Üç boyutlu tek boyutlu tek eksenli mekanik stimülasyon biyoreaktör sistemi tendon kaynaklı kök hücrelerin tenojenik spesifik farklılaşması ve neo-tendon oluşumu için ideal bir biyoreaktördür.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tendon Türevi Kök Hücrelerin Tenojenik Farklılaşmasını İndüklemek Için Üç Boyutlu Tek Eksenel Mekanik Stimülasyon Biyoreaktör Sistemi Uygulama
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Tendinopati bir ortopedik alanda inflamasyon ve dejenerasyon ile ilgili yaygın bir kronik tendon hastalığıdır. Yüksek morbidite, sınırlı kendi kendini onarma kapasitesi ve en önemlisi kesin tedaviler iyatsi olmaması yla, tendinopati hala hastaların yaşam kalitesini olumsuz etkilemez. Tendon kaynaklı kök hücreler (TDSCs), tendon hücrelerinin birincil öncü hücreleri olarak, tendinopati nin gelişiminde ve tendinopati sonrası fonksiyonel ve yapısal restorasyonda önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, in vitro tendon hücrelerine TDSCs in vivo farklılaşma taklit edebilirsiniz bir yöntem yararlı olacaktır. Burada, bu protokol tendon benzeri dokulara farklılaşmak için TDSCs uyarmak için üç boyutlu (3D) tek eksenli germe sistemi dayalı bir yöntem açıklar. Bu protokolün yedi aşaması vardır: farelerin TDSC'lerinin izolasyonu, fare TDSC'lerinin kültürü ve genişlemesi, hücre tabakasının oluşumu için stimülasyon kültür ortamının hazırlanması, stimülasyon ortamında kültür oluşturma yoluyla hücre sayfası oluşumu, 3D tendon kök hücre yapısının hazırlanması, tek eksenli germe mekanik stimülasyon kompleksinin montajı ve mekanik uyarılmış in vitro tendon benzeri dokunun değerlendirilmesi. Etkinliğini histoloji ile gösterilmiştir. Tüm işlem 3 haftadan az sürer. Ekstrasellüler matriks birikimini teşvik etmek için stimülasyon kültürü ortamda 4.4 mg/mL askorbik asit kullanıldı. Lineer motorlu ayrılmış bir hazne doğru mekanik yükleme sağlar ve biyoreaktör için uygulanan taşınabilir ve kolayca ayarlanabilir. Mevcut protokoldeki yükleme rejimi %6 gerinim, 0.25 Hz, 8 saat, ardından 6 gün boyunca 16 saat istirahat edildi. Bu protokol tendondaki hücre farklılaşmasını taklit edebilir, bu da tendinopatinin patolojik sürecinin araştırılmasında yararlıdır. Ayrıca, tendon benzeri doku potansiyel olarak tasarlanmış bir otolog greft olarak tendon yaralanması tendon iyileşmesi teşvik etmek için kullanılır. Özetle, mevcut protokol basit, ekonomik, tekrarlanabilir ve geçerlidir.
Giriş
Tendinopati yaygın spor yaralanmalarından biridir. Esas olarak ağrı ile kendini gösterir, lokal şişlik, etkilenen bölgede azalmış kas gerginliği, ve disfonksiyon. Tendinopati insidansı yüksektir. Aşil tendinopati varlığı orta ve uzun mesafe koşucuları için en sık görülür (kadar 29%), patellar tendinopati varlığı da voleybol sporcular yüksek iken (%45),% 45), basketbol (%32), atletizm (%23), hentbol (%15), ve futbol (%13)1,2,3,4,5. Ancak, tendonun sınırlı kendi kendine iyileşme yeteneği nedeniyle, ve etkili ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Açıklanan yöntemler, Batı Avustralya Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi'nin yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir.
1. Fare TDSC'lerinin İzolasyon
- 6-8 haftalık C57BL/6 farelerini servikal çıkığı ile ötenazi.
- Hasat patellar tendonu24 ve Aşil tendonu25.
- Tip I kollajenaz (3 mg/mL) 6 mL olan birinden sindirin tendon 3 saat.
NOT: Faredeki tendon boyutu küçük olduğundan, bu adımda bir fareden alınan tüm tendon kullanılmalıdır. - 7 gün boyunca fetal sığır serumunun (FBS) %10'u ve streptomisin ve penisilin karışımının %1'....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Mekanik stimülasyondan önce TDSC'ler tam ortamda 0 biraraya gelir ve düzensiz bir ultrayapısal morfoloji gösterilmiştir(Şekil 2A). 6 günlük tek eksenli germe mekanik yüklemeden sonra, hücre dışı matriks (ECM) ve hücre hizalamaları iyi yönlendirilmiştir(Şekil 2B). Hücreler iyi doldurulur ve mekanik yükleme den sonra ECM'de iyi zarflanmış. Hücre morfolojisi uzatılmış olarak sunuldu ve esneme denkemeyen hücreye göre normal tendon hücresine daha çok benziyordu(Şekil 2C). Yük.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tendon mekanosiz fibröz bağ dokusudur. Önceki araştırmalara göre, aşırı mekanik yükleme tendon kök hücrelerinin osteojenik farklılaşmasına yol açabilir, yetersiz yükleme tendon farklılaşması sırasında düzensiz kollajen lif yapısına yol açacak ise21.
Ortak bir görüş, ideal bir biyoreaktör için anahtar in vitro hücresel mikroenvironment hücreler in vivo geçmesi simüle yeteneği olmasıdır. Bu nedenle, in vivo normal stres ortamını in vitro taklit tendon hücrelerine TDSCs te.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Araştırma, yazar "Batı Avustralya Üniversitesi Uluslararası Ücret Bursu ve Batı Avustralya Üniversitesi'nde Üniversite Yüksek Lisans Ödülü" alırken gerçekleştirildi. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81802214) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Askorbik asit | Sigma-aldrich | PHR1008-2G | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Gibcoä Life Technologies | tarafından 1908361 | |
| Histoloji işlemcisi | Leica | TP 1020 | |
| Minimal Esansiyel Orta (Alpha-MEM) | Gibcoä Life Technologies | tarafından 2003802 | |
| Fare Tendonundan Türetilmiş Kök Hücre | 6 ila 8 haftalık C57BL / 6 farelerin Aşil tendonlarından izole edilmiştir. Daha sonra tip I kollajenaz (3 mg / ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, ABD) 3 saat boyunca ve tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için 70 mm'lik bir süzgeçten geçirildi. | ||
| Paraformaldehit | Sigma-aldrich | 441244 | |
| Streptomisin ve penisilin karışımı | Gibcoä by Life Technologies | 15140122 | |
| Üç Boyutlu Tek Eksenli Mekanik Stimülasyon Biyoreaktör Sistemi | Ortopedik Translasyonel Araştırma Merkezi, Tıp Fakültesi, Batı Avustralya | Üniversitesiİstek üzerine sorumlu yazardan temin edilebilir. Veya tasarımımıza göre yapın* * Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programlanabilir mekanik stimülasyon, bir biyoreaktör sisteminde tendon homeostazını etkiler. Biyoteknoloji Biyomüh. 2013; 110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809 | |
| Trypsin | Gibcoä tarafından Life Technologies | 1858331 |
Kaynaklar
- Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
- Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
