Bu protokol, larva ve yetişkin Drosophila optik loblarını görüntüleme için hazırlamak için üç adımı tanımlar: 1) beyin diseksiyonları, 2) immünohistokimya ve 3) montaj. Belirli optik lob yapılarını görselleştirmek için farklı montaj yönleri gerektiğinden, adım 3'e vurgu yapılır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Optik lob görselleştirmesi için larva ve erişkin drosophila beyinlerinin diseksiyonu, immünohistokimyası ve montajı
Bu makalede
Özet
Özet
Dört nöropilden oluşan Drosophila optik lob: lamina, medulla, lobüla ve lobüla plakası, nöral çeşitliliği oluşturan ve devre montajını yönlendiren gelişimsel mekanizmaları keşfetmek için mükemmel bir model sistemdir. Karmaşık üç boyutlu organizasyonu göz önüne alındığında, optik lobun analizi, yetişkin nöropillerinin ve larva progenitörlerinin birbirlerine ve merkezi beyne göre nasıl konumlandırıldığını anlamayı gerektirir. Burada, optik lob görüntülemesi için larva ve yetişkin beyinlerinin diseksiyonu, immün boyaması ve montajı için bir protokol tarif ediyoruz. Montaj oryantasyonu ile optik lobun uzamsal organizasyonu arasındaki ilişkiye özel önem verilmektedir. Larvada üç (ön, arka ve yanal) ve yetişkinde üç (ön, arka ve yatay) montaj stratejisi tanımladık ve bunların her biri farklı bir optik lob yapısı için ideal bir görüntüleme açısı sağlar.
Giriş
Bileşik göz ve altta yatan optik lobdan oluşan Drosophila görsel sistemi, nöral devre gelişimi ve işlevinin incelenmesi için mükemmel bir model olmuştur. Son yıllarda, özellikle optik lob, nörojenez ve devre kablolaması gibi nörogelişimsel süreçleri incelemek için güçlü bir sistem olarak ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5,6,7,8. Dört nöropilden oluşur: lamina, medulla, lobüla ve lobüla plakası (son ikis....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Larva beyinlerinin konfokal görüntüleme için hazırlanması
- Diseksiyonlar
NOT: Diseksiyona başlamadan önce, düzeltme (fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 formaldehit) ve PBT (PBS'de% 0.1-0.3 Triton) çözeltilerini hazırlayın. Sabitleme solüsyonu diseksiyon sırasında buz üzerine yerleştirilmelidir. Bu protokolde paraformaldehit (PFA) fiksatifi kullanılmasına rağmen, spesifik epitoplar için alternatif fiksasyon stratejileri (PLP20 veya PEM21 kullanılarak) tanımlanmıştır. Larva diseksiyonları için iki çift forseps (Dumont # 5 veya #55s) gereklidir. Daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosuna ba....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Protokolde tarif edilen oryantasyonlarda monte edilen larva ve yetişkin optik lobların konfokal görüntüleri Şekil 1 ve Şekil 2'de sunulmuştur.
Şekil 1, ön, arka ve yan yönelimlerde konumlandırılmış larva beyinlerinin şemalarını ve temsili konfokal dilimlerini göstermektedir. Anterior montaj oryantasyonunda, OPC epiteli (DE-Cadherin), medulla nöroblastları (deadpan>βgal) ve lamina nöronları (Da.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolde, larva ve yetişkin Drosophila beyinlerini immün olarak boyamak ve bunları çeşitli yönlerde monte etmek için bir yöntem tarif ediyoruz. Larva ve yetişkin beyinlerini boyama yöntemleri daha önce tanımlanmış olsa da 22,23,24,27,28, spesifik optik lob yapılarının optimal görselleştirilmesi için montaj stratejileri daha az dikkat çekmiştir
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bsh antikorunun bir alikotunu bizimle paylaştığı için Claude Desplan'a teşekkür ederiz. DE-Cadherin, Dachshund, Eyes Absent, Seven-up ve Bruchpilot monoklonal antikorları, NIH'nin NICHD'si tarafından oluşturulan ve Iowa Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Iowa City, IA 52242'de tutulan Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası'ndan elde edildi. Bu çalışma, T.E.'ye verilen bir NSERC Keşif Bursu ile desteklenmiştir. UA, NSERC Alexander Graham Bell Kanada Yüksek Lisans Bursu tarafından desteklenmektedir. PV, Ontario Yüksek Lisans Bursu tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | Bioshop | PBS405 | |
| %37 formaldehit | Bioshop | FOR201 | |
| Alexa Fluor 488 (keçi) ikincil | Invitrogen | A-11055 | 1:500'de kullanım |
| Alexa Fluor 555 (fare) ikincil | Invitrogen | A-31570 | 1:500'de kullanım |
| Alexa Fluor 647 (kobay) ikincil | Invitrogen | A-21450 | 1:500'de kullanım |
| Alexa Fluor 647 (sıçan) ikincil | Invitrogen | A-21247 | 1:500'de kullanım |
| Kapak fişleri | VWR | 48366-067 | |
| Diseksiyon forseps - #5 | Dumont | 11251-10 | |
| Diseksiyon forseps - #55 | Dumont | 11295-51 | |
| Diseksiyon Tabağı | Corning | 722085 | |
| Kuru mendil | Kimbery Clark | 34155 | |
| Keçi anti-Bgal birincil antikoru | 1:1000'de | biyogenez | |
| Gine domuzu anti-Bsh birincil antikoru | Claude Desplan'dan | 1:500'de kullanım | |
| Gine domuzu anti-Vsx1 birincil antikoru | Erclik ve ark. 2008 | 1:1000'de kullanım | |
| Laboratuvar filmi | Parafilm | PM-996 | |
| Mikrosantrifüj tüpleri | Sarstedt | 72.706.600 | |
| Mikroskop slaytları | VWR | CA4823-180 | |
| Fare anti-dac primer antikoru | Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB) | mabdac2-3 | 1:20'de kullanım |
| Fare anti-eya primer antikoru | DSHB | eya10H6 | 1:20'de kullanın |
| Fare anti-nc82 primer antikoru | DSHB | nc82 | 1:50'de |
| kullanın Fare anti-SVP birincil antikoru | DSHB | Yedili 2D3 | 1:100'de kullanım |
| Polimer | Kil Her türlü kil kullanılabilir | ||
| Tavşan anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | 1:1000'de |
| sıçan anti-DE-Cadherin birincil antikoru | DSHB | DCAD2 | kullanımı 1:20'de |
| Slowfade montaj ortamı | Invitrogen | S36967 | Vectashield montaj ortamı (cat# H-1000) |
| Triton-x-100 | Bioshop | TRX506 |
Kaynaklar
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell Tissue Research. 258, (1989).
- Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. Prolif....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
