Yöntem makalesi

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

DOI:

10.3791/61298

⸱

16 Temmuz 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 2Institute for Structural Biology, Drug Discovery and Development, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, elektron mikroskopisi ile birlikte yerli hücreli membran nanopartikül sistemini kullanan membran proteinlerinin oligomerik durumunun belirlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre zarı sistemlerindeki protein-protein etkileşimleri, hücreden hücreye etkileşimlerden sinyal transdüksiyona kadar çok çeşitli biyolojik süreçlerde çok önemli roller oynar; çevre sinyallerini algılamaktan biyolojik yanıta; metabolik düzenlemeden gelişimsel kontrole kadar. Protein-protein etkileşimlerinin doğru yapısal bilgileri, membran protein komplekslerinin moleküler mekanizmalarını anlamak ve bu proteinleri modüle etmek için son derece spesifik moleküllerin tasarımı için çok önemlidir. Protein-protein etkileşimlerinin tespiti ve analizi için birçok in vivo ve in vitro yaklaşım geliştirilmiştir. Bunlar arasında yapısal biyoloji yaklaşımı, atomik düzeyde protein-protein etkileşimlerinin doğrudan yapısal bilgilerini sağlayabilmesi bakımından benzersizdir. Bununla birlikte, mevcut membran protein yapısal biyolojisi hala büyük ölçüde deterjan bazlı yöntemlerle sınırlıdır. Deterjan bazlı yöntemlerin en büyük dezavantajı, yerel lipid bilayer ortamları deterjan molekülleri tarafından çıkarıldıktan sonra genellikle membran protein komplekslerini ayrıştırmaları veya denatüre etmeleridir. Membran protein yapısal biyolojisi için yerli hücreli membran nanopartikül sistemi geliştiriyoruz. Burada, AcrB'nin oligomerik durumunun bir vaka çalışması ile hücre zarı üzerindeki protein-protein etkileşimlerinin analizinde bu sistemin kullanımını gösteriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein-protein etkileşimleri (ÜFE), proteinlerin yapısının ve işlevinin korunmasından tüm sistemlerin düzenlenmesine kadar biyoloji boyunca önemli roller oynar. PPI'lar birçok farklı biçimde gelir ve ne tür etkileşimler oluşturduklarına göre kategorize edilebilir. Bu kategorilerden biri homooligomerik veya heterooligomeriktir, etkileşimlerin özdeş alt biralar veya alt bira olarak hareket eden farklı proteinler arasında olup olmadığına dayanır. Başka bir kategori, etkileşimler istikrarlı komplekslerin veya geçici karmaşık durumların oluşumuna yol açıyorsa, etkileşimin gücüne dayanır. Proteinler arasındaki PPI'lar hakkında yapısal bilgiler, proteinlerin işlevlerini yerine getirme mekanizmasını anlamada çok önemlidir. Proteinlerin% 80'inden fazlasının fonksiyonel rollerini yerine getirmek için karmaşık oluşuma güvendiği tahmin edilmiştir1. Doğru doğuştan gelen işleyiş için PPI'lara bağımlı olduğu gözlenen proteinlerin yüzdesinin biyolojideki önemi kolayca belirgindir, ancak bu etkileşimlere giren proteinleri düzgün bir şekilde araştırabilmek, proteinlerin PPI'ları oluştururken deneysel olarak gözlemlemek için mevcut tekniklerdeki sınırlamalar nedeniyle zor olmaya devam etmektedir.

Şu anda mevcut PPI belirleme tekniklerinin çoğundan elde edilen yüksek gürültü, yanlış pozitifler ve yanlış negatifler nedeniyle deneysel olarak belirlenen birçok PPI için sonuçlar arasında yüksek derecede anlaşmazlık vardır. Bu özellikle maya iki melez (Y2H) sistemi, tandem benzeşim saflaştırma-kütle spektrometresi (TAP-MS) ve ÜFE belirleme 2 ,3,4,5,6,7için en sık kullanılan yöntemlerden üçünü temsil eden floresan rezonans enerji transferi (FRET) için böyledir. Buna karşılık, nükleer manyetik rezonans (NMR), X-ışını kristalografisi ve elektron mikroskopisi (EM) gibi protein yapısal biyoloji teknikleri, atom seviyesine kadar protein-protein etkileşimleri hakkında yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler elde etmek ve ilgi çekici bir hedef protein için meydana gelen etkileşimlerin doğrudan görsel olarak onaylanmasını sağlamak için kullanılabilir. Şu anda mevcut olan tüm yapı tabanlı olmayan ÜFE belirleme araştırma teknikleri (örneğin, Y2H, TAP-MS ve FRET) bu yetenekten yoksundur ve ayrıca proteinler arasındaki zayıf ve geçici etkileşimleri tanımlamakta zorlanmaktan muzdariptir5. Bu eksiklikler, uygun kuaterner yapı ve heteromerik kompleks montajın oluşumunu etkileyen lipid ortamının ek değişkeninin getirdiği ek karmaşıklık nedeniyle membran proteinleri incelerken daha da artmaktadır.

Membran proteinleri proteomun büyük bir kısmını oluşturan ve tüm canlı organizmalarda uygun hücre işleyişinde birçok önemli rol oynadığı bilinmektedir. Membran proteinlerinin insan genomunun% 27'sini oluşturduğu ve mevcut tüm ilaç hedeflerinin ~ % 60'ını oluşturduğu tahmin etmesine rağmen, yayınlanan tüm protein yapılarının sadece ~ 2.2'sini oluşturan membran proteinleri için çözülmüş modellerin sayısında büyük bir anormallik vardır8,9,10. Yapısal bilgilerin mevcudiyetinde tutarsızlığın birincil nedeni, membran proteinlerinin içsel özelliklerinde yatmaktadır. Zayıf çözünürlükleri, yerel yapıyı ve işlevi korumak için lipid ortamı ile etkileşimlerine güvenmeleri ve lipid zarının kendisinin çeşitli fizikokimyasal özellikleri nedeniyle, membran proteinleri bunları incelemek için yapısal biyoloji tekniklerini uygularken önemli bir sorunu temsil etmeye devam eder. Bu içsel özelliklerden doğru yapısal bilgi elde etmek için en önemlisi, doğal lipit ortamlarıyla etkileşime sahip olmalarının doğal yapılarını ve işlevlerini korumaları gereksinimidir. Lipid ortamı, membran proteinlerinin yapısının ve işlevinin ayrılmaz bir parçasıdır, membin kavramı (membran ve protein kelimelerinin bir kombinasyonu) membran-protein yapısının ve işlevinin temel birimi olarak önerilmiştir11. Lipid-protein etkileşimlerinin önemine rağmen, şu anda mevcut olan yapı tabanlı PPI belirleme teknikleri genellikle çalışılan proteinlerin çözünür olmasını veya deterjanlarla çözünür olmasını gerektirir. Sert deterjanlara maruz kalmak proteinleri denatüre edebilir veya toplama, proteinin denatürasyonu, yaygın olmayan etkileşimlerin ayrışması ve yapay oligomerik durumların oluşumuna neden olabilen delipidasyon nedeniyle yanlış pozitif ve negatiflere neden olabilir. Membran proteinlerinin doğal oligomerik durumunun doğru tespiti için doğal bir lipit ortamının korunmasının gerekliliği nedeniyle, daha önce bildirilen Stiren Maleik Asit Lipid Parçacıkları (SMALP)13 yöntemine dayanan bir Native Cell Membrane Nanopartiküls sistemi (NCMNs)12 geliştirdik.

SMALP, membran proteinlerini ayıklamak ve çözündürmek için membran aktif polimer olarak stiren maleik asit kopolölçer kullanır. Poli(Stiren-ko-Maleik Asit) (SMA), hidrofobik stiren moiety ve diyametrik olarak hidrofilik maleik asit moiety'ye karşı olması nedeniyle benzersiz bir amfifilik polimerdir. pH'a bağımlı bir mekanizmada hücre zarını adsorbe ederek, istikrarsızlaştırarak ve bozarak nanopartiküller oluşturur14. SMA'nın bu fonksiyonel aktivitesi, membran protein ekstraksiyonu ve çözünürleştirme için deterjansız bir sistem olarak kullanılmasına izin veren şeydir. NCMN sistemi çeşitli yönlerden SMALP sisteminden farklıdır. NCMN sisteminin en benzersiz özelliği, stabilite ve doğal işleyiş için farklı koşullar gerektiren birçok farklı membran proteininin izolasyonuna uygun hale getiren benzersiz özelliklere sahip çok sayıda polimere sahip bir membran aktif polimer kütüphanesine sahip olmasıdır. NCMN sistemi, nanopartiküllerin hazırlanması söz konusu olduğunda SMALP yöntemine kıyasla farklı protokollere de sahiptir. Bu örneklerden biri, NCMN'lerin yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için tek adımlı nikel benzeşim sütunu saflaştırması kullanmasıdır; Bu farklı protokollerin etkisi, 3.2 ve 3.0 şcryo-EM AcrB yapıları oluşturan NCMNs protokolü ile SMALP yöntemini kullanan benzer bir çalışma karşılaştırıldığında gözlenebilir, bu da 8.8 şçözünürlük12,15'te bir cryo-EM AcrB yapısı ile sonuçlandı. NCMN sisteminin bu benzersiz özellikleri, daha önce kurulan SMALP yönteminde yapılan iyileştirmelerdir ve PPI'lerin incelenmesi için ideal bir aday haline getirmektedir.

Multidrug efflux transporter AcrB, E. coli12'defonksiyonel homotrimer olarak mevcuttur. Bir mutajenik analiz, AcrB trimerinin stabilitesinden sorumlu bir döngü üzerinde bulunan tek bir P223G nokta mutasyonunun, trimer durumunu istikrarsızlaştırdığını ve yerel mavi jel elektroforezi16ile tespit edilebilen deterjan DDM ile hazırlandığında bir AcrB monomer verdiğini öne sürdü. Bununla birlikte, AcrB-P223G mutantının FRET analizi, yerel hücre zarı lipid bilayer ortamındayken, mutant AcrB-P223G'nin çoğunluğunun hala bir trimer olarak var olduğunu ve hem vahşi tip AcrB hem de AcrB-P223G için ifade seviyelerinin benzer olduğunu öne sürdü. Yine de FRET analiz sonuçlarına rağmen, mutant taşıyıcı için bir aktivite tahlili, vahşi tip16ile karşılaştırıldığında aktivitenin önemli ölçüde azaldığını gösterdi. FRET teknolojisi protein-protein etkileşimlerinin analizi için popüler olarak kullanılmış olsa da, araştırmalar sıklıkla yanlış pozitifler verebileceğini göstermiştir17,18,19,20.

Son zamanlarda, AcrB trimerinin yüksek çözünürlüklü kriyo-EM yapıları, NCMNs12kullanılarak AcrB'nin ilişkili doğal hücre zarı lipid bilayer ile etkileşimini gösteren belirlendi. Prensip olarak, NCMN'ler doğal hücre zarında bulunan protein-protein etkileşimlerinin analizi için kolayca kullanılabilir. Bu sistemin bir testinde, yerel hücre zarı nanopartikülleri ve negatif boyama elektron mikroskopisi kullanılarak AcrB-P223G'nin oligomerik durumunu doğrudan gözlemlemek için deneyler yapıldı. Vahşi tip AcrB nanopartikülleri ile karşılaştırmak için, NCMNs kütüphanesinde bulunan AcrB ve alternatif polimerlerin yüksek çözünürlüklü kriyo-EM yapısının belirlenmesi için kullanılan aynı membran aktif polimerini (NCMN kütüphanesinde NCMNP1-1 olarak indekslenen laboratuvarımızda yapılan SMA2000)kullandık. Daha önce bildirilen sonuçlara dayanarak, AcrB-P223G mutantının çoğunluğunun trimerik yerel hücre zarı nanopartikülleri21şeklinde var olması bekleniyordu. Bununla birlikte, vahşi tip AcrB ile gözlenenler gibi örnekte hiçbir AcrB trimer bulunamadı. Bu, AcrB-P223G'nin çoğunluğunun daha önce önerildiği gibi yerel hücre zarında trimer oluşturmadığını göstermektedir.

Burada, NCMN'leri kullanan vahşi E. coli AcrB tipi ile karşılaştırıldığında mutant E. coli AcrB-P223G'nin ayrıntılı bir analizini rapor ediyoruz. AcrB'nin bu vaka çalışması, NCMN'lerin protein-protein etkileşim analizi için iyi bir sistem olduğunu göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Protein ifadesi

  1. 37 °C'de bir gecede 50 mL tüplerde plazmidleri ifade eden AcrB'yi içeren BL21(DE3) pLysS hücreleri ile plazmidlere özgü antibiyotiklerle 15 mL Müthiş Et Suyu (TB) medyasını 250 rpm'de sallayarak aşıla.
  2. Geceleme kültürünün optik yoğunluğunu 600 nm 'de (OD600)kontrol edin ve 2,0'ın üzerinde olduğundan emin olun.
  3. 5 mL hücre kültürünü plazmidlere özgü antibiyotikler içeren 1 L TB ortama seyreltin ve OD600 =0.8'ekadar sallanarak 37 °C'de kuluçkaya yatın ve ardından 1 mM'lik son konsantrasyona sahip IPTG ile indüklenin.
  4. 20 °C'de 20 saat boyunca sallanarak indüksiyon gerçekleştirin.
  5. 4 °C ve 4.000 x g'da 15 dakika santrifüjleme kullanarak hücreleri aşağı pelet.

2. Hücre lizisi ve membran izolasyonu

  1. Hücre peletinin her 20 g'ı için 80 mL kullanarak hücre peletini A Tamponunda(Tablo 1, izlenecek saflaştırma şemasına bağlı olarak DDM Buffer A veya NCMNs Buffer A kullanın) yeniden kullanın.
  2. 4 °C'de bir cam Dounce homojenizatör kullanarak veya oda sıcaklığında hemen sonra buza koyduğunuzdan emin olun.
  3. Numuneyi buz üzerinde metal bir behere aktarın ve hücreleri 4 °C ve 1.500 bar'da yüksek basınçlı bir homojenizatöre yükleyerek ıslatın.
    1. Hücreleri homojenizatöre yükleme işlemini tekrarlayın ve homojenizatörden 3-4 döngü boyunca veya lysate netleştirmeye başlayana kadar geçmelerine izin verin.
  4. 4 °C'de 30 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüj.
  5. Süpernatantı toplayın ve 4 °C'de 1 saat boyunca 215.000 x g'da ultracentrifuge tüplere ve santrifüje yükleyin.
  6. Süpernatantı atın ve membran topaklarını ultracentrifuge tüplerinden toplayın. Fazla membran peletini -80 °C'de saklayın.

3. Yerli hücre zarı nanopartiküllerinin hazırlanması

  1. 10 mL NCMNs Tampon A'da 1 g membran peletini yeniden sunun (Tablo 1).
  2. Yeniden canlanan hücre zarı örneğini 20 °C'de cam dounce homojenizatör ile homojenize edin.
  3. Askıya alınan membran örneğini 50 mL polipropilen tüpe aktarın ve numuneyi% 2,5 (w/v) membran aktif polimer (NCMNP1-1 veya NCMNP5-2) nihai konsantrasyonuna getirmek için membran aktif polimerler stok çözeltisi ve ek NCMNs Tampon A ekleyin.
    NOT: Membran aktif polimerlerin stok çözeltileri çift damıtılmış suda yapılmalı ve değişen konsantrasyonlarda tutulabilir, ancak tipik olarak% 10 (w/ v).
  4. Numuneyi 20 °C'de 2 saat sallayın.
  5. Numuneyi ultrasantrifüje yükleyin ve 20 °C'de 1 saat boyunca 150.000 x g'da döndürün.
  6. Numune ultra santrifüjlenirken, 25 mL NCMNs Buffer A ile 5 mL Ni-NTA sütununu dengelemeye başlayın.
  7. Ultrasantrifüj tamamlandıktan sonra süpernatantı toplayın ve bir şırınna pompası kullanarak 0,5 mL / dk akış hızı ile oda sıcaklığında 5 mL Ni-NTA sütununa yükleyin.
  8. Sistemi tamamen yıkamak ve ardından sütunu FPLC makinesine bağlamak için hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) hatlarını yeterli NCMNs Buffer B(Tablo 1)ile yıkayın.
  9. Sütunu 30 mL NCMNs Buffer B ile 1 mL/dk akış hızıyla yıkayın ve akışı toplayın.
  10. Sütunu 30 mL NCMNs Buffer C (Tablo 1) ile 1 mL / dk akış hızı ile yıkayın ve akışı toplayın.
  11. Proteini 20 mL NCMNs Buffer D (Tablo 1) ile 0,5 mL / dk akış hızında elute edin ve bir kesir toplayıcı ve her biri 1,0 mL olarak ayarlanan fraksiyonları kullanarak numuneyi toplayın.
  12. Protein örneklerini 4 °C'de saklayın.
  13. FPLC elution grafiğinde gözlenen tepelere karşılık gelen örnekleri kontrol etmek için bir SDS-PAGE jel elektroforezi tahlili çalıştırın.

4. SDS-PAGE jel elektroforez

  1. Camı döküm aparatına kenetleyerek döküm haznesini hazırlayın.
  2. %12'lik ayırma jelini Tablo 1'delistelenen tarife göre hazırlayın.
    NOT: TEMED eklendikten sonra jel hızlı bir şekilde polimerize olur, bu nedenle jeli dökmeye hazır olduğunda bunu ekleyin.
  3. İstifleme jeli için tarağın altında 2 cm bırakarak jeli dökün.
  4. Jelin üst kısmını% 100 izopropanol ile katmanlayarak kabarcıkları çıkarın ve ayırma jelinin polimerize olmasını bekleyin.
  5. İzopropanol'i çıkarın ve izopropanol izlerini damıtılmış suyla yıkayın.
  6. İstifleme jelini Tablo 1'de listelenen tarife göre hazırlayın.
    NOT: TEMED eklendikten sonra jel hızlı bir şekilde polimerize olur, bu nedenle jeli dökmeye hazır olduğunda bunu ekleyin.
  7. İstifleme jelini ayırma jelinin üzerine dökün.
  8. Kuyuları oluşturmak için odaya bir tarak ekleyin ve istifleme jelinin tamamen polimerize olmasını bekleyin.
  9. Jel üzerinde çalıştırılması gereken her fraksiyon örneği için bir mikrosantrifüj tüpüne 1 μL 1 M DTT yerleştirin.
  10. Her tüpe 7 μL 4x yükleme tamponu da ekleyin.
  11. Her mikrosantrifüj tüpüne jel üzerinde çalıştırılması gereken fraksiyonlardan 20 μL numune ekleyin.
  12. Örnekleri içeren tüpleri girdapla.
  13. 3 s için bir masa üstü mikrosantrifüj kullanarak numune tüplerini aşağı çevirin ve tüm numunenin tüplerin dibine döndüğünden emin olun.
  14. %12 poliakrilamid jel kaseti yerine sabitleyerek ve hücrenin iç ve dış odalarını Tris-asetat-EDTA (TAE) Tamponu (Tablo 1)ile doldurarak jel elektroforez hücresini hazırlayın.
  15. Moleküler ağırlık işaretleyicisini, talimatlarının gerektirdiği uygun hacimle jelin ilk şeridine yükleyin.
  16. DTT ve yükleme tamponu ile karıştırılan her tüpten numunenin 28 μL'sini yükleyin.
  17. Elektroforez hücresinin kapağını kutunun üzerine yerleştirin ve kapağı güç kaynağına takın.
  18. Güç kaynağını açın ve 100 V'a ayarlayın ve 20 dakika çalışmasına izin verin.
  19. 20 dakika sonra, güç kaynağını 140 V'a çıkarın ve 30-40 dakika daha veya yükleme tampon boyası bandı jel kasetin altına ulaşana kadar çalıştırmaya devam edin.
  20. Elektroforez lekesini tamamladıktan ve jelin içindeki protein bantlarını görselleştirmek için jeli lekeden arındırdıktan sonra.

5. DDM kullanarak protein saflaştırma

NOT: Bu saflaştırma işlemini gerçekleştirmenin amacı, membran aktif polimerlerini kullanan deneyler için bir kontrol görevi görmektir.

  1. 6-10 g membran peletini, adım 2.6'dan, DDM Buffer A'da (Tablo 1) 5 mL / g membran pelet kullanarak yeniden atın.
  2. Yeniden canlanan numuneyi 4 °C'de bir cam Dounce homojenizatör ile homojenize edin veya oda sıcaklığında hemen sonra buza koyduğunuzdan emin olun.
  3. Numuneyi 50 mL polipropilen tüpe aktarın ve numuneyi% 2 DDM'lik son konsantrasyona getirmek için DDM ve ek DDM Tampon A ekleyin.
  4. Numuneyi 4 °C'de 2 saat sallayın.
  5. Numuneyi ultracentrifuge tüplerine yükleyin ve 4 °C ve 150.000 x g'da 1 saat boyunca santrifüj içine yükleyin.
  6. Numune ultra santrifüjlenirken, 25 mL DDM Buffer A (Tablo 1)ile yıkanarak 5 mL Ni-NTA sütununu hazırlamaya başlayın.
  7. Ultrasantrifüjleme tamamlandıktan sonra, süpernatantı toplayın ve şırınna pompası kullanarak 0,5 mL/ dk akış hızı ile 4 °C'deki 5 mL Ni-NTA sütununa yükleyin.
  8. Sistemi tamamen yıkamak için FPLC hatlarını yeterli DDM Buffer B + %0,05 DDM(Tablo 1)ile yıkayın ve ardından sütunu FPLC makinesine takın.
  9. Sütunu 30 mL DDM Buffer B + %0,05 DDM ile 1 mL/dk akış hızıyla yıkayın ve akışı toplayın.
  10. Sütunu 30 mL DDM Buffer C + %0,05 DDM(Tablo 1)ile 1 mL/dk akış hızıyla yıkayın ve akışı toplayın.
  11. Proteini 20 mL DDM Buffer D + %0,05 DDM(Tablo 1)ile 0,5 mL/dk akış hızında elute edin ve akışı bir kesir toplayıcı ve her biri 1,0 mL olarak ayarlanan kesirler kullanarak toplayın.
  12. 500 μL'ye ulaşana kadar 4.000 x g ve 4 °C'de santrifüjleme kullanarak havuzlama ve konsantre etme için elution tepesini içeren kesirleri seçin.
  13. 500 μL döngü kullanarak numuneyi FPLC makinesine ve ardından 4 °C'deki 25 mL boyutu dışlama sütununa yükleyin. 0,5 mL/dk akış hızında 30 mL DDM Buffer E + %0,05 DDM (Tablo 1)kullanarak elute edin ve kesir boyutları kesir başına 0,5 mL olarak ayarlanmış kesirler olarak toplayın.
  14. FPLC elution grafiğinden UV-Vis eğrisini doğrulamak için fraksiyonları alın ve 280 nm emici kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.
  15. FPLC elution grafiğinde gözlenen zirvelere karşılık gelen ve absorbans testi ile doğru olduğu doğrulanan her örnek fraksiyondan 20 μL toplayın.
  16. İstenilen aliquotlarda sıvı azot veya kuru buz kullanarak bu numune fraksiyonlarının geri kalanını dondurun ve protein örneklerini -80 °C'de saklayın.
  17. FPLC elution grafiğinde gözlemlenen tepelere karşılık gelen örnekleri kontrol etmek için daha önce açıklandığı gibi bir SDS-PAGE jel elektroforezi tahlili çalıştırın.

6. Negatif leke ızgarası hazırlığı

  1. Numune hazırlama için kullanılacak ızgaraları, karbon tarafı yukarı bakacak şekilde filtre kağıdına sarılmış bir cam kaydırağa yerleştirin.
  2. Elektron mikroskop ızgaraları ile cam kaydırağı iki elektrot arasındaki bir kızdırma deşarj odasına yerleştirin ve cam kapağı ortalanmış ve iyi kapatılmış olduğundan emin olarak değiştirin.
  3. Işıma boşaltma makinesini çalıştırın ve plazma tarafından üretilen mor ışığın görünür olduğundan emin olun.
  4. Makinenin çalışması bittiğinde, cam kapağı çıkarmak için oda atmosferik basınca ulaşana kadar bekleyin ve ardından ızgaralarla birlikte slaytı numunelerin yüklendiği tezgaha geri verin.
  5. Numuneyi uygun tamponla seyrelterek veya bir santrifüj konsantratörü kullanarak konsantre ederek saflaştırılmış protein örneklerinin konsantrasyonu yaklaşık 0,1 mg/mL'ye ayarlayın.
  6. 10 nm kalınlığındaki karbon ızgarasına 3,5 μL protein örneği yükleyin ve 1 dakika bekleyin.
  7. Sıvıyı bir filtre kağıdı ile EM ızgarasının yüzeyinden çıkarın.
  8. Izgara ile 3 μL su damlacıkları toplayarak ve her damlacığın toplanması arasında filtre kağıdı ile suyu ızgaradan çıkararak ızgara yüzeyini 3x yıkayın.
  9. 3 μL'lik taze damlacık, filtrelenmiş %2 uranyum asetat toplayarak ızgara yüzeyini 2x yıkayın ve her damlacığın toplanması arasında ızgaradaki yıkama çözeltilerini filtre kağıdı ile çıkarın.
  10. Izgarayı 1 dakika boyunca 3 μL taze, filtrelenmiş% 2 uranyum asetat damlası ile lekeleyin.
  11. EM ızgarasının yüzeyindeki uranyum asetat çözeltisini filtre kağıdı ile çıkarın ve ızgarayı en az 1 dakika kurutun.
  12. Izgarayı daha sonra kullanmak üzere bir kılavuz kutusunda saklayın.

7. EM görüntüleme

  1. Hazırlanan ızgarayı güvenli bir tezgahta ızgara tutucusuna yükleyin.
  2. Mikroskopları bir polistiren kutusuna yerleştirerek mikroskobu hazırlayın ve dewar 3/4'ü sıvı nitrojenle doldurun.
  3. Mikroskop penceresinin kauçuk kapağının kapladığını onaylayın ve ardından bakır telleri platforma sığana kadar dewar'a yerleştirerek dewar'ı mikroskopa yükleyin.
  4. Dewar'ın geri kalanını sıvı nitrojenle doldurun ve örtmek için dewar'ın üzerine bir kapak yerleştirin.
  5. Yüksek gerilimi açın, mikroskobu koşullayın ve mikroskobun ısınmasını bekleyin ve kullanım için güvenli bir vakum seviyesi oluşturun.
  6. Mikroskop hazır olduğunda kolon vanasını açın ve mikroskop penceresindeki kauçuk kapağı çıkararak kirişin mevcut olduğunu onaylayın.
  7. Işın yoğunluğunu ayarlayarak içeri ve dışarı yayılarak ışın damgalamayı kontrol edin. Astigmatizma mevcutsa, ışın çaprazdan uzaklaştıkça eliptik bir şekle sahip olacaktır ve ışın her iki tarafta da aynı oval şekil olmalıdır.
  8. Mikroskop dürbünü gözlemcinin gözlerine göre doğru yükseklik ve mesafe olacak şekilde ayarlayın.
  9. Işın her birinde ortalanana kadar üç modda da bisiklete binerek Arama, Odakve Pozlama modları için ışın konumlandırmasını kontrol edin.
  10. Sütun vanasını kapatın ve ızgara tutucuyu elektron mikroskobuna yüklemeye devam edin.
  11. Mikroskop sallayıcı özelliğini kullanarak ve numunenin merkezde yan yana hareketi olmayana kadar Z eksenini kullanarak sahnenin hareketini ayarlayarak mikroskobu ösantrik yüksekliğe ayarlayın.
  12. Mikroskopta düşük doz Arama modunu kullanarak, numuneye odaklanmak için mevcut örnek moleküllerle makul kontrastta arzu edilen bir alan için ızgarayı arayın.
  13. Örnek görülene kadar yüksek adım boyutu kullanarak Odak modunda örneğe odaklanın ve ardından doğru odak düzeyini bulmak için adımları azaltın.
  14. Işını sıfırla ve boşalt ve sonra kauçuk pedin mikroskop penceresini kapladığını unutma.
  15. Pozlama modunu kullanarak, 62.000x büyütmede 1 s pozlama için istenen ızgara alanının görüntüsünü alın ve elde edilen görüntüyü kontrol edin.
  16. Bir ızgara görüntülemeyi bitirdiğinizde sütun vanalarını kapatın ve ızgara tutucuyu sütundan çıkarın.
  17. Tüm ilgi ızgaralarını görüntülemeyi bitirdiğinizde, filament gücünü kapatarak ve sıvı azot dewar'ı mikroskoptan çıkararak mikroskobu kapatın.
  18. Mikroskobun bakır bobinlerinden yoğuşma yakalamak için dewar'ın oturduğu standa nemi emecek bir şey yerleştirin.
  19. Cryo Cycle modunu etkinleştirin ve turbo pompanın kapalı olduğundan emin olun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan prosedürler kullanılarak, E. coli AcrB vahşi tipi ve E. coli mutant AcrB-P223G örnekleri saflaştırılmıştır. Numuneler daha sonra karbon negatif leke elektron mikroskopi ızgaralarına adsorbe edildi ve yan blotting yöntemi ile uranil asetat kullanılarak lekelendi22. Negatif leke görüntüleri iletim elektron mikroskopisi kullanılarak toplandı. DDM ile saflaştırılmış AcrB vahşi tip numunesi için negatif leke görüntüsü, iyi tanımlanmış bir trimerik kuaderik yapı gösteren...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein-protein etkileşimleri membran proteinlerinin yapısının ve işlevinin bütünlüğü için önemlidir. Protein-protein etkileşimlerini araştırmak için birçok yaklaşım geliştirilmiştir. Çözünür proteinlerle karşılaştırıldığında, membran proteinlerinin benzersiz içsel özellikleri nedeniyle membran proteinlerinin ve PPI'larının incelenmesi daha zordur. Bu zorluk esas olarak membran proteinlerinin yapısal stabilite ve işlevsellik için yerel bir lipid bilayer ortamına gömülmesi gereksiniminden gelir. Bu sorunlu hale gelir, çün...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Y.G, membran aktif polimer NCMNP5-2 ve NCMN sisteminin mucidi olarak listelenmiştir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, VCU başlangıç fonu (Y.G.'ye) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından R01GM132329 Ödül Numarası altında (Y.G.'ye) desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Montserrat Samso ve Kevin McRoberts'e video kaydına verdikleri cömert destek için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kimyasallar< / güçlü>
% 30 Akrilamid/BIS SOL (37.5:1)Bio-Rad161-0158
4x Laemmli Numune Tamponu (Yükleme Tamponu)Bio-Rad1610747
Asetik Asit BuzulThermoFisher ScientificA38S-212
Amonyum Persülfat (APS)Bio-Rad161-0700
KloramfenikolGoldbioC-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 protein lekesi tozuBio-Rad161-0400
DTT (Dithiothreitol) (> %99 saf) Proteaz içermeyenGoldbioDTT10
GliserolThermoFisher ScientificG33-4
HEPESThermoFisher ScientificBP310-1
İmidazolAffymetrix17525 1 KG
IPTGGoldbioI2481C100
KanamisinGoldbioK-120-25
Magnezyum klorür hekzahidratThermoFisher ScientificAA3622636
MetanolThermoFisher ScientificA412-4
N,N-dimetiletilendiamin (EDTA)Merck8.03779.0100
NCMNS-P5-2Henüz ticari olarak mevcut değilSorumlu yazara
Precision Plus Protein Çift Renk StandardıBio-Rad161-0374
SDS (Sodyum Dodesil Sülfat)Bio-Rad161-0301
SMA2000Cray ValleySorumlu yazara
Sodyum KlorürThermoFisher ScientificS271-10
TCEP-HClGoldbioTCEP25
TEMEDBio-Rad161-0800
Müthiş Et Suyu OrtamıAffymetrix75856 1 KG
Tris BazBio-Rad161-0719
Uranil AsetatAmbinterAMB22348393
Ekipman< / güçlü >
Avanti J-26S XPIBeckman CoulterB14538
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Karbon Elektron Mikroskobu Izgaraları (10 nm)ElektronMikroskobu BilimleriCF300-Cu-TH
Kon-Tork Doku HomojenizatörEberbachE7265
Corning LSE Mini MikrosantrifüjThermoFisher Scientific07-203-954
EmulsiFlex-C3Avestin
Fraksiyon Toplayıcı F9-RGE Sağlık Yaşam Bilimleri29003875
Mini-PROTEAN Tetra Dikey Elektroforez HücresiBio-Rad165-8004
NanoDrop 2000 SpektrofotometreThermoFisher ScientificND-2000
Optima L-90K UltrasantrifüjBeckman CoulterPN LL-IM-12AB
PELCO easiGlow Kızdırma Deşarj Temizleme SistemiTed Pella91000S-230
Potter-Elvehjem Güvenli Öğütme Doku ÖğütücüWheaton358013
PowerPac Temel Güç KaynağıBio-Rad164-5050
Razel R99-E Değişken Hızlı Şırınga PompasıRazel Scientific Instruments
Superdex 200 Artış 10/300 GLGE Sağlık Yaşam Bilimleri28990944
Tecnai F20 200kVFEI
Tip 70 Ti Sabit Açılı RotorBeckman Coulter
Genel Malzemeler
1.5 ml Mikrosantrifüj TüpleriThermoFisher Scientific05-408-129
4 ml Amicon Ultra-4 30 kDaMillipore SigmaUFC803024
AKTA saf 25 L1 FPLCGE Sağlık Yaşam Bilimleri29018225
BL21(DE3)pLysS HücreleriThermoFisher ScientificC606003
Falcon 50 ml Konik Santrifüj TüpüThermoFisher Scientific14-959-49A
HisTrap HP 5 ml SütunuGE Sağlık Yaşam Bilimleri17524802
pET-24aEMD Biosciences69749-3
edinme talebini gönderin edinme talebini gönderin

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
  3. Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
  4. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
  5. Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
  6. Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
  7. Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
  8. Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50(2009).
  9. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
  10. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  11. Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
  12. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  13. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  14. Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
  15. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
  16. Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390(2011).
  17. Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
  18. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  19. Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
  20. Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
  21. Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
  22. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199(2018).
  23. Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
  24. Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
  25. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087(2014).
  26. Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
  27. Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
  28. Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Membrane Protein InteractionsElectron Microscopy AnalysisOligomeric State DeterminationMembrane Active PolymerNickel NTA ChromatographyNegative Stain GridsSize Exclusion ChromatographySDS PAGE AnalysisCryo Electron Microscopy

İlgili makaleler