Ca2+ yüksekliğine dayalı ileri genetik ekran, bitkilerde kalsiyuma bağımlı sinyal yollarında yer alan genetik bileşenlerin tanımlanmasına yol açar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İleri Genetik Ekran Kullanarak Transgenik Kalsiyum Reporter Aequorin Kalsiyum Sinyalyeni Hedefleri Belirlemek için
Bu makalede
Özet
Özet
İleri genetik ekranlar çeşitli biyolojik yollarda yer genetik bileşenlerin tarafsız belirlenmesinde önemli araçlar olmuştur. Ekranın temeli ilgi bir fenotip ile taranabilir bir mutant popülasyon oluşturmaktır. EMS (etil metan sülfonat) herhangi bir süreçte yer alan birden fazla gentanımlamak için klasik ileri genetik ekranda rastgele mutasyon indükleyen yaygın olarak kullanılan bir alkilleyici ajandır. Sitosolik kalsiyum (Ca2+) yükseklik stres algısı üzerine aktive olan önemli bir erken sinyal yoludur. Ancak Ca2+ reseptörlerinin, kanallarının, pompalarının ve ışınlayıcılarının kimliği birçok çalışma sisteminde hala zordur. Aequorin, Aequorea victoria'dan izole edilmiş ve Arabidopsis ile ifade edilen hücresel kalsiyum muhabiri proteindir. Bunu sömürerek, aequorin transgenik eMS-mutajenize bir ileri genetik ekran tasarladık. Mutant bitkilerden elde edilen tohumlar toplandı (M1) ve ilgi fenotip için tarama ayrıştırma (M2)popülasyonunda yapıldı. 96-iyi yüksek-throughput Ca2 + ölçüm protokolü kullanılarak, çeşitli yeni mutantlar farklı bir kalsiyum yanıtı var ve gerçek zamanlı olarak ölçülür tespit edilebilir. İlgi fenotipleri olan mutantlar kurtarılır ve homozigot mutant bitki popülasyonu elde edilene kadar yayılır. Bu protokol, Ca2+ muhabir arka planında ileri genetik ekranlar için bir yöntem sağlar ve yeni Ca2+ düzenlenmiş hedefleri tanımlar.
Giriş
Biyotik veya abiyotik uyarıcı algısı üzerine sitosolik kalsiyum (Ca2 +) konsantrasyonunda bir değişiklik birçok sinyal yolları 1 aktive bir iyi çalışılmış erken sinyalolaydır 1,2,3,4. Bazal istirahat durumunda bir hücre sitosol daha düşük Bir Ca2 + konsantrasyonu korur ve çeşitli hücre içi organeller de Ca2 + fazla sekanslar ve sarp Ca 2+ gradyan5,yol açan hücre dışı apoplast ,6. Sinyal algısı üzerine, Ca2 + düzeyleri ekstrasellü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. EMS mutagenez ve tek soy bazlı tohum toplama (1-3 ay)
- EMS mutagenez (M0 tohum) için aequorin 150 mg tohum (~7500) tartın. Bir kontrol olarak kullanılmak üzere tohum başka bir 150 mg tartın.
- Tohumları 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 25 mL %0,2 EMS (v/v) (DİkKAT) veya 25 mL otoklavlı su (kontrol için) ekleyin.
NOT: Etil-metan sülfonat, bitki materyalini mutasyona uğratan kimyasal bir maddedir. - Tüpü parafilm ile kapatın ve alüminyum folyoya sarın. Tüpü oda sıcaklığında 18 saat boyunca uçuçta döndürün.
- Tohumların yerleşmesine izin ver. EMS çözeltisini dikkatlice çıkarın ve eşit hacimlerde 1 M NaOH içeren bir atık kabı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
EMS popülasyonu H2O2 indüklenen Ca2+ yüksekliği için tarandı. Daha önce de belirtildiği gibi, her M1 serisinden 12 ayrı M2 fidesi tarandı. Şekil 3'te,12 ayrı M2 fidesini gösteren her panelile böyle bir M1 çizgisi çizilir. Bir vahşi tip aequorin karşılaştırma ve mutant yanıtı değerlendirmek için kontrol olarak kullanılır. 1:7 (mutant: mutant olmayan) oranında bir resesif mutant ayrılır. M1 hattı başına 12 .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
EMS mutagenez popülasyonda mutasyonlar oluşturmak için güçlü bir araçtır. EMS kullanan klasik ileri genetik ekranlar iki önemli nedenden dolayı yeni genleri tanımlamak için etkili bir araç olmuştur: birincisi, gen kimliği üzerinde önceden varsayımlar gerektirmez ve ikinci olarak, herhangi bir önyargı tanıtmak yok. EMS, T-DNA eklemeleri, radyasyon vb. gibi tarama popülasyonları oluşturmak için çeşitli yöntemler vardır. Tüm yöntemler arasında EMS tabanlı mutagenezinin diğer yöntemlere göre çok az avantajı vardır. İlk olara.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların hiçbirinin beyan etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.
Teşekkürler
Ulusal Bitki Genom Araştırma Enstitüsü - Bitki büyümesi için Fitotron Tesisi, video çekimi için Bombay Locale ve e-kaynaklara erişim sağlayan Biyoteknoloji- eLibrary Konsorsiyumu Bölümü'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma Biyoteknoloji Bölümü, Hindistan Ulusal Bitki Genom Araştırma Çekirdek Hibe Enstitüsü, Max Planck Gesellschaft-Hindistan Ortak Grup programı ile desteklenmiştir; ve CSIR-Junior Araştırma Bursu (D.M ve S.M.'ye) ve Biyoteknoloji-Junior Araştırma Bursu Bölümü (R.P.'ye).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Fide yetiştirmek için | 24 kuyulu doku kültürü plakası | Jetbiofil | 11024 |
| Luminometre ölçümleri için | 96 kuyulu beyaz kliniplate | Thermo Scientific | 9502887 |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem Hindistan | büyümesi için | |
| Kalsiyum klorür | Fisher Scientific | 12135 | deşarj için çözelti |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | aequorin için protez grubu |
| Tohum | mutajenezi için | Sigma Aldrich | M0880-5G |
| Etanol | Deşarj çözeltisi için | analitik reaktif | 1170 |
| Hidroklorik asit | Merck Yaşam Bilimleri | 1.93001.0521 | sterilizasyon çözeltisi |
| Hidrojen peroksit | Kalsiyum yükselmesi için uyarıcı olarak | Fisher Scientific | 15465 |
| Luminoskan yükselişi | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin lüminesans ölçümü |
| MES tamponu | Himedia | RM1128-100G | bitki büyümesi |
| Murashige ve skoog media | Himedia | PT021-25L | bitki büyümesi |
| Sodyum hidroksit | Fisher Scientific | 27805 | EMS'yi nötralize etmek için |
| Sodyum hipoklorit | Merck Yaşam Bilimleri | 1.93607.5021 | sterilizasyon çözeltisi |
| Sodyum tiyosülfat | Fisher Scientific | 28005 | adım 1.6'da tohum yıkama için |
| soilrite | Lab Chem Hindistan | bitki büyümesi için | |
| Kare saksılar | Lab Chem Hindistan | Bitki büyümesi için | |
| Sükroz | Sigma Aldrich | Fide kurtarma için S0389 | bitki büyümesi |
| Taxim | Alkem | 7180720 |
Kaynaklar
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
