Bu protokolün amacı, Rhodamine konjuge globüler aksini Drosophila embriyolarına enjekte etmek ve ısı stresini takiben intranükleer aksin çubuk tertibatını görmektir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı Isı Stresli Drosophila Embriyolarında İntranükleer Akin Çubuklarının Görüntülenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Bu protokolün amacı, ısı stresinden sonra canlı Drosophila melanogaster embriyolarında bir araya gelen intranükleer akin çubuklarını görselleştirmektir. Aktiin çubukları, nörodejeneratif hastalık da dahil olmak üzere insan patolojilerine eşlik eden korunmuş, indüklenen Bir Aktün Stres Yanıtı'nın (ASR) ayırt edici özelliğidir. Daha önce, ASR'nin morfogenez başarısızlıklarına ve gelişmekte olan embriyoların canlılığının azalmasına katkıda bulunduğunu gösterdik. Bu protokol, görüntüleme, genetik ve biyokimyaya son derece uygun bir model sisteminde aktin çubuk montajının ve ASR'nin altında bulunan mekanizmaların sürekli incelenmesini sağlar. Embriyolar toplanır ve enjeksiyona hazırlamak için bir kapak kapağına monte edilir. Rhodamine konjuge globüler aktilin (G-actinRed)seyreltilir ve bir mikroneedle yüklenir. Her embriyonun ortasına tek bir enjeksiyon yapılır. Enjeksiyondan sonra embriyolar yüksek sıcaklıkta inkübe edilir ve intranükleer aksin çubukları daha sonra konfokal mikroskopi ile görselleştirilir. Aktüer çubuklarında fotobleaching (FRAP) deneyleri yapıldıktan sonra floresan iyileşmesi yapılabilir; ve sitoplazmdaki diğer aktin bakımından zengin yapılar da görüntülenebilir. G-actinRed'in endojen G-actin gibi polimerize olduğunu ve kendi başına normal embriyo gelişimine müdahale etmediğini görüyoruz. Bu protokolün bir sınırlaması, embriyonun ciddi yaralanmasını önlemek için enjeksiyon sırasında dikkatli olunması gerektiğidir. Bununla birlikte, pratikte, G-actinRed'i Drosophila embriyolarına enjekte etmek, aktivin çubuklarını görselleştirmenin hızlı ve güvenilir bir yoludur ve herhangi bir genotip sinekle veya hipoksi ve oksidatif stres de dahil olmak üzere diğer hücresel streslerin girmesiyle kolayca kullanılabilir.
Giriş
Bu protokol, indükleyici bir Actin Stres Yanıtı (ASR)1geçiren ısı stresli embriyolarda intranükleer akin çubuklarının montajını görselleştirmek için G-actinRed'in nasıl enjekte edildiğini açıklar. Bu protokolü, embriyolarda morfogenezin bozulmasına ve canlılığın azalmasına yol açan ASR çalışmalarına yardımcı olmak için geliştirdik ve yetişkin insan hücre tiplerinde böbrek yetmezliği2, kas miyopatileri3ve Alzheimer ve Huntington Hastalığı 4 ,5,6,7,8g....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Embriyo toplama kapları ve elma suyu agar tabakları hazırlayın
- Enjeksiyon deneyinden beş gün önce,28 tane inşa edin veya en az iki küçük embriyo toplama bardağı temin edin. Küçük toplama bardakları ile kullanılmak üzere taze 60 mm elma suyu agar tabakları yapın28. Tabakları 4 °C'de nemli kağıt havlularla kaplı plastik kutularda saklayın.
NOT: Adım 1.3'te açıklandığı gibi sinek sayılarıyla doldurulan küçük embriyo toplama bardakları, deney başına yeterli embriyo sayısı sağlarken, embriyo elleçleme ve enjeksiyonunun erken gelişim evrelerinin görüntülenmesine izin verecek kadar kısa sürede yapılabilmesini sa....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1'deembriyo işlemenin şematik iş akışı gösterilmiş ve Tablo 1'detipik bir deney için bir zaman çizelgesi sunulmuştur. İyi bir deneysel sonuç için bir tahmin, enjekte edilen her 10 embriyo için, görüntülenen embriyoların en az yarısının doğru gelişim aşamasında olacağı, hasarsız olacağı ve 32 ° C'de ısı stresi olan sağlam bir ASR sergileyeceğidir. Bu ASR, Şekil 2A'da (sağ panel) bir embriyonun temsili yüzey görünümü görüntüsünde gösterildi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yöntemin önemi, ASR ve eşlik eden akin çubuk montajı ile ilgili yeni araştırmalara olanak sağlamak için Drosophila embriyoları21,22,23,24,25,26,27'de iyi kurulmuş mikroenjeksiyon protokolünü kullanmasıdır. G-actinRed'i canlı embriyolara enjekte etmenin en büyük avantaj.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması bildirilmedi.
Teşekkürler
Yazarlar, Sokac laboratuvarında bu tekniğin öncülükine yardımcı olan Liuliu Zheng ve Zenghui Xue'nun yanı sıra analize yardımcı olan Hasan Seede'nin çalışmalarını minnetle kabul ediyorlar. Bu çalışma nih (R01 GM115111) tarafından bir hibe ile finanse edilir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Adenozin trifosfat (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | G tamponunun bileşeni |
| Elma suyu, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Elma suyu plakalarının bileşeni |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Elma suyu plakalarının bileşeni |
| Çamaşır suyu, PureBright Antisidal, %6.0 sodyum hipoklorit | KIK International | 059647210020 | Embriyoların dekoryonlanması için |
| Kalsiyum klorür | Millipore-Sigma | C1016500G | G tamponunun bileşeni |
| Hücre süzgeci, 70 & mu; m | Falcon | 352350 | Dekoryonlu embriyoları toplamak için |
| Konfokal mikroskop, LSM 880 Airyscan ile 34 kanallı | Zeiss | 0000001994956 | İntranükleer aktin çubuklarını görüntülemek için |
| Kurutucu | Kurutucu | 24001 | Embriyoları kurutmak için |
| Diseksiyon mikroskobu, Stemi 508 8:1 yakınlaştırmalı stereoskop | Zeiss | 4350649000000 | Embriyoları agar kaması üzerinde düzenlemek için |
| Diseksiyon iğnesi, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | Agar wedge üzerinde embriyoları düzenlemek için |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | G tamponunun |
| Çift Taraflı Bant, Scotch Permanent, 0,5 inç x 250 inç | 3M | 021200010323 | Embriyo tutkalı yapmak için |
| Embriyo toplama kafesi | Genessee Scientific | 59100 | Yetişkin sinekleri barındırmak ve embriyoları toplamak için |
| İnce uçlu cımbız, Dumont Cımbız, Stil 5 Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 72701D | Embriyoları agar kama üzerinde düzenlemek için |
| Cam kılcal damarlar, Borosilikat cam, ince 1 mm x 0,75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | Mikroiğneler için |
| Halokarbon yağı 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | Embriyoların hidrasyonu için |
| Isıtılmış sahne inkübatörü | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | Konfokal görüntüleme için |
| Laboratuvar Doku Silecekleri, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Laboratuvar doku silecekleri |
| Işık mikroskobu, Invertoskop 40C Ters Faz kontrastı mikroskop, yenilenmiş | Zeiss | Üretimi Durdurulan | Enjeksiyon mikroskobu |
| Metil-4-hidroksibenzoat | Millipore-Sigma | H36471KG | Elma suyu plakalarının bileşeni |
| Mikroenjektör, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | |
| Mikroenjektör Mikro yükleyici uçları, epT.I.P.S. 20 & mu; L | Eppendorf | 5242956003 | Mikroiğneleri yüklemek için |
| İğne ayarı için x, y, z kadranlı mikromanipülatör ve enjeksiyon aşaması | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | Mikroenjeksiyon yapmak için |
| Mikropipet çektirmesi, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | Mikroiğneler yapmak için kılcal boruları çekmek için |
| Mikroskop kapak camı 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | Embriyoları monte etmek için |
| Mikroskop slaytları, Lila Colorfrost, Önceden Temizlenmiş, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | Enjeksiyon için embriyoları monte etmek için |
| n-Heptan | Fisher Scientific | H3601 | Embriyo yapıştırıcısının bileşeni |
| Objektif, 10x | Zeiss | Durduruldu | Enjeksiyon mikroskobu |
| için 10x objektifObjektif, C-apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | Konfokal Objektif için 40x su objektifi |
| , yağ, su, silikon yağı veya gliserin daldırması için LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 (D=0.17mm'de WD=0.57mm) | Zeiss | 4208529871000 | Konfokal Objektif için 25x karışık daldırma objektifi |
| , Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | Konfokal için 63x yağ objektifi |
| Boya fırçası, Robert Simmons Expression E85 Sivri Uçlu Yuvarlak boyut 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | Embriyoları transfer etmek için |
| Kağıt havlular, Kleenex C-katlamalı kağıt havlular, beyaz | Kimberly-Clark | 884266344845 | Lekeleme hücresi süzgeci |
| için Pasteur pipeti, 5 3/4 inç | Fisher Scientific | 1367820A | Embriyoları yağ ile kaplamak için |
| Petri kabı, cam, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | Nemli inkübasyon odası için |
| Petri kabı, plastik, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | Elma suyu plakaları için |
| Pipet, Eppendorf Referans 0.5-10 μ L | Eppendorf | 2231000604 | |
| Mikroiğne Pipet ucunu yüklemek için, xTIP4 250 μ L | Biotix | 63300006 | Lameli embriyo yapıştırıcısı eklemek için |
| Tıraş bıçağı | VWR | 55411050 | Agar kaması, bant, pipet uçları kesmek için |
| Rodamin konjuge globüler aktin, insan trombositi (kas dışı; 4x10 & mu; g) | Hücre İskeleti, Inc. | APHR-A | G-aktin ^ Kırmızı |
| Sintilasyon şişesi, 20 mL Polietilen astarlı ve üre kapaklı cam borosilikat, | Fisher Scientific | 033377 | Embriyo tutkalı yapmak için |
| Vidalı üst kavanoz, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | Embriyoları kurutmak için |
| Aşama mikrometre | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 602104PG | G-aktin enjeksiyonunun hacmini kalibre etmek için |
| Sükroz | Millipore-Sigma | 840971KG | Elma suyu plakalarının bileşeni |
| Trizma tabanı | Millipore-Sigma | T15031KG | G tamponunun |
| bileşeni Maya, Lesaffre Yeast Corporation Maya, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Maya macunu bileşeni |
Kaynaklar
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytos....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
