Kistik Fibrozis Zebrabalık Embriyolarında Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyonuna Karşı Faj Tedavisi Uygulaması

Faj tedavisi, bakteriyel enfeksiyonlarla mücadele için bakterilerin doğal düşmanlarının kullanımı, antibiyotiklere bakteriyel direnç yaygın hale geldikçe yenilenen ilgi topluyor^1,2. Bu tedavi, Doğu Avrupa'da yıllardır kullanılan, CF olan hastalarda akciğer enfeksiyonları kür antibiyotikler için tamamlayıcı bir tedavi ve şu anda kullanılan antibiyotikler tüm dirençli bakteriler ile enfekte hastalar için olası bir tedavi alternatif olarak kabul edilebilir^2,3. Antibiyotik tedavisinin avantajları bakteriyofajlar enfeksiyon yerinde çoğalmak vardır, antibiyotikler metabolize edilir ve vücuttan ortadan kaldırır ise^4,5. Nitekim, farklı laboratuvarlarda izole öldürücü fajlar kokteyllerin uygulanması böcek ve memeliler^6,7,,8gibi farklı hayvan modellerinde Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonlarıtedavisinde etkili olduğu kanıtlanmıştır . Faj tedavisi de randomize klinik çalışmada P. aeruginosa ve Escherichia coli ile enfekte yanık yaralarıbakteriyel yükü azaltmak mümkün olduğu gösterilmiştir⁹.

Zebra balığı(Danio rerio)son zamanlarda p. aeruginosa^10,,11, Mycobacterium apse ve Burkolderia cepacia¹²dahil olmak üzere çeşitli patojenler ile enfeksiyonları incelemek için değerli bir model olarak ortaya çıkmıştır 12^,13. Bakterileri doğrudan embriyo kan dolaşımına mikroenjekte ederek^14,insan karşısına benzer nötrofiller ve makrofaj oluşumu ile korunmuş olan zebrabalığı doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından etkisiz hale getirilebilen sistemik bir enfeksiyon oluşturmak kolaydır. Ayrıca, yaşamın ilk ayı boyunca, zebra balığı embriyoları adaptif bağışıklık yanıtı eksikliği, onları doğuştan gelen bağışıklık eğitimi için ideal modeller yapma, hangi insan akciğer enfeksiyonları kritik savunma^{mekanizması15}. Zebrabalığı son zamanlarda daha iyi CF başlangıcı anlamak ve yeni farmakolojik tedaviler geliştirmek için güçlü bir genetik model sistemi olarak ortaya çıktı^10,16,17. Cftr knock-down CF zebrabalığı knock-down zebrabalığı morfinono enjeksiyonu ile oluşturulan bir sönümlü solunum patlaması yanıtı ve azaltılmış nötrofil göç^{sundu 10}, cftr knock-out bozulmuş iç organ pozisyonu ve ekofrin pankreas imha yol açar ken, insan hastalığı aynalar bir fenotip^16,17. En büyük ilgi p. aeruginosa bakteriyel yük önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulma oldu -ctr kaybı-fonksiyon embriyoları 8 saat post-enfeksiyon (hpi), hangi fareler ve insan bronşiyal epitel hücreleri ile elde edilen sonuçlara paralel kontroller daha^2,18. cftr

Bu çalışmada, faj tedavisinin zebra balığı embriyolarında P. aeruginosa enfeksiyonlarına karşı etkili olduğunu gösterin.

AB türünden (Avrupa Zebrabalığı Kaynak Merkezi EZRC) yetişkin zebra balıkları(Danio rerio),bilimsel amaçlariçin kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin uluslararası (AB Direktifi 2010/63/EU) ve ulusal yönergelere (İtalyan^kararnamesi 4 Mart 2014, n. 26) uygun olarak muhafaza edilmektedir. Standart koşullar 14 saat Açık/10 h karanlık çevrim ve 28 ° C tank su sıcaklığı ile balık tesisinde ayarlanır.

1. Çözüm ve araçların hazırlanması

1. Zebra balığı embriyoları yetiştirmek için E3 embriyo ortamı için 50x stok çözümü ve 1x çalışma çözümleri hazırlayın (Bkz. Tablo 1).
2. 24 saat sonra döllenme (24 hpf) (Tablo 1bakınız) embriyo pigmentasyon engellemek için, pigmentasyon engelleme çözeltisi olun.
3. Tablo 1'deaçıklandığı gibi 25x stok ve 1x çalışma Tricane anestezik çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Çözeltinin stok çözeltisine zarar verebilecek çözeltinin tekrar tekrar donmasını ve erimesini önlemek için 2 mL 25x tricaine'lik aliquots yapın ve -20 °C'de saklayın.
4. 100 mL'lik distile H₂O'nun mikrowavable bir şişede 1 g agarose'u eriterek embriyo mikroenjeksiyonu için izler hazırlayın. Mikrodalga 1-3 dk agarose tamamen çözülene kadar.
5. Zebrabalığı mikroenjeksiyon kalıplarını konumlandırın (bkz. Malzemeler Tablosu)petri kabında (90 mm x 15 mm) ters çevrilmiş ve sıvı agarose jeli yaklaşık 10 mm genişliğe dökerek tüm yüzeyi kaplayın.
6. Agarose katıladıktan sonra kalıbı çıkarın. Petri kabını 1x E3 embriyo ortasıyla doldurun. Bu yaklaşık bir hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir. Kullanmadan önce Tricaine içeren taze E3 ortamıile değiştirin.
   NOT: Eski kalıplarda mantar veya bakteriyel kontaminasyon gelişebilir.
7. Mikroenjeksiyon için iğnehazırlamak ve kolları sıkarak mikropipet çekmeceonları güvenli için yangın cilalı 10 cm borosilikat kılcal kullanın. Aşağıdaki ayarları ile çekmece ayarlayın: ısı 500, hız 100, zaman 150, çekme 150.

2. P. aeruginosa (PAO1) inokül hazırlama

1. GFP⁺P. aeruginosa zorlanma PAO1¹⁹ 5 mL LB suyu (Tablo 1bakınız) ve sallayarak (200 rpm) ile 37 °C'de bir gecede büyümek 1 koloni aşılayın.
2. Yukarıdaki gece kültürünü OD₆₀₀ = 0,1'e seyreltin 10 mL LB suyu ve 37 °C'de OD₆₀₀ = 0,5'e kadar sallayarak (200 rpm) büyüyün.
3. 16.100 x g'da 4 °C'de 2 dakika boyunca 2 mL'lik kültür ve hücre peletini od₆₀₀ = 1'e, fizyolojik çözeltinin 1 mL'sine eşdeğer olarak 1 x 10⁹ cfu/mL'ye yeniden askıya alın (Bkz. Tablo 1).
4. Hücre süspansiyonuna fizyolojik çözeltide yaklaşık 5 x 10⁷cfu/mL seyreltin ve 4 °C'de saklayın.

3. Faj stok hazırlama

1. 1 p. aeruginosa süzme PAO1 kolonisi 5 mL LB suyu ve sarsıntı ile 37 °C gecede kuluçka. Bir gecede kültürü₅₀₀ mL LB suyu içinde OD 600 = 0,01'e seyreltin ve 37 °C'de od₆₀₀ = 0,05 ile büyüyün, yaklaşık 2,5 x 10⁷ cfu/mL'ye eşdeğer.
2. P. aeruginosaseyreltilmiş kültür için , 10^-3enfeksiyon (M.O.I.) çokluğu elde etmek için, yaklaşık 1,25 x 10⁷ fajekleyin. OD₆₀₀ yaklaşık 0.1-0.3 (yaklaşık 3-5 saat, kullanılan faj bağlı olarak) düşer kadar sallayarak 37 °C'de kuluçka.
   NOT: PAO1 türünü etkileyen bu deney için dört faj seçilmiştir: İki Podoviridae, GenBank katılım numaraları vB_PaeP_PYO2, MF490236 ve vB_PaeP_DEV, MF490238 ve iki Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 ve vB_PaeM_E217, MF490240. Her faj için aşağıdaki adımları ayrı ayrı gerçekleştirin.
3. 37 °C'de 30 dakika boyunca 1 mg/mL DNase ve RNase ile inkübedin. 4 °C'de 30 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj edin ve supernatant'ı (SN) dikkatlice kurtarın. SN'yi 0,8 m gözenek çapına sahip bir filtreyle filtreleyin.
4. SN'ye 58 g/L NaCl ve 105 g/L PEG6000 ekleyin. RT 20 dk'da karıştırarak eritin ve gece boyunca 4 °C'de tutun. Faj yağışı için 4 °C'de 30 dk için 20, 000 x g santrifüj. SN'yi çıkarın ve faj peletini 15 mL TN tamponunda dikkatlice eritin (Bkz. Tablo 1).
5. Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi CsCl yoğunluk gradyanı ile fajları arındırın.
   1. SW41 rotor için poliallomer ultracentrifuge tüplerde, Tablo 1'detanımlanan dört CsCl çözeltisinin 2 mL'sini tabakalandırarak CsCl adım yoğunluğu gradyanı hazırlayın.  4 tüpün her birine 3,5 mL faj süspansiyonu ekleyin.
      NOT: CsCl toksiktir, işlemek ve atmak için uygun güvenlik prosedürleri benimsemek.
   2. Tüpleri rotora tanıtılın ve tüplerin dengeli olduğundan emin olun (iki bakan tüp arasındaki ağırlık farkı 0,01 g ≤ olmalıdır).
   3. 4 °C ve 100, 000 x g (SW41 rotor için 25.000 rpm) 2 saat için santrifüj. Santrifüjden sonra tüpleri yavaşça çıkarın ve dikkatlice bir destek le hareketsiz hale getirin. 19 G iğneli bir şırınga kullanarak, genellikle d=1.5 ile d=1.4 yoğunluk bölgesi arasında bulunan beyaz/opalescent bandını çizin.
   4. Şırıngadan gelen süspansiyonları SW60 rotor için yeni poliallomer tüplere aktarın ve tüpleri hassas bir şekilde dengelemek için d=1.4 çözeltisini kullanın.
   5. Süspansiyonu en az 16 saat boyunca 4 °C ve 150.0000 x g (SW60 rotor için 38.000 rpm) olarak santrifüj edin.
   6. Yukarıdaki gibi görünür bandı toplayın (bkz. adım 3.3.3) ve 6.000 Da kesme ile diyaliz tüplerine aktarın. Elde edilen görünür bandı 2x 2x'te 500 mL suya karşı 20 dk ve bir gecede 500 mL TN tampona karşı diyalize alın. 0,22 m gözenek filtresi ile filtre uygulayın ve 4 °C'de saklayın.

4. Faj kokteyli hazırlama

1. Daha önce izole ve karakterize PAO1, bulaşmasını dört fajlar bir karışımını olun⁸. Karıştırmadan önce, plak tsay²⁰ile her faj stok titresini tahmin .
2. Her deneyden hemen önce aynı pfu/mL'de dört faj preparatını eşit olarak karıştırarak, 5 × 10⁸ pfu/mL'lik genel bir titre ile faj kokteylini bir araya getirin ve doğru faj titrelerini sağlayın.

5. Cftr morpholnos mikroenjeksiyon için zebra balığı embriyolarının toplanması ve hazırlanması

NOT: Ctr morpholinos(cftr-MOs) mikroenjeksiyonu için yabani tip zebra balıklarından 1-2 hücreli embriyo toplayın.

1. Bakteriyel mikroenjeksiyon deneyiki gün önce, üreme çiftleri kurmak ve daha önce açıklandığı gibi embriyoları toplamak²¹. AB suş yetişkin zebra balığı(Danio rerio)Avrupa Zebrafish Kaynak Merkezi, EZRC satın alındı.
2. Ertesi gün, plastik bir pipet ile döllenme hemen sonra veya ince örgü süzgeç kullanarak embriyolar toplamak. Toplanan embriyoları E3 embriyosu içeren bir Petri kabına yerleştirin ve embriyo gelişimine zarar verebilecek kontaminasyonu önlemek için enkazı plastik bir pipetle dikkatlice çıkarın.
3. Steril suda iki morfinno stok çözeltisini (1 mM) 0,25 pmol/embriyo ATG-MO + 0,25 pmol/embriyo splice-MO'ya seyrelterek 5 μL morfin enjeksiyon çözeltisi hazırlayın. Embriyo enjeksiyonunu takip etmek için, morpholno enjeksiyon çözeltisi karışımına 0.5 μL fenol kırmızısı ekleyin.
4. Bir mikroenjeksiyon iğnesini, ince jel yükleme ucuna sahip 20 μL'lik bir mikropipet kullanarak morpholno karışım çözeltisinin yaklaşık 5 0L'si ile yükleyin. İğneyi bir standa bağlanan mikromanipülatöre sabitle ve stereomikroskop altında yerleştirin.
   NOT: Mikroenjektör pompasının basıncı onu iteceği için çözeltinin iğnenin ucuna ulaşması gerekli değildir.
5. İğne ucunu ince steril cımbızla keserek iğnenin ucunu kırpın. Mikroskobun oküler bir ölçek çubuğu kullanarak damla çapını ölçün. Alternatif olarak, bir mikrometre slayt üzerine mineral yağ bir damla oluşturmak ve damlacık boyutunu değerlendirmek için yağ damla içine çözelti enjekte ederek mikroenjeksiyon hacmi ayarlayın. 2 nL hacim enjekte etmek için 156 μm çapında bir damla kullanın.
6. Kullanılan iğneye bağlı olarak doğru enjeksiyon hacmini elde etmek için kompanzasyon basıncını 15 hPa'ya, enjeksiyon süresini 0,5 s'e ve enjeksiyon basıncını 300 ile 600 hPa arasında ayarlayarak mikroenjektörü ayarlayın.
7. Plastik bir pipet ile embriyoları adım 5.2'den 96 mm çapında ki Petri kabına yerleştirilmiş bir camın üzerine yerleştirin.
   NOT: Çok fazla E3 orta embriyoların chorion içine mikroenjeksiyon iğne uygun penetrasyon önleyecektir.
8. Daha önce açıklandığı gibi embriyo içine 2 nL enjekte etmek için chorion ve daha sonra iğne ile sarısı nüfuz²².
9. Enjekte edilen embriyoları E3 orta ile petri kabına yerleştirin ve 28 °C'de bir kuvöze koyarak ertesi güne kadar geliştirmelerini sağlar.

6. Bakteri ve faj kokteyli ile zebra balığı embriyolarının mikroenjeksiyonu

NOT: Sistemik bir enfeksiyon gerçekleştirmek için, embriyo genellikle 26 hpf sonra başlar kan dolaşımı na sahip olmalıdır.

1. Sonra 26 hpf (zebrabalığı gelişim aşamalarında Kimmel bakın²¹⁾pronase çözeltisi ile pronase çözeltisi ile pronase tozu 2 mg / mL konsantrasyonda E3 ortamda eriterek hazırlanan embriyolar. Yavaşça chorion kırmak için embriyolar pipet. Pronase/E3 ortamını atın ve tüm pronase'yi çıkarmak için yemeği taze E3 ile birkaç kez durulayın.
2. E3 ortamda anti-balık embriyoları anestezi ktrikoin içeren yaklaşık 5 dk önce enjeksiyonlar.
3. Pipet anestezi embriyoları parça içine adım 1 hazırlanan. Yanal pozisyonda embriyolar hattı için ince bir jel yükleme ucu kullanın.
4. Bölüm 5'te açıklandığı gibi p. aeruginosa preparatının yaklaşık 5 μL'si ile bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin.
5. İğneyi, sarısı kesesinin üzerine yayılmaya başladığı Cuvier kanalının başlangıç noktasına yerleştirin. 1-3 nL hacim enjekte edin ve hacmin doğrudan kanal içinde genişleyip dolaşıma girmesini sağlayın.
6. Enjekte edilen her 50 embriyodan yaklaşık olarak sonra, enjeksiyon hacminin aynı kalıp karip karip devam edip etmeyin kontrol etmek için 100 μL steril PBS ile 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne bir damla bakteri enjekte edin. CFU'yu değerlendirmek için bir gecede 37 °C'de LB agar Üzerinde inoculum plakası (Bkz. Tablo 1).
7. Mikroenjekte edilmiş embriyoları taze E3 orta + PTU ile iki temiz Petri kabına aktarın ve 28 °C'de kuluçkaya yatırın.
8. Seçilen iki zaman noktasında: bakteri enjeksiyonundan 30 dakika veya 3 saat sonra, Petri yemeklerinden birini kuvözden bakteri enjekte edilmiş embriyolarla dışarı atın ve 6.3'te faj kokteyli enjeksiyonu için açıklandığı şekilde pistte hizalayın.
9. Bir mikroenjeksiyon iğnesini, faj kokteylinin yaklaşık 5 μL'si (adım 4'te hazırlanmış) ince bir jel yükleme ucuyla yükleyin ve mikroenjektöre sabitleştirin (bkz. adım 5).
10. Daha önce bakteri enjekte embriyoların Cuvier kanalında faj kokteylenjekte.
11. Mikroenjekte edilmiş embriyoları taze E3 orta + PTU ile iki temiz Petri kabına aktarın ve 28 °C'de kuluçkaya yatırın.

7. PAO1 ve fajlar enjekte edilen embriyoların bakteriyükünün değerlendirilmesi

1. 8 hpi'de pipet 15 anestezili embriyo Petri kabından 1,5 mL santrifüj tüpüne kadar uzanır.
2. Anestezik solüsyonu PBS 'de (PBSTritonX) 300 μL %1 Triton X-100 ile değiştirin ve embriyoları en az 15x insülin şırıngasından steril 27-G iğneile geçirerek homojenize edin.
3. Seyreltilmiş homojenin 100 μL'sini steril PBS'nin 900 μL'lik kısmına aktararak steril PBS'deki homojenlerin seri seyreltmelerini hazırlayın.
4. Doğal olarak amp-dirençli PAO1 suşu için seçmek için, lb agar üzerindeki seyreltmelerin plakası 100 μL ampisilin (100 μg/mL) ile eklenir ve gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
5. Ertesi gün, kolonilerin sayısını sayın, cfu toplam sayısını belirlemek için seyreltme faktörü ile çarpmak ve CFU / enfekte embriyo ortalama sayısını elde etmek için homojenize embriyo sayısı ile bölün.

8. PAO1 ve fajenjekte edilen embriyoların öldürücülüğünün değerlendirilmesi

1. PAO1 enfeksiyonunun ölümcüllüğünü değerlendirmek için enjekte edilen embriyoları stereomikroskop altında 20 hpi olarak puanlandırın ve ölü embriyolar için sayıyapın (beyaz/saydam değil).
2. Enjekte edilen embriyoların %50'sinin 20 hpf'de ölümünü belirleyen pao1'in 50 (LD50) dozu yarı maksimal öldürücü konsantrasyonunu hesaplayın.

9. GFP⁺ PAO1 enfeksiyonunun stereomikroskop zaman atlamalı görüntülemesi için embriyo hazırlığı

1. 100 mL E3 çözeltisinde %1.5 düşük erime agaroseer eriterek canlı embriyo görüntüleme için kalıbı önceden değiştirin.
2. Embriyoları anestezik için %1 Tricaine ekleyin (bkz. Tablo 1).
3. At 4 hpi bir cam alt çanak plastik bir pipet ile bir embriyo transferi ve sıcak düşük erime noktası agarose çözeltisi ekleyin.
4. Cam alt çanağı stereomikroskop altında yerleştirin ve bir uç ile embriyoyu istenilen yönde konumlandırın. Dikkatle embriyo agarose bir damla eklemek için plastik bir pipet kullanın.
5. Agarose 5-10 dakika soğumasını bekleyin ve yavaşça embriyo nemli tutmak için anestezik çözelti içeren E3 ile cam alt çanak doldurun.
6. GFP⁺ bakteriler için floresan filtre (kanal 488 nm) ile floresan stereomikroskop altında embriyo ile cam alt çanak yerleştirin. 9, 14 ve 18 hpi aynı parametrelere sahip daha fazla satın alma kadar Petri çanak çıkarmayın.

10. Pro-inflamatuar sitokinlerin ekspresyonu analizleri

1. 20 hpi tricaine 1x çözeltisi ile embriyolar anestezi ve Petri çanak bir 1.5 mL santrifüj tüpü onları transfer.
2. Bir duman kaputunun altında anestezik çözeltiyi çıkarın ve 200 μL guanidium hidroklorür reaktifi ile değiştirin.
3. Embriyoları önce 200 μL'lik bir pipet, sonra en az 15 x steril 27 G iğneli bir insülin şırıngası ile tekrar tekrar pipetleyerek homojenize edin.
4. Üreticinin talimatları uyarınca, ticari olarak kullanılabilen guanidium hidroklorür reaktiflerini kullanarak homojenize edilmiş zebra balığı embriyolarından toplam RNA ayıklayın.
5. Üreticinin talimatlarına uyarak, her RNA örneğinin 1 μg'sini 2 μL 1U/μL DNase I (RNase-free) ile tedavi edin.
6. Üreticinin talimatlarına göre toplam 20 μL hacimde, ticari olarak kullanılabilen kiti (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanarak ters transkripsiyon reaksiyonu (RT) için RNA'yı 1 μg DNa'yı tedavi ettim.
7. RT reaksiyonunun 1:6 seyreltilmesinin 1,5 μL'sini kullanarak 1x SYBR Green mastermix içeren 10 μL'lik toplam hacimde RT qPCR reaksiyonu gerçekleştirin. Normalleştirme amacıyla, ev tutma genleri rpl8 ve pro-inflamatuar sitokinler için astarkullanın, TNF-α ve IL-1β için astar kullanın (Tablo 2'yebakınız). qPCR protokolü oldu: döngü 1 adım 1: 95 °C, 2 dk, bir kez tekrarlayın; döngüsü 2: adım 1 95 °C, 10 s, adım 2 55 °C, 30 s, tekrar 40x; döngüsü 3: adım 1 72 °C, 15 dk.

Burada sunulan sonuçlar ve rakamlar cftr morfonoenjeksiyonu ile üretilen CF embriyolarına daha önce10 ve adım 5'te açıklandığı gibi atıfta bulunulmuştur. CF fenotipini doğrulamak için, daha önce açıklandığı gibi kalp, karaciğer ve pankreas gibi iç organların bozulmuş pozisyonu17 (Şekil 1)dikkate alındı. Benzer sonuçlar, önceki yayınımızda bildirilen WT embriyoları durumunda elde edilebildi19.

PAO1 ile enfekte CF embriyolarında faj tedavisi ile bakteriyel yük azaltıldı. Ayrıca, 15 embriyodan oluşan grupları homojenleştirerek 8 hpi'deki bakteri yükünü değerlendirdik: PAO1 enfekte embriyolarda bulunan ortalama bakteri sayısı (cfu/embriyo) faj uygulaması ndan sonra yaklaşık 'ye düşürüldü, böylece faj kokteylinin varlığında daha az ciddi bir enfeksiyonu doğruladık (Şekil 2).

GFP+ bakteri PAO1 ile enfekte CF embriyolarda faj tedavisi ile öldürücülük azaltıldı. CF zebra balığı embriyoları 48 hpf 20 hpi (30 cfu/ embriyo, Şekil 3A)sonra% 50 öldürücü neden bir dozda PAO1 suşu GFP+ bakteri enjekte edildi. Enjeksiyon yeri, sistemik bir enfeksiyon oluşturmak için yutk veya Cuvier Kanalı'ydı. PAO1 enfeksiyonuna karşı faj tedavisi eşit karışık faj kokteyli (300-500 pfu/embriyo) 2 nL enjekte edilerek test edildi. Enjeksiyon iki farklı zaman noktasında yapıldı: 30 dk (erken) ve 7 saat (geç) bakteriyel enjeksiyon dan sonra. Her iki durumda da öldürücülük 20 hpi'de azaltıldı ve bu da faj tedavisinin etkili olduğunu gösterdi (Şekil 3B).

Canlı görüntüleme ile, floresan stereomikroskop kullanarak, biz de Cf embriyolarda GFP+ PAO1 enjekte enfeksiyon ilerlemesini takip ve yumurta kesesi üzerinde floresan bakterilerin yayılmasını azaltmada faj tedavisinin etkinliğini gösterdi. CF+PAO1 enjekte edilen embriyo 4, 9, 14 ve 18 hpi'de GFP+ bakteri çoğalması Şekil 4'ünüst tarafında gösterilirken, bakterilere karşı faj hareketi nedeniyle daha az floresan olan CF+PAO1+faj embriyosu alt kısımda gösterilmiştir (Şekil 4).

Faj tedavisi CF embriyolarında PAO1 enfeksiyonunun oluşturduğu inflamatuar yanıtı azalttı. Biz, ayrıca, PAO1 ve PAO1 tarafından oluşturulan bağışıklık yanıtı değerlendirildi + fajlar enjeksiyonu 8 hpi. Beklendiği gibi, qPCR teknikleri ile analiz edilen pro-inflamatuar sitokinlerin TNF-a ve IL-1β ekspresyonu pao1 enjeksiyonu sonrasında kontrollere göre önemli ölçüde artmış, faj kokteylinin eş enjeksiyonu ile azalmıştır(Şekil 5A,B).

Şekil 1: Cftr morfono(cftr-MOs) enjeksiyonu üzerine CF embriyolarının üretimi ve doğrulanması. (A) CF'de kalbin pozisyonu nun bozulması ve döngüye salınan embriyolar, yabani tip (WT) embriyolara göre. Kalp in situ hibridizasyon tekniği ile cmlc2 ekspresyonu ilegörselleştirilmektedir. (B) Cf embriyolarında karaciğer (ok) ve pankreasın WT. Karaciğer ve pankreasa göre bozulmuş pozisyonu in situ hibridizasyon teknikleri ile prox1a ekspresyonu ile görselleştirilmelerinde. Ölçek çubukları 100 μm'yi gösterir. liv: karaciğer; p: pankreas. Rakam19'danitibaren yeniden basılmıştır Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: PAO1 veya PAO1+fajları ile enfekte CF embriyolarında bakteriyel yük.. PAO1+fajlarda cfu/embriyonun göreceli yüzdesi PAO1 embriyolarına göredir. Üç bağımsız deneyin ortalaması ve SD'si bildirilmiştir. Rakam19'danyeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: PAO1 ve PAO1+fajları ile enfekte CF zebra balığı embriyolarının öldürücülüğü.   (A) LD50 tayini 48 hpf zebrabalığı embriyoları 1 hücreli aşamada cftr-MO ile mikroenjekte ve 48 hpf pao1 kültürünün 2 nL ile enfekte artan sayıda bakteri içeren (cfu / embriyo). Embriyoların öldürücülüğü 20 hpi idi. (B) 48 hpf'de PAO1 ile enfekte olan ve faj kokteyli (PAO1+ Φ)ile tedavi edilen CF embriyolarının 20 hpi'si öldürücüdür. Ortalama ve SD rapor altı ve dört deneyler, sırasıyla, her biri 25-40 embriyo ile vardır. Öldürücülük yüzdesine açısal dönüşüm uygulandı ve duncan testi nin ardından tek yönlü ANOVA kullanıldı. Rakam19'danyeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Zebra balıklarında faj tedavisinin etkinliğinin görüntülenmesi. PAO1 enjeksiyonu (üst embriyo) ve PAO1+fajlarda faj tedavisinin etkinliği sonrasında CF embriyolarında enfeksiyonun ilerlemesi 4, 9, 14 ve 18 hpi'de enjekte edilen embriyolara (alt embriyo) enjekte edildi. Ölçek çubuğu 100 mikron gösterir. Rakam19'danyeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: PAO1 ve PAO+faj uygulamasından sonra pro- ve anti-inflamatuar sitokinlerin ekspresyonu. 48 hpf'de PAO1 ve PAO1+Φ enjekte edilen CF embriyolarında RT-qPCR ile ölçülen TNF-a (A) ve IL-1β genlerinin ekspresyon düzeyleri 48 hpf'de normale döndü. Dört deneyin ortalaması ve SD'si bildirilmiştir. İstatistiksel anlamlılık ANOVA tarafından Duncan testi ile değerlendirildi: TNF-a (CF) vs (CF+PAO1) p = 0.015*; (CF) vs (CF+PAO1+Φ) p = 0.019*; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,77 n.s.; IL-1β (CF) vs (CF+PAO1) p = 0.00014*** için; (CF) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0.00068***; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,031*. Rakam19'danyeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Çözümlerin hazırlanması.

Tablo 2: RT-qPCR için kullanılan astarlar.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.