Ca2 +) konsantrasyonunda bir değişiklik birçok sinyal yolları 1 aktive bir iyi çalışılmış erken sinyalolaydır 1,2,3,4. Bazal istirahat durumunda bir hücre sitosol daha düşük Bir Ca2 + konsantrasyonu korur ve çeşitli hücre içi organeller de Ca2 + fazla sekanslar ve sarp Ca 2+ gradyan5,yol açan hücre dışı apoplast ,6. Sinyal algısı üzerine, Ca2 + düzeyleri ekstrasellüler ve / veya hücre içi kaynaklardan Ca2 + bir akını nedeniyle sitosol artış ve bir uyarıcı özel kalsiyum imza oluşturmak7,8,9. Sitosol Ca2 + yükseklikleri birçok uyarantarafından aktive edilir, ancak özgüllük ca2 serbestfarklı mağazalar tarafından korunur + , benzersiz bir Ca 2+ imza ve uygun sensör proteinleri10,11.

Mutagenez için alkilleyici ajan, etil metan sülfonat (EMS) kullanımı, bir süreçte yer alan birden fazla bağımsız geni tanımlamak için klasik ileri genetik ekranlarda güçlü bir araçtır. EMS, c'den T'ye ve G'yi genomun her 125 kb'sinde rastgele a geçişlerine neden olan ve 1 bp'lik bir değişim üreten kimyasal bir mutajentir. EMS mutagenezi12genom başına ekleme/silme (InDel) veya tek nükleotit polimorfizm (SNP) olmak üzere 1000 tek baz çifti değişikliğine neden olur. EMS'ye bağlı mutasyonlar, lokus başına 1/300 ile 1/30000 arasında değişen mutasyon frekansı ile birden fazla nokta mutasyonudır. Bu, belirli bir gende mutasyon bulmak için gereken M1 bitkilerinin sayısını azaltır. 2000-3000 Bir M1 tohum popülasyon aralığı genellikle Arabidopsis thaliana13ilgi mutasyonları elde etmek için kullanılır,14.

Aequorin transgenics Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) ekotip bitkiler p35S-apoaequorin (pMAQ2) sitosol15ifade vardır. Aequorin apoprotein ve luciferin molekülü, coelenterazin oluşan bir protez grubu oluşan bir Ca2 + bağlayıcı proteindir. Ca2+ aequorin bağlanması, hangi üç Ca2 + bağlayıcı EF-hands siteleri vardır, coelenterazine okside ve dioksettanon ara vermek için siklize sonuçları, karbondioksit ve tek-heyecanlı coelenteramideserbest eşlik eden protein konformasyonel bir değişiklik izledi16. Coelenteramid böylece üretilen bir mavi ışık yakar (λmax, 470 nm) luminometer tarafından tespit edilebilir17. Son derece hızlı Ca2 + yükseklikleri böylece gerçek zamanlı olarak ölçülebilir, ve hızlı ileri genetik ekranlar için istismar. Bu protokol, Ca2+ imzasıyla ilgili yeni kilit oyuncuları tanımlamak için kalsiyum tepkisinin özgüllüğünü kullanmayı amaçlamaktadır. Bu görevi başarmak için transgenik aequorin'de EMS mutagenezkullanır ız ve değiştirilmiş Ca2+ sinyalizasyonuile ilişkili SNP'leri tanımlarız. Protokol, uyaran ların eklenmesi üzerine Ca2+ yükseklikleri göstermeyen veya küçülten mutantları tanımlar. Bu mutantlar daha sonra Ca2 + yanıtı sorumlu genleri tanımlamak için eşlenebilir. Bu yöntem, bitkilerde Ca2+ yüksekliğiile sonuçlanan her türlü sıvı uyaran için geçerlidir. Ca2+ yüksekliği bitki savunma sinyal yolundaki ilk tepkilerden biri olduğundan, yukarı akım tepki bileşenlerinin belirlenmesi dirençli bitkiler geliştirmek için genetik mühendislik adayları sağlayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. EMS mutagenez ve tek soy bazlı tohum toplama (1-3 ay)

  1. EMS mutagenez (M0 tohum) için aequorin 150 mg tohum (~7500) tartın. Bir kontrol olarak kullanılmak üzere tohum başka bir 150 mg tartın.
  2. Tohumları 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 25 mL %0,2 EMS (v/v) (DİkKAT) veya 25 mL otoklavlı su (kontrol için) ekleyin.
    NOT: Etil-metan sülfonat, bitki materyalini mutasyona uğratan kimyasal bir maddedir.
  3. Tüpü parafilm ile kapatın ve alüminyum folyoya sarın. Tüpü oda sıcaklığında 18 saat boyunca uçuçta döndürün.
  4. Tohumların yerleşmesine izin ver. EMS çözeltisini dikkatlice çıkarın ve eşit hacimlerde 1 M NaOH içeren bir atık kabına atın (NaOH, EMS'nin atılması güvenli hale getirilmesini sağlayan EMS'yi nötralize etmeye/inaktive etmeye yardımcı olur). Kullanılan plastik leri 1 M NaOH çözeltisinde atın.
    NOT: 24 saat sonra, tehlikeli madde laboratuvar uygulamalarına göre atar atın.
  5. Mutajenize edilmiş tohumları en az 8 kez 40 mL otoklavlı su ile iyice yıkayın. Yukarıda belirtildiği gibi bir NaOH atık kabına su içeren EMS atın.
  6. Son yıkama için 40 mL 100 mM sodyum tiyosülfat ekleyin ve EMS izlerini gidermek için 3 kez durulayın.
  7. Tohumları 40 mL otoklavlı suda ıslatın ~ 1 saat tohumlardan EMS dağıtmak için ve sonra tamamen kuruyana kadar filtre kağıdına yerleştirin.
  8. Tohumları mikrosentrifüj tüpüne aktarın ve tohumları 4 °C'de 40 mL otoklavlı suda 2-4 gün boyunca katmanlayın. Bu tohum atıllığı kırma yardımcı olur ve homojen büyüme sağlar.
  9. Hem mutajenize tohumları (M0)hem de kontrol tohumlarını toprağa (toprak bileşimi: agropet: soilrite, 1:1) aktarın ve 16 saat ışık/8 h karanlık fotoperi, 150 μmol−m−2−s−s −1 ve ~%70 bağıl nem ile büyüme odalarına aktarın.
  10. Mutagenezin başarılı olup olmadığını belirlemek için çimlenme hızının ve fide büyümesinin azalmasını ve klorofil leziz18'i arayın (Şekil 1A).18 Bu fizyolojik ve gelişimsel farklılıkları belirlemek için kontrol tesisleri ile mutajenize edilmiş bitkileri karşılaştırın.
    NOT: M1 bitkilerinden tohum hasat için farklı yöntemler kullanılabilir. Bu protokolde tek soy bazlı tohum toplama yöntemini kullandık. Her M1 tesisine A1'den A3500'e kadar benzersiz bir numara verilir.
  11. Ayrı ayrı numaralanmış bitkileri ayrı ayrı bitki hatları olarak koruyun(Şekil 1B).
  12. Olgunlaşma üzerine, bu bireysel mutant bitkilerden tohum hasat ve bireysel M1 hatları olarak saklamak(Şekil 2). Tek soy bazlı tohum koleksiyonundan, 3500 M 1 hattının 3500 M1 hattının tarandığı yaklaşık 5000 M1 hattı elde ettik.

2. Mutantları seçmek için yüksek iş tarama (8 ay)

  1. Seçilen bir uyarıcıya Ca2+ yanıtına dayanan yeni mutantları tanımlayın. Burada, bir örnek olarak H2O2 kullanılır.
  2. Mutantları tanımlamak için M2 neslini tarar. Resesif mutantlar EMS mutagenezi14üzerine M2 kuşağında 1/8 frekansta ayrıştırık olduğundan, 8-12 M2-ayırıcı bitkilerin taranması bir M1 hattını kaplar ve homozigot bir resesif mutantı tanımlar (12 fide kullanarak mutant bulma olasılığını artırır). Her bağımsız M1 serisinden, Ca2+ yanıtı için 12 M2 fidesini H2O2 (M1 satırıbaşına 12 M2 fide) test edin.
  3. Yüksek iş biçen tohum sterilizasyonu ve hidroponik bitki büyüme protokolükullanın 19. 24 kuyulu doku kültür plakasının tek tek kuyularında M1 serisi başına yaklaşık 12-15 M2 tohum yerleştirin ve klor gazı (40 mL %12 sodyum hipoklorit ve hidroklorik asit, 3:1, v/v) bir dezikkatöre bir duman kaputunda 4 saat sterilize edin. İşlemden sonra, kurutucuyu açın ve klor gazının buharlaşması için bir gecede bırakın.
  4. Sterilizasyondan sonra, plakaları dışarı getirin ve tek tek kuyulara sıvı 1/2 MS ortam (agarsız yarı mukavemetli MS) ekleyin. Plakaları parafilm ile kapatın ve tohumları 4 °C'de 2-4 gün boyunca yapıştırın ve tohumları %70 bağıl nem oranıyla 20-22 °C'de 10 saat Açık/ 14 saat karanlık fotoperiyotla bir büyüme odasına taşıyın.
  5. Fideler 8-12 günlük olduktan sonra, her çizgiden ayrı ayrı 12 M2 fideyi 96 kuyulu bir luminometre plakası koyun. Ca2+ yanıtını H2O2'yeölçmek için bir luminometre plaka okuyucu kullanın.
  6. Fide transferinden sonra, 150 μL 5-10 μM coelentrazine çözeltisi (metanoldeki 5 mM'lik bir stoktan otoklavlı suda seyreltilmiş) (DİkKAT) koyu/düşük ışıklı bir alanda ayrı kuyularda ve 21 °C'de karanlıkta 8 saat saklayın.
    NOT: Coelentrazine apo-aequorin bağlanır ve fonksiyonel aequorin için yeniden bir protez grubudur. Coelentrazine ışığa duyarlıdır ve bu nedenle ışıktan korunan koyu renkli şişelerde saklanır.
  7. Ertesi gün, bir uyarıcı olarak 10 mM H2O2 kullanarak mutant ekran gerçekleştirmek ve sonraki Ca2 + tepki ölçmek.
  8. 24 kuyunun eşzamanlı ölçümü için, arka planı 1 dakika ölçen, ardından uyaran ilavesi (40 μL) ve 10 dk ölçümü, ardından toplam aequorin deşarjı (150°L 20 etanolde2 MCaCl) ile 1-2 dakika boyunca ölçülür otomatik bir kinetik program oluşturun.
    NOT: Ölçülen Ca2+ miktarını ölçmek için toplam aequorin için bir son deşarj ve fonksiyonel aequorin için ek kontrol gereklidir. Son deşarj 1-2 dk kısa bir çalışma ve önemli bitki ölümüne neden olmaz. Alternatif olarak, bitkiler deşarj adımından sonra ölürse, belirli M1 hattını yeniden taranır ve deşarj olmadan kurtarın. Bu tür mutantlar deşarj adımı kullanılarak M3 ve M4 nesillerinde teyit edilebilir.
  9. Her satırı 7 s aralığında ölçen ve ölçüm noktası başına 300 ms entegrasyon süresi ölçen 24 iyi formatlı bir tarama yöntemi kullanın. Karşılaştırma ve mutant değerlendirilmesi için her satırda kontrol olarak bir vahşi tip fide kullanın.
    NOT: M2 fidesi içeren tek bir 96 kuyu plakası 8 ayrı M1 çizgisini (8 M1 *12=96 M2)kapsayacak ve 2,5 saat taranabilir ve her gün 32 M1 hat, ayda 640 M1 bitki taranacaktır. Bitkiler hazır olduktan sonra tüm tarama işlemi yaklaşık 8 ay sürer.
  10. H2O2ile ca2+ yanıtı kaybına veya azaltılmış yanıta göre mutantları tanımlayın. Seçilen mutantları antibiyotik bazlı bir yıkama işlemi yle kurtarın. Fideyi 25 mg/L sefotaksim çözeltisi ile iki kez yıkayın ve 1/2 MS agar'da 25 mg/L sefotaksim içeren kurtarma ortamına aktarın.
  11. Bir mutant bitki elde etmek için 10 saat ışık / 14 saat karanlık fotoperiod plakaları büyütün. Sefotaksim yıkama fide üzerinde herhangi bir zararlı mikroorganizmaların kaldırmak için yardımcı olur. Yeniden yapılanma sonrası fideler mühürsüz tutulduğundan, steril duruma geri aktarılırken kontaminasyonu en aza indirin.
  12. Homozigot M3 popülasyonunu elde etmek için mutant bitkiyi toprağa aktarın.

3. Veri analizi ve mutant tanımlama (1-3 ay)

NOT: Yukarıdaki yöntemden elde edilen ölçümler göreli ışık birimlerinde (RLU) bulunmaktadır.

  1. [Ca2+]cyt konsantrasyonu hesaplamak için aşağıdaki konsantrasyondenklemini kullanın 20.
    pCa = 0.332588(−log (L/Lmax)) + 5.5593
    Luminesans sayıları () ve toplam kalan sayımlar(max).
  2. Elde edilen pCa değerlerini 106ile çarparak [Ca2+]cyt değerlerine dönüştürün. Daha sonra grafiksel ca2 + yanıt putatif H2O2 mutantlar tanımlamak için bir aequorin (transgenik Col-0 aequorin) kontrol karşı arsa.
  3. Kurtarma fidelerinde kayıp veya azalan yanıt gösteren H2O2 uygulaması kurtarıldı.
  4. Olgunlaşma üzerine, kurtarılan mutant tohumları hasat ve M3 fideh2O2 yanıt için yeniden ekran. Tüm 12 M3 fideler anne bitki benzer bir Ca2 + yanıt gösteriyorsa, homozigot M3 mutant popülasyon olarak nüfus düşünün. Tüm 12 fide böyle bir yanıt görünmüyorsa, o zaman M4 nesil götürün ve homozigot nüfus elde etmek için yeniden ekran.
  5. Homozigot bir bitki hattı elde edildikten sonra, yeni nesil sıralama kullanarak değiştirilmiş fenotip giden geni tanımlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

EMS popülasyonu H2O2 indüklenen Ca2+ yüksekliği için tarandı. Daha önce de belirtildiği gibi, her M1 serisinden 12 ayrı M2 fidesi tarandı. Şekil 3'te,12 ayrı M2 fidesini gösteren her panelile böyle bir M1 çizgisi çizilir. Bir vahşi tip aequorin karşılaştırma ve mutant yanıtı değerlendirmek için kontrol olarak kullanılır. 1:7 (mutant: mutant olmayan) oranında bir resesif mutant ayrılır. M1 hattı başına 12 ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

EMS mutagenez popülasyonda mutasyonlar oluşturmak için güçlü bir araçtır. EMS kullanan klasik ileri genetik ekranlar iki önemli nedenden dolayı yeni genleri tanımlamak için etkili bir araç olmuştur: birincisi, gen kimliği üzerinde önceden varsayımlar gerektirmez ve ikinci olarak, herhangi bir önyargı tanıtmak yok. EMS, T-DNA eklemeleri, radyasyon vb. gibi tarama popülasyonları oluşturmak için çeşitli yöntemler vardır. Tüm yöntemler arasında EMS tabanlı mutagenezinin diğer yöntemlere göre çok az avantajı vardır. İlk olara...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların hiçbirinin beyan etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Teşekkürler

Ulusal Bitki Genom Araştırma Enstitüsü - Bitki büyümesi için Fitotron Tesisi, video çekimi için Bombay Locale ve e-kaynaklara erişim sağlayan Biyoteknoloji- eLibrary Konsorsiyumu Bölümü'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma Biyoteknoloji Bölümü, Hindistan Ulusal Bitki Genom Araştırma Çekirdek Hibe Enstitüsü, Max Planck Gesellschaft-Hindistan Ortak Grup programı ile desteklenmiştir; ve CSIR-Junior Araştırma Bursu (D.M ve S.M.'ye) ve Biyoteknoloji-Junior Araştırma Bursu Bölümü (R.P.'ye).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fide yetiştirmek için24 kuyulu doku kültürü plakasıJetbiofil11024
Luminometre ölçümleri için96 kuyulu beyaz kliniplateThermo Scientific9502887
Aequorin
AgropetLab Chem Hindistanbüyümesi için
Kalsiyum klorürFisher Scientific12135deşarj için çözelti
CoelenterazinePJK55779-48-1aequorin için protez grubu
Tohummutajenezi içinSigma AldrichM0880-5G
EtanolDeşarj çözeltisi içinanalitik reaktif1170
Hidroklorik asitMerck Yaşam Bilimleri1.93001.0521sterilizasyon çözeltisi
Hidrojen peroksitKalsiyum yükselmesi için uyarıcı olarakFisher Scientific15465
Luminoskan yükselişiThermo Scientific5300172aequorin lüminesans ölçümü
MES tamponuHimediaRM1128-100Gbitki büyümesi
Murashige ve skoog mediaHimediaPT021-25Lbitki büyümesi
Sodyum hidroksitFisher Scientific27805EMS'yi nötralize etmek için
Sodyum hipokloritMerck Yaşam Bilimleri1.93607.5021sterilizasyon çözeltisi
Sodyum tiyosülfatFisher Scientific28005adım 1.6'da tohum yıkama için
soilriteLab Chem Hindistanbitki büyümesi için
Kare saksılarLab Chem HindistanBitki büyümesi için
SükrozSigma AldrichFide kurtarma için S0389bitki büyümesi
TaximAlkem7180720
bitki

Kaynaklar

  1. Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
  2. Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
  3. Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
  4. Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  5. White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
  6. Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162(2014).
  7. Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
  8. Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
  9. Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
  10. Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
  11. McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
  12. Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
  13. Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
  14. Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
  15. Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
  16. Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
  17. Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
  18. Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399(2015).
  19. Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
  20. Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
  21. Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
  22. Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394(2018).
  23. Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
  24. Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362(2007).
  25. Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
  26. Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
  27. Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
  28. Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
  29. Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
  30. Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
  31. Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
  32. Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
  33. Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
  34. Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
  35. Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
  36. Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
  37. Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

EMS MutajeneziAequorin ReporterCoelenterazine zeltisiY ksek Kapasiteli TaramaHidrojen Peroksit Stimul sSitozolik Kalsiyum l mArabidopsis thalianaGen Haritalama
İleri Genetik Ekran Kullanarak Transgenik Kalsiyum Reporter Aequorin Kalsiyum Sinyalyeni Hedefleri Belirlemek için
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.