Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Bu protokol, larva ve yetişkin Drosophila optik loblarını görüntüleme için hazırlamak için üç adımı tanımlar: 1) beyin diseksiyonları, 2) immünohistokimya ve 3) montaj. Belirli optik lob yapılarını görselleştirmek için farklı montaj yönleri gerektiğinden, adım 3’e vurgu yapılır.

Abstract

Dört nöropilden oluşan Drosophila optik lob: lamina, medulla, lobüla ve lobüla plakası, nöral çeşitliliği oluşturan ve devre montajını yönlendiren gelişimsel mekanizmaları keşfetmek için mükemmel bir model sistemdir. Karmaşık üç boyutlu organizasyonu göz önüne alındığında, optik lobun analizi, yetişkin nöropillerinin ve larva progenitörlerinin birbirlerine ve merkezi beyne göre nasıl konumlandırıldığını anlamayı gerektirir. Burada, optik lob görüntülemesi için larva ve yetişkin beyinlerinin diseksiyonu, immün boyaması ve montajı için bir protokol tarif ediyoruz. Montaj oryantasyonu ile optik lobun uzamsal organizasyonu arasındaki ilişkiye özel önem verilmektedir. Larvada üç (ön, arka ve yanal) ve yetişkinde üç (ön, arka ve yatay) montaj stratejisi tanımladık ve bunların her biri farklı bir optik lob yapısı için ideal bir görüntüleme açısı sağlar.

Introduction

Bileşik göz ve altta yatan optik lobdan oluşan Drosophila görsel sistemi, nöral devre gelişimi ve işlevinin incelenmesi için mükemmel bir model olmuştur. Son yıllarda, özellikle optik lob, nörojenez ve devre kablolaması gibi nörogelişimsel süreçleri incelemek için güçlü bir sistem olarak ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5,6,7,8. Dört nöropilden oluşur: lamina, medulla, lobüla ve lobüla plakası (son ikisi lobüla kompleksini oluşturur)1,2,3,4,5,6. Gözden gelen fotoreseptörler, görsel girdileri işleyen ve bunları lobüla kompleksi 1,2,3,4,5,6’nın nöropillerine ileten lamina ve medulla nöronlarını hedefler. Lobula kompleksindeki projeksiyon nöronları daha sonra merkezi beyindeki daha üst düzey işlem merkezlerine görsel bilgi gönderir ^1,5,9. Retinotomiyi sürdürme ve farklı görsel uyaran türlerini işleme ihtiyacının gerektirdiği optik lobun karmaşık organizasyonu, onu karmaşık nöral devrelerin nasıl bir araya getirildiğini incelemek için çekici bir sistem haline getirir. Özellikle, medulla, omurgalı nöral devre gelişimi için uzun süredir bir model olan nöroretina ile hem organizasyonunda hem de gelişiminde çarpıcı benzerlikler paylaşır ^3,8.

Optik lob gelişimi, embriyogenez sırasında, optik placode^{2,4,5,6,7,8’i} oluşturan ~ 35 ektodermal hücrenin spesifikasyonu ile başlar. Larva yumurtadan çıktıktan sonra, optik plakod iki farklı primordiyaya ayrılır: 1) lamina ve dış medulla nöronlarını üreten dış proliferasyon merkezi (OPC) ve 2) iç medulla ve lobula kompleksinin nöronlarını üreten iç proliferasyon merkezi (IPC) ^4,5,6,10. Geç ikinci instar larvada, OPC ve IPC’nin nöroepitel hücreleri, daha sonra ara ganglion ana hücreleri ^4,5,11,12 yoluyla nöronlar üreten nöroblastlara dönüşmeye başlar. Optik lob nöroblastları, döllerinde nöral çeşitlilik oluşturmak için birlikte hareket eden uzamsal ve zamansal olarak kısıtlı transkripsiyon faktörleri tarafından modellenir 11,12,13,14. Pupada, optik lob nöropillerinin devreleri, programlanmış hücre ölümü^11,15, nöronal göç^12,16, aksonal/dendritik hedefleme^10,17, sinaps oluşumu^18,19 ve nöropil rotasyonları^10,17 dahil olmak üzere çeşitli süreçlerin koordinasyonu yoluyla birleştirilir.

Burada, larva ve yetişkin beyinlerinin optik lobun görüntülenmesi için diseke edildiği, immün olarak boyandığı ve monte edildiği metodolojiyi açıklıyoruz. Karmaşık üç boyutlu organizasyonu göz önüne alındığında, optik lobun analizi, yetişkin nöropillerinin ve larva progenitörlerinin birbirlerine ve merkezi beyne göre nasıl konumlandırıldığını anlamayı gerektirir. Bu nedenle, montaj oryantasyonunun optik lob yapılarının mekansal organizasyonu ile nasıl ilişkili olduğuna özel bir önem veriyoruz. Larva beyinleri için üç (ön, arka ve yanal) ve yetişkin beyinleri için üç (ön, arka ve yatay) montaj stratejisi tanımladık ve bunların her biri belirli bir optik lob progenitör popülasyonunu veya nöropilini görüntülemek için en uygun açıyı sağlar.

Protocol

1. Larva beyinlerinin konfokal görüntüleme için hazırlanması

1. Diseksiyonlar
   NOT: Diseksiyona başlamadan önce, düzeltme (fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 formaldehit) ve PBT (PBS’de% 0.1-0.3 Triton) çözeltilerini hazırlayın. Sabitleme solüsyonu diseksiyon sırasında buz üzerine yerleştirilmelidir. Bu protokolde paraformaldehit (PFA) fiksatifi kullanılmasına rağmen, spesifik epitoplar için alternatif fiksasyon stratejileri (PLP²⁰ veya PEM²¹ kullanılarak) tanımlanmıştır. Larva diseksiyonları için iki çift forseps (Dumont # 5 veya #55s) gereklidir. Daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosuna bakın.
   1. Diseksiyon kabının her bir kuyusunu 400 μL 1x PBS ile doldurarak başlayın. Şişenin içinde sürünen dolaşan üçüncü instar larvalarını nazikçe seçmek için bir çift forseps kullanın. Larvaları PBS dolu tabağın ilk kuyusuna yerleştirin.
   2. Bir larva alın ve orta kuyuya aktarın. Baskın olmayan eli kullanarak, larvaların gövdesini kuyunun tabanında tutun.
   3. Baskın el ile larva ağız kancasını nazikçe kavrayın ve vücuttan çekin. Larva beyni, ağız kancasına ve diğer yardımcı dokuya bağlı olmalıdır ve doku çekildikçe çıkacaktır.
   4. Aksesuar hayali diskleri çıkarın ve larva beynini diseksiyon kabının üçüncü kuyusuna aktarın. Hayali diskler, larva beynini çevreleyen ve antenler, gözler, bacaklar ve kanatlar gibi yetişkin yapıları oluşturan epitel dokularıdır²⁰. Doku üzerinde bırakılırsa, hayali diskler larva beyninin uygun şekilde immün boyanmasını engelleyebilir.
      1. Hayali diskleri çıkarmak için, beyni ventral sinir kordonu yoluyla sıkıca kavramak için bir çift forseps kullanın. Başka bir forseps çifti kullanarak, diskleri yavaşça koparın.
      2. Beyin loblarının yüzeyini sardığı için göz diskini dikkatlice çıkarın. Göz diskini çıkarmak için, beyni tabağın tabanına karşı tutmak için bir çift forseps kullanın. Beyni ventral sinir kordonu yoluyla tutmak yerine, lobu sıkmamaya dikkat ederek beyin lobunu hafifçe kavramak için forseps kullanın. Başka bir forseps kullanarak göz diskini nazikçe çekin.
         NOT: Göz görme diski sonunda retinanın fotoreseptörlerine yol açacaktır. Retina ve optik lob arasındaki sinirsel bağlantıyı incelemekle ilgilenenler için, göz diski beyinde bırakılabilir. Bununla birlikte, yalnızca optik lob yapılarıyla ilgilenenler için, beyin yüzeyindeki konumu nedeniyle görüntü kalitesini engelleyebileceği için göz diskinin çıkarılması önerilir.
   5. Yeterli sayıda beyin toplanana kadar (veya 30 dakikalık diseksiyon süresi geçene kadar) 1.1.2\u20121.1.4 adımlarını tekrarlayın. Doku bütünlüğünün bozulmamasını sağlamak için diseksiyonlar 30 dakikadan uzun sürmemelidir.
   6. Diseksiyon süresi sona erdiğinde, PBS’yi üçüncü kuyucuktan dikkatlice çıkarmak için bir P200 pipeti kullanın. Beyinleri suya batırmak için kuyuda küçük bir hacimde sıvı kaldığından emin olun.
      NOT: Protokolün tüm noktalarında beyinleri sıvıya batırmak çok önemlidir. Doku kurursa, lekenin kalitesi konfokal görüntüdeki istenmeyen otofloresan nedeniyle tehlikeye girebilir.
   7. Üçüncü kuyucuğa 500 μL soğuk sabitleme çözeltisi ekleyin. Sıvıyı hafifçe karıştırmak için bir çift forseps kullanın ve beynin tabakta dönmesine izin verin. Çanağı bir cam slaytla örtün ve doku fiksasyonuna izin vermek için 30 dakika boyunca buzun üzerine koyun.
   8. Fiksasyon solüsyonunu çıkarın ve beyinleri 5 kez 400 μL PBT ile yıkayın.
      NOT: Triton, PBT’de bulunan ve beyinlerin birbirine veya tabağa yapışmasını önleyen ve dokuyu optimal antikor penetrasyonu için hazırlayan bir deterjandır.
2. İmmünohistokimya
   NOT: Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası’ndan (DSHB) belirli optik lob yapılarını veya hücre tiplerini etiketlemek için kullanılabilecek birkaç birincil antikor vardır. DE-Cadherin, IPC ve OPC nöroepitelini, Bruchpilot (Brp) gelişmekte olan nöropili, Dachshund ise lamina ve lobula nöronlarını (ve ayrıca medulla nöronlarının küçük bir alt kümesini) etiketler. Ek olarak, Elav nöronları etiketlemek için, Prospero ganglion ana hücrelerini işaretlemek için ve Repo glia’yı tanımlamak için kullanılabilir.
   1. PBT’ye toplam 100 μL hacme kadar antikorlar ekleyerek birincil antikor çözeltisini hazırlayın. Primer antikor ile doku^20,22,23 arasındaki spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için bir bloke edici ajan (%10 normal keçi serumu) kullanılabilir. Bu protokolde kullanılan antikorlar, bloke edici ajanlara ihtiyaç duymadan beyin dokusunu spesifik olarak etiketler.
   2. Son fiksasyon sonrası yıkamayı çıkarın ve birincil antikor solüsyonunu ekleyin. Antikor çözeltisini eklemeden önce kuyuda sadece az miktarda PBT olduğundan emin olun. Solüsyonu ekledikten sonra, beyinleri forseps ile 5-u201210 kez hafifçe karıştırın. Bir cam slayt ile örtün, laboratuvar filmi ile kapatın ve gece boyunca 4 °C’de inkübe edin.
      1. Alternatif olarak, soğutulmuş bir orbital çalkalayıcı mevcutsa, gece boyunca inkübasyonu optimize etmek için tabağı çalkalayıcının üzerine yerleştirin.
         NOT: Birincil antikor inkübasyonu ve sonraki tüm adımlar alternatif olarak 1.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde gerçekleştirilebilir. Primer ve sekonder inkübasyonların hacmi 100 μL kalabilir, ancak yıkama adımları 800 μL veya daha fazla PBT ile gerçekleştirilmelidir.
   3. İnkübasyondan sonra, önceki bölümün 1.1.8 adımında olduğu gibi primer antikorları PBT ile yıkayın.
      NOT: Birincil antikor çözeltisi, sonraki deneyler için tekrar kullanılabileceği için 4 ° C’de saklanmalı ve saklanmalıdır. Birçok primer antikor dört defaya kadar tekrar kullanılabilir.
   4. Son bir yıkama için beyne 400 μL PBT ekleyin. Çanağı bir sürgü ile örtün, laboratuvar filmi ile kapatın ve ~4 saat boyunca düşük hızda (100 rpm) ve oda sıcaklığında (RT) bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Beyinler 4 °C’de 2\u20123 gün yıkanabilir.
   5. İkincil antikor çözeltisini toplam 100 μL hacimde hazırlayın.
      NOT: Bu protokolde, tüm ikincil antikorlar, bloke edici ajanlar olmadan 1:500’lük bir seyreltmede kullanılır.
   6. PBT yıkamasını kuyudan çıkarın ve ikincil antikor çözeltisini ekleyin. Bir çift forseps kullanarak çözeltideki dokuyu karıştırın. Çanağı bir slayt ve laboratuvar filmi ile örtün. Çanağı, minimum 2 saatlik bir kuluçka süresi boyunca RT’de bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin. İkincil antikorlar ışığa duyarlı floroforlar içerdiğinden, çanağı alüminyum folyo ile kaplayın.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Beyinler gece boyunca 4 ° C’de ikincil antikor çözeltisinde bırakılabilir.
   7. İkincil antikorları adım 1.2.3’te tarif edildiği gibi yıkayın. Son bir yıkama için beyne 400 μL PBT ekleyin. Çanağı bir slaytla örtün, laboratuvar filmi ve folyo ile kapatın. Beyinleri 4 saat boyunca RT’de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Beyinler 4 °C’de 2\u20123 gün yıkanabilir.
3. Montaj
   1. Son PBT yıkamayı çıkarın ve iki damla floresan korumalı montaj ortamı ile değiştirin. Montaj ortamından bir damla slaytın ortasına yerleştirin.
   2. Forseps kullanarak beyinleri kuyudan slayttaki damlaya aktarın. Optik loblara zarar vermemek için, beyinler slayta aktarılırken ventral sinir kordonu tarafından tutulabilir.
   3. Beyinleri aşağıdaki montaj stratejilerine göre monte edin (Şekil 1A).
      1. Ön taraf yukarı
         NOT: Anterior medulla, lamina veya lobüla tıkacını görselleştirmek isteyenler için bu montaj yönü idealdir. Ön ve arka bağları ayırt etmenin en iyi yolu, ventral sinir kordonunun beyin loblarına göre konumunu incelemektir.
         1. Ventral sinir kordonunun loblar üzerinden çıkıntı yaptığını gözlemlemek için ön yönlendirmeyi kullanın (Şekil 1B).
      2. Arka taraf yukarı
         NOT: Bu yönlendirme, OPC (pOPC) veya IPC ^10,11’in arka uçlarını görselleştirmek isteyenler için önerilir.
         1. Beyin loblarının altından çıkıntı yapan ventral sinir kordonunu görmek için posterior yönlendirmeyi kullanın (Şekil 1C).
      3. Yanal görünüm
         NOT: Hem dorsal-ventral hem de ön-arka eksenlerde lamina, medulla veya lobüla tıkacı nöronlarının hilalini tek bir düzlemde görselleştirmek için yanal bir montaj oryantasyonu kullanılır (Şekil 1G).
         1. Yanal bir montaj için, beyin loblarını, lamina ve lobüla tıkacı yukarı bakacak şekilde yan yana düz düşecek şekilde birbirinden ayırın.
         2. İki çift keskin forseps kullanarak, ventral sinir kordonunu, kordonun loblara bağlandığı yerden başlayarak ikiye bölün. İki lobun zaten birbirinden ayrı olduğunu ve ventral sinir kordonunun onları sağlam tuttuğunu unutmayın. Böylece, ventral sinir kordonunu loblar arasındaki bölünme noktasından aşağıya doğru ayırın ve onları ayırın. Daha sonra her bir beyin lobunu ve bağlı ventral sinir kordonunu, yan yüzeyler yukarı bakacak şekilde yanlarına çevirin.
            NOT: Yanal görünüm montajı için, beyin lobunu yan tarafına yönlendirmek için ince uçlu bir tungsten iğnesi kullanılması önerilir. Montaj sırasında lobların yönünü ve ventral sinir kordonunun yönünü net bir şekilde görselleştirmek için mikroskop aydınlatması ayarlanabilir. Deveboynu LED ışık kaynağı kullanılıyorsa, net görüş için deveboynu sürgünün yüzeyine paralel olarak yerleştirilmelidir. Ayrıca, beyin yapıları arasındaki kontrastı artırmak ve montaj sırasında netlik sağlamak için aydınlatma yoğunluğu artırılabilir veya azaltılabilir.
   4. Beyinleri içeren montaj ortamının her iki tarafına küçük bir damla PBS yerleştirin. Her damlanın üzerine bir kapak fişi yerleştirin ve beyinlerin üzerine son bir lamel yerleştirin. Üst lamellerin sağ ve sol kenarları diğer iki lamellerin üzerine dayanmalıdır (Şekil 1A).
      NOT: Beynin üzerine bir lamel yerleştirmeden önce bir köprü inşa edilmelidir. Larva beyinleri yaklaşık 200 μm kalınlığındadır ve bu nedenle dokunun bütünlüğünü korumak için örtü kayması ile lam yüzeyi arasındaki mesafeyi artıran bir köprü oluşturulur.
   5. Monte edilmiş beyinleri sabitlemek için köprünün kenarlarını oje ile kapatın.
   6. Konfokal mikroskopi kullanarak beyinleri görüntüleyin.

2. Yetişkin beyinlerini konfokal görüntüleme için hazırlama

1. Diseksiyonlar
   NOT: Erişkin beyin diseksiyonları larva beyinlerine göre daha zordur ve dikkatli kullanım gerektirir. Protokolün bu kısmı için en az bir çift ultra ince forseps (Dumont #55) kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
   1. Anestezik, bir iğne veya flypad kullanarak CO₂ ile sinekler ve bunları buz üzerinde bir laboratuvar mendili veya kağıt havlu üzerine yerleştirin (anestezi altında tutmak için).
   2. Cam tabağın üç kuyusuna da 400 μL PBS ekleyin. Bir yetişkin sineği kanatlarından nazikçe tutmak için bir çift forseps kullanın ve onu yemeğin ilk kuyusuna yerleştirin.
   3. Sinek göğüs kafesini kuyu tabanına karşı tutmak için baskın olmayan elde tutulan bir çift forseps kullanın. Baskın eliyle, başınızı vücudun geri kalanından nazikçe çekin.
   4. Kafayı ikinci kuyuya aktarın. Çoğu zaman, kafa PBS’de yüzer ve kullanımı zor olabilir. Hortum tarafından kuyu tabanına karşı tutmak için bir çift forseps kullanın.
   5. Her iki forseps kullanarak gözler arasındaki kütikülün bir bölgesini soyun. Beyin kütikülün hemen altında yer aldığından, alttaki dokuya zarar vermemek için mümkün olduğunca nazik olun. Beyin açığa çıkana kadar kütikülü her seferinde bir parça soymaya devam edin. Beyne bağlı kalabilecek herhangi bir aksesuar dokuyu (yani retina, trakea, hava kesecikleri) çıkarın.
      NOT: Retinanın çıkarılması önceki protokollerde^22,24 tarif edilmiştir, ancak lamina optik lobun geri kalanından da ayrılabilir. Bu, medulla veya lobüla kompleksini incelemek isteyenler için yararlıdır, çünkü lamina yüzeyde oturur ve görüntüleme sırasında bu diğer optik lob nöropillerinin görselleştirilmesini engelleyebilir. Laminayı çıkarmak için, lamina ve medulla nöropiller arasındaki girintiyi nazikçe çekmek için bir çift keskin forseps kullanın. Lamina yavaş yavaş medulladan sıyrılmaya başlayacaktır. Tüm lamina çıkarılana kadar bu hareketi tekrarlayın. Bu işlem sırasında beynin sıkı bir şekilde kavranmasını sağlamak önemlidir. Beyni, merkezi beynin üst ve alt kısmı forsepsin uçları arasına mükemmel bir şekilde oturacak şekilde konumlandırarak çanağın tabanına karşı tutmak için başka bir forseps çifti kullanın. Merkezi beynin etrafında sıkı bir tutuş, optik lobda istenmeyen hasarı önleyecektir.
   6. Temiz beyni üçüncü kuyuya aktarın. Yeterli sayıda beyin elde edilene veya maksimum 30 dakikalık diseksiyon süresi geçene kadar 2.1.2\u2012.1.6 adımlarını tekrarlayın.
   7. Üçüncü kuyucuktaki PBS’yi çıkarın ve 500 μL sabitleme çözeltisi ekleyin. Beyinlerin burada veya herhangi bir yıkama adımı sırasında kurumadığından emin olun, çünkü bu, konfokal görüntülerde arka plan floresansına yol açacaktır. Çanağı bir cam slaytla örtün ve beyinlerin RT’de 20 dakika boyunca sabit olarak kuluçkaya yatmasına izin verin.
   8. Fiksasyondan sonra beyinleri 5 kez 400 μL PBT ile yıkayın.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Beyinler bir cam slayt ve laboratuvar filmi ile kaplanabilir ve 4 ° C’de 20123 gün boyunca yıkamada bırakılabilir. Sisteme yeni başlayan araştırmacılar için, fiksasyondan önce ve fiksasyon sırasında beyinde aksesuar doku bırakmak daha kolay olabilir. Bu, araştırmacıların belirli bir diseksiyon periyodunda elde edilen beyin örneklerinin sayısını en üst düzeye çıkarmasına izin verecektir. Doku sabitlendikten ve yıkandıktan sonra, birincil antikor çözeltisi eklenmeden önce beyinler dikkatlice temizlenebilir. Aksesuar dokuya sahip yetişkin beyinler yüzmeye meyillidir ve bu nedenle kuruma riski vardır. Sonuç olarak, fiksasyon solüsyonu eklendikten sonra tüm beyinleri tabağın ortasına dikkatlice bir araya getirmek ve fiksasyondan hemen sonra beyinleri temizlemek için bir çift forseps kullanılması önerilir.
2. İmmünohistokimya
   1. Bölüm 1.2’de larva beyinleri için tarif edildiği gibi immünohistokimya yapın.
   2. DSHB’den elde edilen yararlı primer antikorlar, bölüm 1.2’deki larva immünohistokimyası protokolünde belirtilenleri içerir. Antikorların ve karşılık gelen seyreltmelerin tam listesi için Malzeme Tablosuna bakın.
      NOT: Yetişkin beyinleri için yıkama adımları sırasında ekstra özen gösterilmelidir, çünkü bunlar yıkama solüsyonunun yüzeyine yüzebilir ve solüsyon çıkarıldığında kuyu kenarlarında kuruma riskiyle karşı karşıya kalabilir (bu da arka plan floresansına yol açacaktır). İyi bir uygulama, sıvı eklemek veya çıkarmak için pipeti bir elde, diğerinde ise beyinleri su altında tutmak için bir çift forseps tutmaktır.
3. Montaj
   1. Montaj adımından önce, PBS ile (PBT yerine) son bir yıkama yapın. PBS, beyinlerin hafifçe yapışkan hale gelmesine neden olur, bu da montaj sırasında istenen yönde kalmalarını sağlar.
   2. Son yıkamayı çıkarın ve üç damla floresan korumalı montaj ortamı ile değiştirin. Montaj ortamından bir damla mikroskop lamının ortasına yerleştirin.
   3. Forseps kullanarak beyinleri kuyudan slayttaki damlaya aktarın. Optik loblara zarar vermekten kaçınmak ve dokunun kurumasını önlemek için, kılcal hareket yoluyla bir beyni dikkatlice geri alın. Beynin etrafına bir çift forseps koyun, beyni içeren küçük bir sıvı hacmi uçlar arasında çekilene kadar yavaşça kapatın.
      NOT: Beyni slayta aktarırken, beyne zarar vereceği için forsepsleri kapatmamaya dikkat edin. Alternatif olarak, beyinleri aktarmak için bir P200 pipeti kullanılabilir. Açıklığı genişletmek için ucun ucunu kesin ve beynin ucun içine yapışmasını önlemek için PBT ile ön durulama yapın.
   4. Beyinleri aşağıdaki stratejilere göre monte edin (Şekil 2A).
      1. Ön taraf yukarı
         NOT: Lamina ve medulla nöronlarını görselleştirmek için beyni ön tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin (Şekil 2B). Bu, merkezi anten loblarının anatomisini ve eğriliğini inceleyerek başarılabilir.
         1. Bir çift forseps ile, hem ön hem de arka tarafları incelemek için beyni hafifçe yan çevirin. Ön tarafta, beynin eğriliğinin belirgin olduğunu ve anten loblarının merkezden hafifçe dışa doğru çıkıntı yaptığını gözlemleyin.
      2. Arka taraf yukarı
         1. Beyni, arka (düz) tarafı yukarı bakacak ve anten lobları aşağı bakacak şekilde konumlandırın (Şekil 2C).
            NOT: Bu, lobüla ve lobüla plakasını görüntüleme yüzeyine yaklaştıracaktır ve lobüla kompleks nöronlarını görselleştirmekle ilgilenenler için idealdir.
      3. Yatay görünüm
         NOT: Tüm optik lob nöropillerini aynı anda görselleştirmek için yatay bir montaj stratejisi kullanın (Şekil 2G). Bu oryantasyonda, nöronal hücre gövdeleri, aksonal yörüngeler ve dendritik arborizasyonlar aynı düzlemde görselleştirilebilir.
         1. İlk olarak, beyni ön tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Bir tungsten iğnesi ile beyni, anten lobları dışa bakacak şekilde sırt tarafına oturacak şekilde 90° yukarı doğru hafifçe eğin. Beynin hem ön hem de arka taraflarının bu yönde görünür olup olmadığını kontrol edin.
   5. Kapak kayma köprüsü yerine, kapak kızağını slayttan yükseltmek için kil kullanın. Kil kullanımı, görüntülemeden sonra beyinlerin yeniden monte edilmesine izin verir (tartışma bölümünde açıklanmıştır).
      1. Bir kapak fişinin her köşesine küçük bir kil parçası yerleştirin. Her bir kil parçasının nispeten aynı kalınlıkta olduğundan emin olun. Kil parçalarının kalınlığı 0,5-1 mm arasında olmalıdır. Lameli nazikçe beynin üzerine yerleştirin ve köşelere hafif bir baskı uygulayın. Lamel hemen sıvıyı yakalamalı ve bir conta oluşturmalıdır. Slayt artık görüntüleme için hazırdır.
         NOT: Lamellerin uzun süreli saklanması için, lamellerin oje ile kapatılması ve ışıktan 4 °C uzakta saklanması önerilir.

Representative Results

Discussion

Bu protokolde, larva ve yetişkin Drosophila beyinlerini immün olarak boyamak ve bunları çeşitli yönlerde monte etmek için bir yöntem tarif ediyoruz. Larva ve yetişkin beyinlerini boyama yöntemleri daha önce tanımlanmış olsa da 22,23,24,27,28, ^spesifik optik lob yapılarının optimal görselleştirilmesi için montaj stratejileri daha az dikkat çekmiştir ²⁸. Burada açıklanan protokolün, araştırmacılara montaj oryantasyonu ile görselleştirilen optik lob yapıları arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamalarını sağlayacağı tahmin edilmektedir.

Bu protokolde açıklanan oryantasyonlara ek olarak, optik lobun merkezi beyinden ayrılmasıyla yetişkin ve larva optik lob görselleştirmesinin alternatif açıları elde edilebilir. Optik loblar, böcek makası, forseps veya tungsten iğnesi kullanılarak merkezi beyinden ayrılabilir. Yetişkinlerde bu, merkezi beynin eğriliğinin lobların düz bir şekilde monte edilmesini engellediği ve görüntüleme sırasında eşit olmayan açılara neden olduğu durumlarda yararlı bir strateji olabilir. İzole edilmiş bir lobun, montaj yönünü belirlemek için kullanılan merkezi beyin tarafından sağlanan referans noktaları (yani anten lobları, beyin eğriliği vb.) olmadan monte edilmesinin daha zor olacağı unutulmamalıdır. Bu sınırlama, lamel eklemeden önce istenen oryantasyonun elde edildiğinden emin olmak için optik lobların bir floresan GFP mikroskobu altında (beyin uygun floresan işaretleyici için boyanmışsa) analiz edilmesiyle aşılabilir. Benzer şekilde, larvada, bir beyin lobunun bağlı kontralateral lobdan ve ventral sinir kordonundan çıkarılması, beynin herhangi bir yönde monte edilmesine izin verir. İlgilenilen optik lob yapılarına göre montaj açısını belirlemek için bir GFP mikroskobu kullanılabilir.

Beyinler, beynin görüntülenmesi ve yeniden monte edilmesinden sonra lamel çıkarılarak birden fazla yönde de görüntülenebilir. Tekrar montaj için orijinal köprü kil ile yapılmalı ve oje sürülmemelidir. Beyinleri yeniden yönlendirmek için, contayı kırmak için lamel altına bir çift forseps yerleştirilebilir. Lamel kaldırıldıktan sonra, beyinlerin çoğu montaj ortamında kalmalıdır. Beyinler daha sonra yeniden monte edilebilir ve beynin üzerine yeni bir lamel yerleştirilebilir. Bu teknik daha önce bir medulla nöronunun morfolojisinin¹⁷ yüksek çözünürlüklü üç boyutlu bir görüntüsünü oluşturmak için tek bir beyni birden fazla yönde görüntülemek için kullanılmıştı. Yeniden montaj genellikle yetişkin beyinleri ile yapılırken, teknik aynı zamanda köprünün kil ile inşa edilmesini gerektirecek olan larva beyinlerine de uygulanabilir. Larva beyin örneklerini yeniden monte ederken dikkatli bir şekilde ele almak önemlidir, çünkü kırılganlıkları, lamel çıkarıldığında yırtılma olasılıklarını artırır.

Yukarıda belirtilen protokoller pupa beyin dokusuna da uygulanabilir 10,22,24. Pupa beyinleri gelişim sırasında hızlı morfojenik değişikliklere uğradığından, erken pupa (0\u201230 h APF) için montaj oryantasyonları larva beyinlerininkine benzerken, orta-geç evre pupa (>50 h APF) yetişkin beyin montaj oryantasyonlarına daha yakındır. Pupa beyinleri, larva ve yetişkin beyinlerinden daha kırılgandır ve bu nedenle manipüle edilirken ekstra özen gerektirir.

Son olarak, sabit ve lekeli dokuya ek olarak, canlı görüntüleme uygulamaları için beyin montaj yönelimlerinin anlaşılması önemlidir. Larva ve yetişkin beyinleri, hücre bölünmelerini ve zaman içinde nöronal morfoloji ve aktivitedeki değişiklikleri takip etmek için canlı koşullar altında kültürlenebilir ve görüntülenebilir 24,27,29. Burada, kullanılan montaj oryantasyonu kritiktir, çünkü daha zayıf endojen floresan, görüntüleme sırasında optimal sinyal tespiti için ilgilenilen hücre tiplerinin beynin yüzeyine mümkün olduğunca yakın yerleştirilmesini gerektirir.

Materials

10x PBS	Bioshop	PBS405
37% formaldehyde	Bioshop	FOR201
Alexa Fluor 488 (goat) secondary	Invitrogen	A-11055	use at 1:500
Alexa Fluor 555 (mouse) secondary	Invitrogen	A-31570	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary	Invitrogen	A-21450	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (rat) secondary	Invitrogen	A-21247	use at 1:500
Cover slips	VWR	48366-067
Dissecting forceps – #5	Dumont	11251-10
Dissecting forceps – #55	Dumont	11295-51
Dissection Dish	Corning	722085
Dry wipes	Kimbery Clark	34155
Goat anti-Bgal primary antibody	Biogenesis		use at 1:1000
Guinea pig anti-Bsh primary antibody	Gift from Claude Desplan		use at 1:500
Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody	Erclik et al. 2008		use at 1:1000
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.600
Microscope slides	VWR	CA4823-180
Mouse anti-dac primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	mabdac2-3	use at 1:20
Mouse anti-eya primary antibody	DSHB	eya10H6	use at 1:20
Mouse anti-nc82 primary antibody	DSHB	nc82	use at 1:50
Mouse anti-svp primary antibody	DSHB	Seven-up 2D3	use at 1:100
Polymer Clay	Any type of clay can be used
Rabbit anti-GFP	Invitrogen	A-11122	use at 1:1000
Rat anti-DE-Cadherin primary antibody	DSHB	DCAD2	use at 1:20
Slowfade mounting medium	Invitrogen	S36967	Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used
Triton-x-100	Bioshop	TRX506