Sunulan mikroveziküller ve ekzozomların etkili zenginleşmesi ve izolasyonu için kağıt tabanlı bir cihaz imal etmek için bir protokoldür.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mikrovezikül ve Ekzozomların Kağıt Bazlı Preconcentration ve İzolasyonları
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Mikroveziküller ve ekzozomlar hücre dışı ortama salınan ve vücutta dolaşan küçük membranöz veziküllerdir. DNA, mRNA, miRNA, proteinler ve lipidler gibi çeşitli ebeveyn hücre kaynaklı biyomoleküller içerdikleri için, bunların zenginleşmesi ve izolasyonu klinik uygulamalar için potansiyel biyobelirteçler olarak sömürülmeleri için kritik adımlardır. Ancak, konvansiyonel izolasyon yöntemleri (örn. ultrasantrifüj) mikrovezikülve ekzozomlarda önemli kayıp ve hasara neden olur. Bu yöntemler aynı zamanda aşırı santrifüj, yükleme ve reaktiflerin israfı birden çok tekrarlayan adımlar gerektirir. Bu makalede, basit bir şekilde mikroveziküllerin ve ekzozomların etkili bir şekilde zenginleştirilmesi ve izole edilmesi için tasarlanmış bir origami-kağıt tabanlı cihaz (Exo-PAD) imal etmek için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Yakınsak örnek alana sahip akordeon benzeri çok katlı katmanlardan oluşan Exo-PAD'in benzersiz tasarımı, iyon konsantrasyonu polarizasyon tekniği ile entegre edilerek mikroveziküllerin ve ekzozomların belirli katmanlarda beş kat zenginleştirilmesine olanak sağlar. Buna ek olarak, zenginleştirilmiş mikroveziküller ve ekzozomlar sadece Exo-PAD açArak izole edilir.
Giriş
Mikroveziküller ve ekzozomlar sırasıyla 0.2−1 μm ve 30−200 nm ölçülerinde küçük membran veziküllerdir. Onlar birkaç farklı hücre tipleri 1 tarafından hücre dışı ortama salgılanır1,2,3,4,5. Onlar DNA, mRNA, miRNA, proteinler ve lipidler alt kümeleri şeklinde ebeveyn hücre bilgileri içerir ve serum, plazma, idrar, beyin-omurilik sıvısı, amniyotik sıvı ve tükürük gibi çeşitli vücut sıvıları ile vücutta dolaşan6,7,8
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Cihaz imalatı
- Yazıcı yazılımı(Tablo Of Materials)kullanarak kağıda basılacak bölgeyi tanımlayın.
NOT: Tasarım, dairesel numune alanlarının çaplarının kademeli olarak 5 mm'den 2 mm'ye kadar daraldığı 12 balmumu desenli katmana sahiptir(Şekil 1A). - Selüloz kağıdın her iki tarafına belirlenen bölgelere hidrofobik balmumu yazdırın(Malzeme Tablosu) ticari balmumu yazıcı(Malzeme Tablosu)(Şekil 1B)kullanarak.
- Balmumu baskılı kağıdı 120 °C'de 80 s'lik bir laboratuvar fırınına yerleştirin.
NOT: Bu adım, basılı balmumu termal bir y....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İşlem süresi zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların maksimum geri kazanım verimini elde etmek için optimize edilmelidir. Yetersiz zaman mikroveziküllerin ve ekzozomların yeterli göçetmesine izin vermez, bu da zenginleştirmeyi azaltır, aşırı zaman ise uzamsal odaklamayı bozar ve dolayısıyla mikrovezikülleri ve ekzozomları dağıtır. Böylece, zaman optimizasyonu adımı ile mikroveziküllerin ve ekzozomların maksimum ön konsantrasyon faktörü ve mikroveziküllerin ve ekzozomların en zengin olduğu son yer tespit edile.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Exo-PAD mikroveziküllerin ve ekzozomların zenginleşmesi ve izolasyonu için başarılı bir şekilde kullanılmasına rağmen, birkaç kritik nokta dikkatle düşünülmelidir: 1) cihaz hazırlama sırasında fırın kuluçka süresi ve sıcaklığı, 2) işlem süresi, 3) değişen katman numaraları ve örnek alan çapları ile gerilim uygulaması ve 4) klinik numunelere uygulanabilirlik.
Protokolde verilen kuluçka süresi ve sıcaklığı, güvenilir bir cihaz imal etmek için optimize edilmiş koşullardır. Daha uzun kuluçka sürel.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Kore Ulusal Araştırma Vakfı Grant NRF-2018R1D1A1A09084044 tarafından desteklenmiştir. J. H. Lee, 2019 yılında Kwangwoon Üniversitesi'nden bir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Hyerin Kim, Kore Ticaret, Sanayi ve Enerji Bakanlığı'nın (MOTIE) Kore Teknoloji Geliştirme Enstitüsü (KIAT) tarafından işletilen "Endüstri Uzmanları için Yetkinlik Geliştirme Programı" tarafından desteklendi. P0002397, Giyilebilir Akıllı Cihazların Endüstriyel Yakınsaması için HRD programı).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ag / AgCl elektrotları | A-M Sistemleri, Inc. | 531500 | 0.15 "çapında |
| Sığır Serumu (BSA) Albümini, Alexa Fluor 594 konjuge | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA, Alexa Fluor 594 ile konjuge (Ex / Em: 590/617 nm) |
| Karbonat-Bikarbonat Tamponu | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Karbonat tamponu |
| CorelDraw yazılımı (Coral Co., Kanada) | Corel Corporation | Balmumu baskısını tanımlamak için yazıcı yazılımı bölge | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Balmumu yazıcı | |
| Kromatografi kağıdı sınıf 1 | Whatman | 3001-861 | Selüloz kağıt, boyut: 20 * 20 cm |
| Floresan etiketli eksozom standartları | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | FITC ile etiketlenmiş eksozom (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 akım/gerilim kaynak ölçer | Keithley Instruments, Inc. | Akım– Gerilim Kaynağı Ölçüm Sistemi | |
| Nafion perflorlu reçine çözeltisi | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membran, düşük alifatik alkoller ve su karışımında ağırlıkça %20; %34 su içerir |
| NanoSight LM10 | NanoSight Teknolojisi | Nanopartikül izleme analizi (NTA) makinesi | |
| Fosfat tamponlu salin (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
Kaynaklar
- Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
- Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
