Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Optik lob görselleştirmesi için larva ve erişkin drosophila beyinlerinin diseksiyonu, immünohistokimyası ve montajı

5.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61273

⸱

28 Nisan 2021

 ,  ,  , 
1Departments of Biology and Cell & Systems Biology, University of Toronto - Mississauga

Bu makalede

Özet

Bu protokol, larva ve yetişkin Drosophila optik loblarını görüntüleme için hazırlamak için üç adımı tanımlar: 1) beyin diseksiyonları, 2) immünohistokimya ve 3) montaj. Belirli optik lob yapılarını görselleştirmek için farklı montaj yönleri gerektiğinden, adım 3'e vurgu yapılır.

Özet

Dört nöropilden oluşan Drosophila optik lob: lamina, medulla, lobüla ve lobüla plakası, nöral çeşitliliği oluşturan ve devre montajını yönlendiren gelişimsel mekanizmaları keşfetmek için mükemmel bir model sistemdir. Karmaşık üç boyutlu organizasyonu göz önüne alındığında, optik lobun analizi, yetişkin nöropillerinin ve larva progenitörlerinin birbirlerine ve merkezi beyne göre nasıl konumlandırıldığını anlamayı gerektirir. Burada, optik lob görüntülemesi için larva ve yetişkin beyinlerinin diseksiyonu, immün boyaması ve montajı için bir protokol tarif ediyoruz. Montaj oryantasyonu ile optik lobun uzamsal organizasyonu arasındaki ilişkiye özel önem verilmektedir. Larvada üç (ön, arka ve yanal) ve yetişkinde üç (ön, arka ve yatay) montaj stratejisi tanımladık ve bunların her biri farklı bir optik lob yapısı için ideal bir görüntüleme açısı sağlar.

Giriş

Bileşik göz ve altta yatan optik lobdan oluşan Drosophila görsel sistemi, nöral devre gelişimi ve işlevinin incelenmesi için mükemmel bir model olmuştur. Son yıllarda, özellikle optik lob, nörojenez ve devre kablolaması gibi nörogelişimsel süreçleri incelemek için güçlü bir sistem olarak ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5,6,7,8. Dört nöropilden oluşur: lamina, medulla, lobüla ve lobüla plakası (son ikisi lobüla kompleksini oluşturur)1,2,3,4,5,6. Gözden gelen fotoreseptörler, görsel girdileri işleyen ve bunları lobüla kompleksi 1,2,3,4,5,6'nın nöropillerine ileten lamina ve medulla nöronlarını hedefler. Lobula kompleksindeki projeksiyon nöronları daha sonra merkezi beyindeki daha üst düzey işlem merkezlerine görsel bilgi gönderir 1,5,9. Retinotomiyi sürdürme ve farklı görsel uyaran türlerini işleme ihtiyacının gerektirdiği optik lobun karmaşık organizasyonu, onu karmaşık nöral devrelerin nasıl bir araya getirildiğini incelemek için çekici bir sistem haline getirir. Özellikle, medulla, omurgalı nöral devre gelişimi için uzun süredir bir model olan nöroretina ile hem organizasyonunda hem de gelişiminde çarpıcı benzerlikler paylaşır 3,8.

Optik lob gelişimi, embriyogenez sırasında, optik placode2,4,5,6,7,8'i oluşturan ~ 35 ektodermal hücrenin spesifikasyonu ile başlar. Larva yumurtadan çıktıktan sonra, optik plakod iki farklı primordiyaya ayrılır: 1) lamina ve dış medulla nöronlarını üreten dış proliferasyon merkezi (OPC) ve 2) iç medulla ve lobula kompleksinin nöronlarını üreten iç proliferasyon merkezi (IPC) 4,5,6,10. Geç ikinci instar larvada, OPC ve IPC'nin nöroepitel hücreleri, daha sonra ara ganglion ana hücreleri 4,5,11,12 yoluyla nöronlar üreten nöroblastlara dönüşmeye başlar. Optik lob nöroblastları, döllerinde nöral çeşitlilik oluşturmak için birlikte hareket eden uzamsal ve zamansal olarak kısıtlı transkripsiyon faktörleri tarafından modellenir 11,12,13,14. Pupada, optik lob nöropillerinin devreleri, programlanmış hücre ölümü11,15, nöronal göç12,16, aksonal/dendritik hedefleme10,17, sinaps oluşumu18,19 ve nöropil rotasyonları10,17 dahil olmak üzere çeşitli süreçlerin koordinasyonu yoluyla birleştirilir.

Burada, larva ve yetişkin beyinlerinin optik lobun görüntülenmesi için diseke edildiği, immün olarak boyandığı ve monte edildiği metodolojiyi açıklıyoruz. Karmaşık üç boyutlu organizasyonu göz önüne alındığında, optik lobun analizi, yetişkin nöropillerinin ve larva progenitörlerinin birbirlerine ve merkezi beyne göre nasıl konumlandırıldığını anlamayı gerektirir. Bu nedenle, montaj oryantasyonunun optik lob yapılarının mekansal organizasyonu ile nasıl ilişkili olduğuna özel bir önem veriyoruz. Larva beyinleri için üç (ön, arka ve yanal) ve yetişkin beyinleri için üç (ön, arka ve yatay) montaj stratejisi tanımladık ve bunların her biri belirli bir optik lob progenitör popülasyonunu veya nöropilini görüntülemek için en uygun açıyı sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Larva beyinlerinin konfokal görüntüleme için hazırlanması

  1. Diseksiyonlar
    NOT: Diseksiyona başlamadan önce, düzeltme (fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 formaldehit) ve PBT (PBS'de% 0.1-0.3 Triton) çözeltilerini hazırlayın. Sabitleme solüsyonu diseksiyon sırasında buz üzerine yerleştirilmelidir. Bu protokolde paraformaldehit (PFA) fiksatifi kullanılmasına rağmen, spesifik epitoplar için alternatif fiksasyon stratejileri (PLP20 veya PEM21 kullanılarak) tanımlanmıştır. Larva diseksiyonları için iki çift forseps (Dumont # 5 veya #55s) gereklidir. Daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosuna bakın.
    1. Diseksiyon kabının her bir kuyusunu 400 μL 1x PBS ile doldurarak başlayın. Şişenin içinde sürünen dolaşan üçüncü instar larvalarını nazikçe seçmek için bir çift forseps kullanın. Larvaları PBS dolu tabağın ilk kuyusuna yerleştirin.
    2. Bir larva alın ve orta kuyuya aktarın. Baskın olmayan eli kullanarak, larvaların gövdesini kuyunun tabanında tutun.
    3. Baskın el ile larva ağız kancasını nazikçe kavrayın ve vücuttan çekin. Larva beyni, ağız kancasına ve diğer yardımcı dokuya bağlı olmalıdır ve doku çekildikçe çıkacaktır.
    4. Aksesuar hayali diskleri çıkarın ve larva beynini diseksiyon kabının üçüncü kuyusuna aktarın. Hayali diskler, larva beynini çevreleyen ve antenler, gözler, bacaklar ve kanatlar gibi yetişkin yapıları oluşturan epitel dokularıdır20. Doku üzerinde bırakılırsa, hayali diskler larva beyninin uygun şekilde immün boyanmasını engelleyebilir.
      1. Hayali diskleri çıkarmak için, beyni ventral sinir kordonu yoluyla sıkıca kavramak için bir çift forseps kullanın. Başka bir forseps çifti kullanarak, diskleri yavaşça koparın.
      2. Beyin loblarının yüzeyini sardığı için göz diskini dikkatlice çıkarın. Göz diskini çıkarmak için, beyni tabağın tabanına karşı tutmak için bir çift forseps kullanın. Beyni ventral sinir kordonu yoluyla tutmak yerine, lobu sıkmamaya dikkat ederek beyin lobunu hafifçe kavramak için forseps kullanın. Başka bir forseps kullanarak göz diskini nazikçe çekin.
        NOT: Göz görme diski sonunda retinanın fotoreseptörlerine yol açacaktır. Retina ve optik lob arasındaki sinirsel bağlantıyı incelemekle ilgilenenler için, göz diski beyinde bırakılabilir. Bununla birlikte, yalnızca optik lob yapılarıyla ilgilenenler için, beyin yüzeyindeki konumu nedeniyle görüntü kalitesini engelleyebileceği için göz diskinin çıkarılması önerilir.
    5. Yeterli sayıda beyin toplanana kadar (veya 30 dakikalık diseksiyon süresi geçene kadar) 1.1.2\u20121.1.4 adımlarını tekrarlayın. Doku bütünlüğünün bozulmamasını sağlamak için diseksiyonlar 30 dakikadan uzun sürmemelidir.
    6. Diseksiyon süresi sona erdiğinde, PBS'yi üçüncü kuyucuktan dikkatlice çıkarmak için bir P200 pipeti kullanın. Beyinleri suya batırmak için kuyuda küçük bir hacimde sıvı kaldığından emin olun.
      NOT: Protokolün tüm noktalarında beyinleri sıvıya batırmak çok önemlidir. Doku kurursa, lekenin kalitesi konfokal görüntüdeki istenmeyen otofloresan nedeniyle tehlikeye girebilir.
    7. Üçüncü kuyucuğa 500 μL soğuk sabitleme çözeltisi ekleyin. Sıvıyı hafifçe karıştırmak için bir çift forseps kullanın ve beynin tabakta dönmesine izin verin. Çanağı bir cam slaytla örtün ve doku fiksasyonuna izin vermek için 30 dakika boyunca buzun üzerine koyun.
    8. Fiksasyon solüsyonunu çıkarın ve beyinleri 5 kez 400 μL PBT ile yıkayın.
      NOT: Triton, PBT'de bulunan ve beyinlerin birbirine veya tabağa yapışmasını önleyen ve dokuyu optimal antikor penetrasyonu için hazırlayan bir deterjandır.
  2. İmmünohistokimya
    NOT: Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası'ndan (DSHB) belirli optik lob yapılarını veya hücre tiplerini etiketlemek için kullanılabilecek birkaç birincil antikor vardır. DE-Cadherin, IPC ve OPC nöroepitelini, Bruchpilot (Brp) gelişmekte olan nöropili, Dachshund ise lamina ve lobula nöronlarını (ve ayrıca medulla nöronlarının küçük bir alt kümesini) etiketler. Ek olarak, Elav nöronları etiketlemek için, Prospero ganglion ana hücrelerini işaretlemek için ve Repo glia'yı tanımlamak için kullanılabilir.
    1. PBT'ye toplam 100 μL hacme kadar antikorlar ekleyerek birincil antikor çözeltisini hazırlayın. Primer antikor ile doku20,22,23 arasındaki spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için bir bloke edici ajan (%10 normal keçi serumu) kullanılabilir. Bu protokolde kullanılan antikorlar, bloke edici ajanlara ihtiyaç duymadan beyin dokusunu spesifik olarak etiketler.
    2. Son fiksasyon sonrası yıkamayı çıkarın ve birincil antikor solüsyonunu ekleyin. Antikor çözeltisini eklemeden önce kuyuda sadece az miktarda PBT olduğundan emin olun. Solüsyonu ekledikten sonra, beyinleri forseps ile 5-u201210 kez hafifçe karıştırın. Bir cam slayt ile örtün, laboratuvar filmi ile kapatın ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
      1. Alternatif olarak, soğutulmuş bir orbital çalkalayıcı mevcutsa, gece boyunca inkübasyonu optimize etmek için tabağı çalkalayıcının üzerine yerleştirin.
        NOT: Birincil antikor inkübasyonu ve sonraki tüm adımlar alternatif olarak 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde gerçekleştirilebilir. Primer ve sekonder inkübasyonların hacmi 100 μL kalabilir, ancak yıkama adımları 800 μL veya daha fazla PBT ile gerçekleştirilmelidir.
    3. İnkübasyondan sonra, önceki bölümün 1.1.8 adımında olduğu gibi primer antikorları PBT ile yıkayın.
      NOT: Birincil antikor çözeltisi, sonraki deneyler için tekrar kullanılabileceği için 4 ° C'de saklanmalı ve saklanmalıdır. Birçok primer antikor dört defaya kadar tekrar kullanılabilir.
    4. Son bir yıkama için beyne 400 μL PBT ekleyin. Çanağı bir sürgü ile örtün, laboratuvar filmi ile kapatın ve ~4 saat boyunca düşük hızda (100 rpm) ve oda sıcaklığında (RT) bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Beyinler 4 °C'de 2\u20123 gün yıkanabilir.
    5. İkincil antikor çözeltisini toplam 100 μL hacimde hazırlayın.
      NOT: Bu protokolde, tüm ikincil antikorlar, bloke edici ajanlar olmadan 1:500'lük bir seyreltmede kullanılır.
    6. PBT yıkamasını kuyudan çıkarın ve ikincil antikor çözeltisini ekleyin. Bir çift forseps kullanarak çözeltideki dokuyu karıştırın. Çanağı bir slayt ve laboratuvar filmi ile örtün. Çanağı, minimum 2 saatlik bir kuluçka süresi boyunca RT'de bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin. İkincil antikorlar ışığa duyarlı floroforlar içerdiğinden, çanağı alüminyum folyo ile kaplayın.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Beyinler gece boyunca 4 ° C'de ikincil antikor çözeltisinde bırakılabilir.
    7. İkincil antikorları adım 1.2.3'te tarif edildiği gibi yıkayın. Son bir yıkama için beyne 400 μL PBT ekleyin. Çanağı bir slaytla örtün, laboratuvar filmi ve folyo ile kapatın. Beyinleri 4 saat boyunca RT'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Beyinler 4 °C'de 2\u20123 gün yıkanabilir.
  3. Montaj
    1. Son PBT yıkamayı çıkarın ve iki damla floresan korumalı montaj ortamı ile değiştirin. Montaj ortamından bir damla slaytın ortasına yerleştirin.
    2. Forseps kullanarak beyinleri kuyudan slayttaki damlaya aktarın. Optik loblara zarar vermemek için, beyinler slayta aktarılırken ventral sinir kordonu tarafından tutulabilir.
    3. Beyinleri aşağıdaki montaj stratejilerine göre monte edin (Şekil 1A).
      1. Ön taraf yukarı
        NOT: Anterior medulla, lamina veya lobüla tıkacını görselleştirmek isteyenler için bu montaj yönü idealdir. Ön ve arka bağları ayırt etmenin en iyi yolu, ventral sinir kordonunun beyin loblarına göre konumunu incelemektir.
        1. Ventral sinir kordonunun loblar üzerinden çıkıntı yaptığını gözlemlemek için ön yönlendirmeyi kullanın (Şekil 1B).
      2. Arka taraf yukarı
        NOT: Bu yönlendirme, OPC (pOPC) veya IPC 10,11'in arka uçlarını görselleştirmek isteyenler için önerilir.
        1. Beyin loblarının altından çıkıntı yapan ventral sinir kordonunu görmek için posterior yönlendirmeyi kullanın (Şekil 1C).
      3. Yanal görünüm
        NOT: Hem dorsal-ventral hem de ön-arka eksenlerde lamina, medulla veya lobüla tıkacı nöronlarının hilalini tek bir düzlemde görselleştirmek için yanal bir montaj oryantasyonu kullanılır (Şekil 1G).
        1. Yanal bir montaj için, beyin loblarını, lamina ve lobüla tıkacı yukarı bakacak şekilde yan yana düz düşecek şekilde birbirinden ayırın.
        2. İki çift keskin forseps kullanarak, ventral sinir kordonunu, kordonun loblara bağlandığı yerden başlayarak ikiye bölün. İki lobun zaten birbirinden ayrı olduğunu ve ventral sinir kordonunun onları sağlam tuttuğunu unutmayın. Böylece, ventral sinir kordonunu loblar arasındaki bölünme noktasından aşağıya doğru ayırın ve onları ayırın. Daha sonra her bir beyin lobunu ve bağlı ventral sinir kordonunu, yan yüzeyler yukarı bakacak şekilde yanlarına çevirin.
          NOT: Yanal görünüm montajı için, beyin lobunu yan tarafına yönlendirmek için ince uçlu bir tungsten iğnesi kullanılması önerilir. Montaj sırasında lobların yönünü ve ventral sinir kordonunun yönünü net bir şekilde görselleştirmek için mikroskop aydınlatması ayarlanabilir. Deveboynu LED ışık kaynağı kullanılıyorsa, net görüş için deveboynu sürgünün yüzeyine paralel olarak yerleştirilmelidir. Ayrıca, beyin yapıları arasındaki kontrastı artırmak ve montaj sırasında netlik sağlamak için aydınlatma yoğunluğu artırılabilir veya azaltılabilir.
    4. Beyinleri içeren montaj ortamının her iki tarafına küçük bir damla PBS yerleştirin. Her damlanın üzerine bir kapak fişi yerleştirin ve beyinlerin üzerine son bir lamel yerleştirin. Üst lamellerin sağ ve sol kenarları diğer iki lamellerin üzerine dayanmalıdır (Şekil 1A).
      NOT: Beynin üzerine bir lamel yerleştirmeden önce bir köprü inşa edilmelidir. Larva beyinleri yaklaşık 200 μm kalınlığındadır ve bu nedenle dokunun bütünlüğünü korumak için örtü kayması ile lam yüzeyi arasındaki mesafeyi artıran bir köprü oluşturulur.
    5. Monte edilmiş beyinleri sabitlemek için köprünün kenarlarını oje ile kapatın.
    6. Konfokal mikroskopi kullanarak beyinleri görüntüleyin.

2. Yetişkin beyinlerini konfokal görüntüleme için hazırlama

  1. Diseksiyonlar
    NOT: Erişkin beyin diseksiyonları larva beyinlerine göre daha zordur ve dikkatli kullanım gerektirir. Protokolün bu kısmı için en az bir çift ultra ince forseps (Dumont #55) kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
    1. Anestezik, bir iğne veya flypad kullanarak CO2 ile sinekler ve bunları buz üzerinde bir laboratuvar mendili veya kağıt havlu üzerine yerleştirin (anestezi altında tutmak için).
    2. Cam tabağın üç kuyusuna da 400 μL PBS ekleyin. Bir yetişkin sineği kanatlarından nazikçe tutmak için bir çift forseps kullanın ve onu yemeğin ilk kuyusuna yerleştirin.
    3. Sinek göğüs kafesini kuyu tabanına karşı tutmak için baskın olmayan elde tutulan bir çift forseps kullanın. Baskın eliyle, başınızı vücudun geri kalanından nazikçe çekin.
    4. Kafayı ikinci kuyuya aktarın. Çoğu zaman, kafa PBS'de yüzer ve kullanımı zor olabilir. Hortum tarafından kuyu tabanına karşı tutmak için bir çift forseps kullanın.
    5. Her iki forseps kullanarak gözler arasındaki kütikülün bir bölgesini soyun. Beyin kütikülün hemen altında yer aldığından, alttaki dokuya zarar vermemek için mümkün olduğunca nazik olun. Beyin açığa çıkana kadar kütikülü her seferinde bir parça soymaya devam edin. Beyne bağlı kalabilecek herhangi bir aksesuar dokuyu (yani retina, trakea, hava kesecikleri) çıkarın.
      NOT: Retinanın çıkarılması önceki protokollerde22,24 tarif edilmiştir, ancak lamina optik lobun geri kalanından da ayrılabilir. Bu, medulla veya lobüla kompleksini incelemek isteyenler için yararlıdır, çünkü lamina yüzeyde oturur ve görüntüleme sırasında bu diğer optik lob nöropillerinin görselleştirilmesini engelleyebilir. Laminayı çıkarmak için, lamina ve medulla nöropiller arasındaki girintiyi nazikçe çekmek için bir çift keskin forseps kullanın. Lamina yavaş yavaş medulladan sıyrılmaya başlayacaktır. Tüm lamina çıkarılana kadar bu hareketi tekrarlayın. Bu işlem sırasında beynin sıkı bir şekilde kavranmasını sağlamak önemlidir. Beyni, merkezi beynin üst ve alt kısmı forsepsin uçları arasına mükemmel bir şekilde oturacak şekilde konumlandırarak çanağın tabanına karşı tutmak için başka bir forseps çifti kullanın. Merkezi beynin etrafında sıkı bir tutuş, optik lobda istenmeyen hasarı önleyecektir.
    6. Temiz beyni üçüncü kuyuya aktarın. Yeterli sayıda beyin elde edilene veya maksimum 30 dakikalık diseksiyon süresi geçene kadar 2.1.2\u2012.1.6 adımlarını tekrarlayın.
    7. Üçüncü kuyucuktaki PBS'yi çıkarın ve 500 μL sabitleme çözeltisi ekleyin. Beyinlerin burada veya herhangi bir yıkama adımı sırasında kurumadığından emin olun, çünkü bu, konfokal görüntülerde arka plan floresansına yol açacaktır. Çanağı bir cam slaytla örtün ve beyinlerin RT'de 20 dakika boyunca sabit olarak kuluçkaya yatmasına izin verin.
    8. Fiksasyondan sonra beyinleri 5 kez 400 μL PBT ile yıkayın.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Beyinler bir cam slayt ve laboratuvar filmi ile kaplanabilir ve 4 ° C'de 20123 gün boyunca yıkamada bırakılabilir. Sisteme yeni başlayan araştırmacılar için, fiksasyondan önce ve fiksasyon sırasında beyinde aksesuar doku bırakmak daha kolay olabilir. Bu, araştırmacıların belirli bir diseksiyon periyodunda elde edilen beyin örneklerinin sayısını en üst düzeye çıkarmasına izin verecektir. Doku sabitlendikten ve yıkandıktan sonra, birincil antikor çözeltisi eklenmeden önce beyinler dikkatlice temizlenebilir. Aksesuar dokuya sahip yetişkin beyinler yüzmeye meyillidir ve bu nedenle kuruma riski vardır. Sonuç olarak, fiksasyon solüsyonu eklendikten sonra tüm beyinleri tabağın ortasına dikkatlice bir araya getirmek ve fiksasyondan hemen sonra beyinleri temizlemek için bir çift forseps kullanılması önerilir.
  2. İmmünohistokimya
    1. Bölüm 1.2'de larva beyinleri için tarif edildiği gibi immünohistokimya yapın.
    2. DSHB'den elde edilen yararlı primer antikorlar, bölüm 1.2'deki larva immünohistokimyası protokolünde belirtilenleri içerir. Antikorların ve karşılık gelen seyreltmelerin tam listesi için Malzeme Tablosuna bakın.
      NOT: Yetişkin beyinleri için yıkama adımları sırasında ekstra özen gösterilmelidir, çünkü bunlar yıkama solüsyonunun yüzeyine yüzebilir ve solüsyon çıkarıldığında kuyu kenarlarında kuruma riskiyle karşı karşıya kalabilir (bu da arka plan floresansına yol açacaktır). İyi bir uygulama, sıvı eklemek veya çıkarmak için pipeti bir elde, diğerinde ise beyinleri su altında tutmak için bir çift forseps tutmaktır.
  3. Montaj
    1. Montaj adımından önce, PBS ile (PBT yerine) son bir yıkama yapın. PBS, beyinlerin hafifçe yapışkan hale gelmesine neden olur, bu da montaj sırasında istenen yönde kalmalarını sağlar.
    2. Son yıkamayı çıkarın ve üç damla floresan korumalı montaj ortamı ile değiştirin. Montaj ortamından bir damla mikroskop lamının ortasına yerleştirin.
    3. Forseps kullanarak beyinleri kuyudan slayttaki damlaya aktarın. Optik loblara zarar vermekten kaçınmak ve dokunun kurumasını önlemek için, kılcal hareket yoluyla bir beyni dikkatlice geri alın. Beynin etrafına bir çift forseps koyun, beyni içeren küçük bir sıvı hacmi uçlar arasında çekilene kadar yavaşça kapatın.
      NOT: Beyni slayta aktarırken, beyne zarar vereceği için forsepsleri kapatmamaya dikkat edin. Alternatif olarak, beyinleri aktarmak için bir P200 pipeti kullanılabilir. Açıklığı genişletmek için ucun ucunu kesin ve beynin ucun içine yapışmasını önlemek için PBT ile ön durulama yapın.
    4. Beyinleri aşağıdaki stratejilere göre monte edin (Şekil 2A).
      1. Ön taraf yukarı
        NOT: Lamina ve medulla nöronlarını görselleştirmek için beyni ön tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin (Şekil 2B). Bu, merkezi anten loblarının anatomisini ve eğriliğini inceleyerek başarılabilir.
        1. Bir çift forseps ile, hem ön hem de arka tarafları incelemek için beyni hafifçe yan çevirin. Ön tarafta, beynin eğriliğinin belirgin olduğunu ve anten loblarının merkezden hafifçe dışa doğru çıkıntı yaptığını gözlemleyin.
      2. Arka taraf yukarı
        1. Beyni, arka (düz) tarafı yukarı bakacak ve anten lobları aşağı bakacak şekilde konumlandırın (Şekil 2C).
          NOT: Bu, lobüla ve lobüla plakasını görüntüleme yüzeyine yaklaştıracaktır ve lobüla kompleks nöronlarını görselleştirmekle ilgilenenler için idealdir.
      3. Yatay görünüm
        NOT: Tüm optik lob nöropillerini aynı anda görselleştirmek için yatay bir montaj stratejisi kullanın (Şekil 2G). Bu oryantasyonda, nöronal hücre gövdeleri, aksonal yörüngeler ve dendritik arborizasyonlar aynı düzlemde görselleştirilebilir.
        1. İlk olarak, beyni ön tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Bir tungsten iğnesi ile beyni, anten lobları dışa bakacak şekilde sırt tarafına oturacak şekilde 90° yukarı doğru hafifçe eğin. Beynin hem ön hem de arka taraflarının bu yönde görünür olup olmadığını kontrol edin.
    5. Kapak kayma köprüsü yerine, kapak kızağını slayttan yükseltmek için kil kullanın. Kil kullanımı, görüntülemeden sonra beyinlerin yeniden monte edilmesine izin verir (tartışma bölümünde açıklanmıştır).
      1. Bir kapak fişinin her köşesine küçük bir kil parçası yerleştirin. Her bir kil parçasının nispeten aynı kalınlıkta olduğundan emin olun. Kil parçalarının kalınlığı 0,5-1 mm arasında olmalıdır. Lameli nazikçe beynin üzerine yerleştirin ve köşelere hafif bir baskı uygulayın. Lamel hemen sıvıyı yakalamalı ve bir conta oluşturmalıdır. Slayt artık görüntüleme için hazırdır.
        NOT: Lamellerin uzun süreli saklanması için, lamellerin oje ile kapatılması ve ışıktan 4 °C uzakta saklanması önerilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protokolde tarif edilen oryantasyonlarda monte edilen larva ve yetişkin optik lobların konfokal görüntüleri Şekil 1 ve Şekil 2'de sunulmuştur.

Şekil 1, ön, arka ve yan yönelimlerde konumlandırılmış larva beyinlerinin şemalarını ve temsili konfokal dilimlerini göstermektedir. Anterior montaj oryantasyonunda, OPC epiteli (DE-Cadherin), medulla nöroblastları (deadpan>βgal) ve lamina nöronları (Da...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolde, larva ve yetişkin Drosophila beyinlerini immün olarak boyamak ve bunları çeşitli yönlerde monte etmek için bir yöntem tarif ediyoruz. Larva ve yetişkin beyinlerini boyama yöntemleri daha önce tanımlanmış olsa da 22,23,24,27,28, spesifik optik lob yapılarının optimal görselleştirilmesi için montaj stratejileri daha az dikkat çekmiştir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bsh antikorunun bir alikotunu bizimle paylaştığı için Claude Desplan'a teşekkür ederiz. DE-Cadherin, Dachshund, Eyes Absent, Seven-up ve Bruchpilot monoklonal antikorları, NIH'nin NICHD'si tarafından oluşturulan ve Iowa Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Iowa City, IA 52242'de tutulan Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası'ndan elde edildi. Bu çalışma, T.E.'ye verilen bir NSERC Keşif Bursu ile desteklenmiştir. UA, NSERC Alexander Graham Bell Kanada Yüksek Lisans Bursu tarafından desteklenmektedir. PV, Ontario Yüksek Lisans Bursu tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10x PBSBioshopPBS405
%37 formaldehitBioshopFOR201
Alexa Fluor 488 (keçi) ikincilInvitrogenA-110551:500'de kullanım
Alexa Fluor 555 (fare) ikincilInvitrogenA-315701:500'de kullanım
Alexa Fluor 647 (kobay) ikincilInvitrogenA-214501:500'de kullanım
Alexa Fluor 647 (sıçan) ikincilInvitrogenA-212471:500'de kullanım
Kapak fişleriVWR48366-067
Diseksiyon forseps - #5Dumont11251-10
Diseksiyon forseps - #55Dumont11295-51
Diseksiyon TabağıCorning722085
Kuru mendilKimbery Clark34155
Keçi anti-Bgal birincil antikoru1:1000'debiyogenez
Gine domuzu anti-Bsh birincil antikoruClaude Desplan'dan1:500'de kullanım
Gine domuzu anti-Vsx1 birincil antikoruErclik ve ark. 20081:1000'de kullanım
Laboratuvar filmiParafilmPM-996
Mikrosantrifüj tüpleriSarstedt72.706.600
Mikroskop slaytlarıVWRCA4823-180
Fare anti-dac primer antikoruGelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB)mabdac2-31:20'de kullanım
Fare anti-eya primer antikoruDSHBeya10H61:20'de kullanın
Fare anti-nc82 primer antikoruDSHBnc821:50'de
kullanın Fare anti-SVP birincil antikoruDSHBYedili 2D31:100'de kullanım
PolimerKil Her türlü kil kullanılabilir
Tavşan anti-GFPInvitrogenA-111221:1000'de
sıçan anti-DE-Cadherin birincil antikoruDSHBDCAD2kullanımı 1:20'de
Slowfade montaj ortamıInvitrogenS36967Vectashield montaj ortamı (cat# H-1000)
Triton-x-100BioshopTRX506
kullanımı hediye da kullanılabilir

Kaynaklar

  1. Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell Tissue Research. 258, (1989).
  2. Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. Proliferation pattern and early differentiation of the optic lobes in Drosophila melanogaster. Roux's Archives of Developmental Biology. 198, 264-274 (1990).
  3. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design Principles of Insect and Vertebrate Visual Systems. Neuron. 66, 15-36 (2010).
  4. Nériec, N., Desplan, C. From the Eye to the Brain. Development of the Drosophila Visual System. Current Topics in Developmental Biology. 116, Academic Press Inc. 247-271 (2016).
  5. Apitz, H., Salecker, I. A Challenge of Numbers and Diversity: Neurogenesis in the Drosophila Optic Lobe. Journal of Neurogenetics. 28, 233-249 (2014).
  6. Contreras, E. G., Sierralta, J., Oliva, C. Novel strategies for the generation of neuronal diversity: Lessons from the fly visual system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 140(2019).
  7. Erclik, T., Hartenstein, V., Lipshitz, H. D., McInnes, R. R. Conserved Role of the Vsx Genes Supports a Monophyletic Origin for Bilaterian Visual Systems. Current Biology. 18, 1278-1287 (2008).
  8. Erclik, T., Hartenstein, V., McInnes, R. R., Lipshitz, H. D. Eye evolution at high resolution: The neuron as a unit of homology. Developmental Biology. 332, 70-79 (2009).
  9. Wu, M., et al. Visual projection neurons in the Drosophila lobula link feature detection to distinct behavioral programs. eLife. 5, (2016).
  10. Ngo, K. T., Andrade, I., Hartenstein, V. Spatio-temporal pattern of neuronal differentiation in the Drosophila visual system: A user's guide to the dynamic morphology of the developing optic lobe. Developmental Biology. 428, 1-24 (2017).
  11. Li, X., et al. Temporal patterning of Drosophila medulla neuroblasts controls neural fates. Nature. 498, 456-462 (2013).
  12. Erclik, T., et al. Integration of temporal and spatial patterning generates neural diversity. Nature. 541, 365-370 (2017).
  13. Apitz, H., Salecker, I. A region-specific neurogenesis mode requires migratory progenitors in the Drosophila visual system. Nature Neuroscience. 18, 46-55 (2015).
  14. Suzuki, T., Kaido, M., Takayama, R., Sato, M. A temporal mechanism that produces neuronal diversity in the Drosophila visual center. Developmental Biology. 380, 12-24 (2013).
  15. Hara, Y., Sudo, T., Togane, Y., Akagawa, H., Tsujimura, H. Cell death in neural precursor cells and neurons before neurite formation prevents the emergence of abnormal neural structures in the Drosophila optic lobe. Developmental Biology. 436, 28-41 (2018).
  16. Morante, J., Erclik, T., Desplan, C. Cell migration in Drosophila optic lobe neurons is controlled by eyeless/Pax6. Development. 138, 687-693 (2011).
  17. Millard, S. S., Pecot, M. Y. Strategies for assembling columns and layers in the Drosophila visual system. Neural Development. 13, 1-17 (2018).
  18. Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: The input terminals to the medulla. Journal of Comparative Neurology. 509, 493-513 (2008).
  19. Akin, O., Bajar, B. T., Keles, M. F., Frye, M. A., Zipursky, S. L. Cell-type-Specific Patterned Stimulus-Independent Neuronal Activity in the Drosophila Visual System during Synapse Formation. Neuron. 101, 894-904 (2019).
  20. Spratford, C. M., Kumar, J. P. Dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (91), e51792(2014).
  21. Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resoluton of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122, Cambridge, England. 4139-4147 (1996).
  22. Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. Journal of visualized experiments. , e4347(2012).
  23. Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains. Journal of Visualized Experiments. , e56174(2017).
  24. Williamson, R. W., Hiesinger, R. P. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of Visualized Experiments. , e1936(2010).
  25. Bertet, C., et al. Temporal patterning of neuroblasts controls notch-mediated cell survival through regulation of hid or reaper. Cell. 158, 1173-1186 (2014).
  26. Pinto-Teixeira, F., et al. Development of Concurrent Retinotopic Maps in the Fly Motion Detection Circuit. Cell. 173, 485-498 (2018).
  27. Plevock, D. A., Rusan, K. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. , e51756(2014).
  28. Ting, C. Y., et al. Analyzing dendritic morphology in columns and layers. Journal of Visualized Experiments. , e55410(2017).
  29. Özel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. eLife. 4, (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Drosophila Beyin DiseksiyonuOptik Lob Görüntülemeİmmünohistokimya ProtokolüMontaj StratejileriLarva Beyni OryantasyonuErişkin Beyni OryantasyonuFloresan Montaj OrtamıPBS YıkamalarıFiksasyon SolüsyonuLamel Köprüsü
Optik lob görselleştirmesi için larva ve erişkin drosophila beyinlerinin diseksiyonu, immünohistokimyası ve montajı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.