Method Article

Mikrovezikül ve Ekzozomların Kağıt Bazlı Preconcentration ve İzolasyonları

DOI:

10.3791/61292

⸱

April 29th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical Engineering, Kwangwoon University, 2Korea Institute of Science and Technology (KIST), 3School of Biomedical Engineering, Korea University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan mikroveziküller ve ekzozomların etkili zenginleşmesi ve izolasyonu için kağıt tabanlı bir cihaz imal etmek için bir protokoldür.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroveziküller ve ekzozomlar hücre dışı ortama salınan ve vücutta dolaşan küçük membranöz veziküllerdir. DNA, mRNA, miRNA, proteinler ve lipidler gibi çeşitli ebeveyn hücre kaynaklı biyomoleküller içerdikleri için, bunların zenginleşmesi ve izolasyonu klinik uygulamalar için potansiyel biyobelirteçler olarak sömürülmeleri için kritik adımlardır. Ancak, konvansiyonel izolasyon yöntemleri (örn. ultrasantrifüj) mikrovezikülve ekzozomlarda önemli kayıp ve hasara neden olur. Bu yöntemler aynı zamanda aşırı santrifüj, yükleme ve reaktiflerin israfı birden çok tekrarlayan adımlar gerektirir. Bu makalede, basit bir şekilde mikroveziküllerin ve ekzozomların etkili bir şekilde zenginleştirilmesi ve izole edilmesi için tasarlanmış bir origami-kağıt tabanlı cihaz (Exo-PAD) imal etmek için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Yakınsak örnek alana sahip akordeon benzeri çok katlı katmanlardan oluşan Exo-PAD'in benzersiz tasarımı, iyon konsantrasyonu polarizasyon tekniği ile entegre edilerek mikroveziküllerin ve ekzozomların belirli katmanlarda beş kat zenginleştirilmesine olanak sağlar. Buna ek olarak, zenginleştirilmiş mikroveziküller ve ekzozomlar sadece Exo-PAD açArak izole edilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroveziküller ve ekzozomlar sırasıyla 0.2−1 μm ve 30−200 nm ölçülerinde küçük membran veziküllerdir. Onlar birkaç farklı hücre tipleri 1 tarafından hücre dışı ortama salgılanır1,2,3,4,5. Onlar DNA, mRNA, miRNA, proteinler ve lipidler alt kümeleri şeklinde ebeveyn hücre bilgileri içerir ve serum, plazma, idrar, beyin-omurilik sıvısı, amniyotik sıvı ve tükürük gibi çeşitli vücut sıvıları ile vücutta dolaşan6,7,8,9. Bu nedenle, mikroveziküllerin ve ekzozomların biyolojik sıvılardan verimli bir şekilde izole edilmesi ne kadar iyi olursa odalabilmek için, hastalığın tanı, prognoz ve gerçek zamanlı izleme ve yeni tedavi alanlarının geliştirilmesi alanlarında geniş fırsatlar sunabilmektedir.

Ancak, ultrasantrifüje dayalı mikroveziküller ve ekzozomlar için geleneksel izolasyon yöntemi son derece zaman alıcıdır ve numunenin önemli ölçüde kaybolmasına ve kirlenmesine neden olur. Birkaç hantal pipetleme ve yükleme adımları ve tekrarlanan ultracentrifugation,5,6,10,11,12ile çeşitli reaktiflerin atılması içerir olmasıdır.12 Ayrıca, ultracentrifugation tarafından indüklenen yüksek kesme stresi (~ 100.000 x g)mikrovezikülve ekzozomların fiziksel lysis neden olabilir, kötü iyileşme oranları verim (%5−23%)6,13,14. Bu nedenle, mikroveziküller ve ekzozomlar için son derece verimli, göze batmaz bir izolasyon tekniği geliştirilmeli, böylece daha yüksek iyileşme oranları elde edilmelidir.

Bir origami-kağıt tabanlı cihaz (Exo-PAD) mikroveziles ve ekzozomlar6basit, nazik ve yüksek verimli izolasyon için geliştirilmiştir. Exo-PAD'in tasarımı, seri olarak bağlı numune alanlarına sahip ve çapı giderek azalan çok katlı bir kağıttır. Yüklü biyomolekülleri önceden yoğunlaştıran nano-elektrokinetik bir fenomen olan iyon konsantrasyonu polarizasyon (ICP) tekniği bu eşsiz tasarımla bütünleşmiştir. Exo-PAD'in kullanılması, mikroveziküllerin ve ekzozomların belirli katmanlarda beş kat zenginleşmesine ve cihazın sadece açığa çıkarılarak izolasyonuna yol açtı. Bu makalede, exo-PAD ayrıntılı olarak açıklanır, genel cihaz imalatı ve operasyon kullanımının analizi, yöntemi göstermek ve temsili sonuçları göstermekiçin 6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cihaz imalatı

  1. Yazıcı yazılımı(Tablo Of Materials)kullanarak kağıda basılacak bölgeyi tanımlayın.
    NOT: Tasarım, dairesel numune alanlarının çaplarının kademeli olarak 5 mm'den 2 mm'ye kadar daraldığı 12 balmumu desenli katmana sahiptir(Şekil 1A).
  2. Selüloz kağıdın her iki tarafına belirlenen bölgelere hidrofobik balmumu yazdırın(Malzeme Tablosu) ticari balmumu yazıcı(Malzeme Tablosu)(Şekil 1B)kullanarak.
  3. Balmumu baskılı kağıdı 120 °C'de 80 s'lik bir laboratuvar fırınına yerleştirin.
    NOT: Bu adım, basılı balmumu termal bir yeniden akış elde ederek kağıdın içine ulaşmak için balmumu sağlar. Bu kuluçka protokolü ile desenin çözünürlüğü ~2 mm'dir. Böylece, 2 mm'den daha az desenler yazdırmamaya dikkat edin aksi takdirde desenler balmumu tarafından engellenir.
  4. Tek tek cihazlar yapmak için balmumu baskılı kağıdı bir kesici ile kesin(Şekil 1C).
  5. Damla 5 μL ve 2 μL permektif membran (örneğin, Nafion; Malzeme Tablosu) sırasıyla en sol ve en sağ katmanlarda örnek alanlara (Şekil 1D).
  6. Permselective membran çözücübuharlaştırmak için 30 dakika için 70 °C sıcak bir plaka üzerinde permselmembran membran ile kaplanmış katmanları yerleştirin.
  7. Tampon çözeltiye bakan kaplamalı tabakanın en dış yüzeyini basınca duyarlı bantla kapatın ve küçük bir delik bırakın.
  8. Yazdırılan tek tek cihazı (örn. Exo-PAD) beyaz çizgiler boyunca ileri geri katlayın.
    NOT: Cihazı katlayarak, tüm örnek alanlar yakınsamayla bağlanır (Şekil 1E). Bu yakınsak tasarım, Voltaj ICP için uygulandığında elektrik alan çizgilerini odaklayarak mikroveziküllerin ve ekzozomların daha yoğun bir ön konsantrasyonuna ulaşır.

2. Iyon konsantrasyonu polarizasyonu ile mikroveziküllerin ve ekzozomların zenginleştirilmesi ve mekansal odaklanması

  1. Mikrovezikül ve ekzozom numunesinin 15 μL'sini yükleyin (~3 x 1011 partikül/mL 0,1x fosfat tamponlu tuzlu tuzlu [PBS] ile %0,05 Ara 20) yakınsak numune alanlarına boru lama ile ve tüm numune alanlarının tam Olarak ıslatılmasını sağlamak için birkaç saniye bekleyin(Şekil 1F).
  2. Exo-PAD'in her iki ucuna iki akrilik oda yerleştirin ve exo-PAD'i küçük bağlayıcı klipslerle güvenli bir şekilde kenetleyin (Şekil 1G).
  3. Odaları 0,1x PBS'nin 110 μL'si ile doldurun ve iki Ag/AgCl elektrot takın(Şekil 1H).
  4. Akım gerilimi kaynak ölçüm sistemi(Malzeme Tablosu)kullanarak elektrotlara 20 dk için 30 V uygulayın.
    NOT: Uygulanan gerilim ICP fenomenini oluşturur ve bu nedenle Exo-PAD'in 8 ve 9.

3. Zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların izolasyonu

  1. Katlanmış Exo-PAD'i akrilik bölmelerden ayırın ve zenginleştirilmiş mikrovezikülleri ve ekzozomları diğer katmanlardan izole etmek için cihazı açın(Şekil 1I).
  2. Mikroveziküllerin ve ekzozomların zenginleştiği 8 ve9.

4. Taramalı elektron mikroskobu analizi

  1. Zenginleştirilmiş mikrovezikülleri ve ekzozomları, delikli alanları 0,1 M sodyum kacodylate tamponuna 0,1 M sodyum kacodylate tamponuna ve 0,1 M sodyum kacodylate de %1'de 1 saat eve batırarak düzeltin.
    DİkKAT: Osmiyum tetroksit son derece zehirli ve tehlikeli bir kimyasaldır. Osmiyum tetroksit plastiklere nüfuz edebileceği nden, camda saklanmalıdır. Osmiyum tetroksitin herhangi bir şekilde taşınması, çift nitril eldivenli kimyasal bir duman kaputunda yapılmalıdır.
  2. Sabit mikrovezikülleri ve ekzozomları 200 reis etanol (yani%50, %70, %90 ve %100) artan derecelerle susuz laştırın her biri 30 dakika.
  3. Kimyasal 30 dakika boyunca bir kurutucu içinde hexamethyldisilazane daldırma tarafından örnek kuru.
    DİkKAT: Hexamethyldisilazane yanıcı ve neme duyarlı bir kimyasaldır. Ateşleme kaynaklarından uzakta kuru ve iyi havalandırılan bir alanda saklanmalıdır.
  4. Tamamen kurutulmuş mikrovezikülleri ve ekzozomları altın/paladyum (~20 nm) ile kaplayın ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntülerini yakalayın.

5. Nanopartikül izleme analizi

  1. 20 dk cihaz çalışmasından sonra biyopsi yumruğu kullanarak 6, 8 ve 10 katmanlarındaki numune alanlarını delin.
  2. Her delikli alanı tampon çözeltiye daldırın (0,1x PBS %0,01 Ara 20 ile).
  3. Zenginleştirilmiş mikrovezikülleri ve ekzozomları yeniden askıya almak için 6.000 rpm'de 30 s'lik 10 dakika ve santrifüj için girdap.
  4. Çözeltiden delikli alanları çıkarın ve mikroveziküllerin ve ekzozomların konsantrasyonunun bir nanopartikül izleme analizi (NTA) cihazı(Malzeme Tablosu)ile ölçün.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İşlem süresi zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların maksimum geri kazanım verimini elde etmek için optimize edilmelidir. Yetersiz zaman mikroveziküllerin ve ekzozomların yeterli göçetmesine izin vermez, bu da zenginleştirmeyi azaltır, aşırı zaman ise uzamsal odaklamayı bozar ve dolayısıyla mikrovezikülleri ve ekzozomları dağıtır. Böylece, zaman optimizasyonu adımı ile mikroveziküllerin ve ekzozomların maksimum ön konsantrasyon faktörü ve mikroveziküllerin ve ekzozomların en zengin olduğu son yer tespit edile...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exo-PAD mikroveziküllerin ve ekzozomların zenginleşmesi ve izolasyonu için başarılı bir şekilde kullanılmasına rağmen, birkaç kritik nokta dikkatle düşünülmelidir: 1) cihaz hazırlama sırasında fırın kuluçka süresi ve sıcaklığı, 2) işlem süresi, 3) değişen katman numaraları ve örnek alan çapları ile gerilim uygulaması ve 4) klinik numunelere uygulanabilirlik.

Protokolde verilen kuluçka süresi ve sıcaklığı, güvenilir bir cihaz imal etmek için optimize edilmiş koşullardır. Daha uzun kuluçka sürel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Kore Ulusal Araştırma Vakfı Grant NRF-2018R1D1A1A09084044 tarafından desteklenmiştir. J. H. Lee, 2019 yılında Kwangwoon Üniversitesi'nden bir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Hyerin Kim, Kore Ticaret, Sanayi ve Enerji Bakanlığı'nın (MOTIE) Kore Teknoloji Geliştirme Enstitüsü (KIAT) tarafından işletilen "Endüstri Uzmanları için Yetkinlik Geliştirme Programı" tarafından desteklendi. P0002397, Giyilebilir Akıllı Cihazların Endüstriyel Yakınsaması için HRD programı).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ag / AgCl elektrotlarıA-M Sistemleri, Inc.5315000.15 "çapında
Sığır Serumu (BSA) Albümini, Alexa Fluor 594 konjugeThermo Fisher ScientificA13101BSA, Alexa Fluor 594 ile konjuge (Ex / Em: 590/617 nm)
Karbonat-Bikarbonat TamponuSigma-AldrichC3041-50CAPKarbonat tamponu
CorelDraw yazılımı (Coral Co., Kanada)Corel CorporationBalmumu baskısını tanımlamak için yazıcı yazılımı bölge
ColorQube 8870Xerox CorporationBalmumu yazıcı
Kromatografi kağıdı sınıf 1Whatman3001-861Selüloz kağıt, boyut: 20 * 20 cm
Floresan etiketli eksozom standartlarıHansaBioMed Life Sciences, Ltd.HBM-F-PEP-100FITC ile etiketlenmiş eksozom (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 akım/gerilim kaynak ölçerKeithley Instruments, Inc.Akım– Gerilim Kaynağı Ölçüm Sistemi
Nafion perflorlu reçine çözeltisiSigma-Aldrich31175-20-9Permselective membran, düşük alifatik alkoller ve su karışımında ağırlıkça %20; %34 su içerir
NanoSight LM10NanoSight TeknolojisiNanopartikül izleme analizi (NTA) makinesi
Fosfat tamponlu salin (PBS, pH7.4)Thermo Fisher Scientific10010001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18 (10), 3175(2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Paper Based DeviceMicrovesicle IsolationExosome EnrichmentIon Concentration PolarizationWax Patterned LayersPerm Selective MembraneElectrokinetic PreconcentrationFluorescence QuantificationSEM AnalysisProtein Rich Samples

Related Articles