Burada sunulan, insan böbrek podositlerinin yüksek verimli (%>90) ve genetik manipülasyonlardan veya alt popülasyon seçiminden bağımsız olarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetülmesi için kimyasal olarak tanımlanmış bir protokoldür. Bu protokol 26 gün içinde istenen hücre tipini üretir ve nefrotoksisite testi ve hastalık modellemesi için yararlı olabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Olgun Böbrek Podositlerinin Kimyasal Olarak Tanımlanmış Koşullar Altında İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Rehberli Farklılaşması
Bu makalede
Özet
Özet
Böbrek hastalığı küresel nüfusun % 10'undan fazlasını etkiler ve federal harcamalarda milyarlarca dolara mal olur. Böbrek hastalığının en şiddetli formları ve nihai son aşama böbrek yetmezliği, genellikle endotel hücreleri ve böbreğin filtrasyon bariyerini oluşturmak için glomerüler bodrum zarı ile birlikte çalışan son derece uzmanlaşmış epitel hücreleri olan glomerüler podositlerin hasar görmesinden kaynaklanır. Böbrek tıbbındaki gelişmeler, birincil dokuların sınırlı mevcudiyeti ve podositler gibi fonksiyonel insan böbrek hücrelerinin türemesi için sağlam yöntemlerin bulunmaması nedeniyle engellenmiştir. Kök hücreler gibi yenilenebilir kaynaklardan podosit türetme yeteneği, insan böbrek gelişimi ve hastalığının mekanizmalarının mevcut olarak anlaşılmasına yardımcı olabileceği gibi terapötik keşif için yeni araçlar sağlayabilir. Bu protokolün amacı, insan kaynaklı pluripotent sap (hiPS) hücrelerinden yüksek verimlilik ve özgüllükle ve kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında olgun, post-mitotik podositler elde etmek için bir yöntem geliştirmekti. Bu yöntemle üretilen hiPS hücre türevi podositler, soyuna özgü belirteçleri (nefrin, podokin ve Wilm Tümörü 1 dahil) ifade eder ve olgun ve fonksiyonel podositlerle ilişkili özel morfolojik özellikleri (birincil ve ikincil ayak süreçleri dahil) sergiler. İlginç bir şekilde, bu özel özellikler, alanda yaygın olarak kullanılan ölümsüzleştirilmiş podosit hücre hattında özellikle yoktur, bu da burada açıklanan protokolün, tipik olarak insan böbrek biyolojisini incelemek için kullanılan mevcut podosit hücre çizgilerinden gelişimsel olarak daha olgun bir fenotipe sahip insan böbrek podositleri ürettiğini göstermektedir.
Giriş
İnsan pluripotent kök hücre kültüründeki gelişmeler, araştırmacılara insan vücudundaki hemen hemen her hücre tipini elde etmek için tasarlanmış yenilenebilir, ölçeklenebilir bir biyolojik malzeme kaynağı sağlayarak rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve ilaç taramasında devrim yapmayahazırdır 1. Bu strateji, özellikle elde edilmesi zor olan özel ve işlevsel hücre türlerini türetmek için yararlıdır. İnsan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücreleri2,3,4,5, somatik hücre kökenleri ve kişiselleştirilmiş tıp için temsil ettikleri potansiyel nedeniyle özellikle çekicidir. Bununla birlikte, hiPS hücrelerinden diğer hücre soylarını türetmek için yöntemler geliştirmek, düşük verimliliğe ve spesifik olmayan heterojen hücre popülasyonlarının üretilmesine yol açan kötü tanımlanmış kültür koşullarının sık kullanımı nedeniyle zor olmaya devam etmektedir6,7.
Burada sunulan, kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında spesifiklik ve yüksek verimlilik ile hiPS hücrelerinden olgun böbrek podositlerinin türetilme yöntemidir. Hücresel mikroçevrim içindeki birden fazla faktörün rolleri göz önünde bulundurularak, hücre kültürü ortamında sunulan çözünür faktörlerin yanı sıra hücre dışı matris bileşenleri veya yapışkan substratlar gibi çözünmeyen faktörlerin optimizasyonunu içeren bir kök hücre farklılaşma stratejisi geliştirilmiştir. Podosit gelişiminde ve fonksiyonunda integrin sinyalinin önemi göz önüne alındığında, hücre yüzeyindeki integrin reseptörlerinin ekspresyolü ilk başta incelenmiştir. β1 integrinleri sadece hiPS hücrelerinde değil, mezoderm ve ara mezoderm hücreleri8, 9,10dahil olmak üzere türevlerinde de yüksek oranda ifade edildi. Sonraki deneyler, β1 integrinlerine bağlanan ligandların (laminin 511 veya laminin 511-E8 parçası dahil) aşağıda açıklanan çözünür endüktif ortamla birlikte kullanıldığında hiPS hücrelerinin yapışmasını ve podositlere farklılaştırılmasını desteklediğini doğruladı.
Hücre soyu taahhüdünün indüksiyonu, ilk olarak Activin A, CHIR99021 ve Y27632 Kaya inhibitörü içeren bir ortamın varlığında iki gün boyunca laminin kaplı yüzeylerde kültürlenen hiPS hücrelerinin erken mezoderm belirteçlerini ifade eden hücrelere farklılaşabileceğini doğrulayarak başlatıldı HAND1, kazkötü ve brachyury8,11. Mezoderm hücrelerinin kemik morfogenetik protein 7 (BMP-7) ve CHIR99021 ile desteklenmiş bir ortamla 14 gün boyunca tedavisi, nefi ifade eden ara mezoderm hücrelerinin türetilmesini sağladı kron-progenitör hücre belirteçleri Wilm's Tumor 1 (WT1), tek atlanan ilişkili protein 1 (OSR1)8,11ve eşleştirilmiş kutu gen 2 proteini (PAX2)12. Olgun böbrek glomerüler podositleri türetmek için, ara mezoderm hücreleri BMP-7, Activin A, vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF),all-trans retinoik asit ve CHIR99021'den oluşan yeni bir ortamla 4-5 gün boyunca tedavi edildi. Akış sitometrisi ve immünostaining, elde edilen hücrelerin% > 90'ının olgun böbrek podosit 8 , 11,13'ünmoleküler, morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini sergilediğini doğrulamak için kullanılmıştır. Bu özellikler birincil ve ikincil ayak süreçlerinin gelişimini içerir; SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 dahil olmak üzere podosit soyuna özgü genlerin ekspresyolü ve podocin, nefrin ve WT114, 15,16gibi proteinlerin ekspresyolü. Ek olarak, hiPS hücre türevi podositlerin, aşağı akış deneylerinin zamanlamasında ek bir esneklik sağlayan ticari olarak mevcut bir orta8,11 kullanılarak dört haftaya kadar in vitro olarak kültürde tutulabileceği bulunmuştur. HiPS-podositlerin saflığını belirlemek için kullanılan akış sitometri panelleri hakkında daha fazla bilgi için lütfen önceki yayınımıza bakın11.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Reaktiflerin hazırlanması
- 1x hiPS CCM çözeltisi elde etmek için hiPS hücre kültürü bazal ortamında çözülen 5x hiPS hücre kültürü ortamı (CCM) takviyesini seyreltin.
NOT: Dondurulmuş 5x hiPS CCM takviyesi, bir gecede ideal olarak 4 °C'de yavaş bir çözülme işlemi gerektirir. 1x hiPS CCM'nin aliquots'u -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir. - HiPS hücre kültürü için bodrum membran (BM) matrisi 1 kaplamalı plakaların hazırlanması: BM matrisi 1'i 4 °C'de buz üzerinde bir gecede çözün. Çözdükten sonra, üretici tarafından önerilen uygun seyreltme faktörlerine sahip aliquots hazırlayın.
NOT: Tipik olarak, aliquots, 50 mL konik bir tüpte 25 mL soğuk DMEM / F12'de sonraki seyreltme için hazırlanır ve ardından BM matrisi 1'i tamamen çözmek ve artık kristallerin oluşumunu önlemek için kapsamlı karıştırma. - BM matris 1 çözeltisinin 1 mL'lik kısmını 6 kuyu plakasının her kuyusuna aktarın ve parafin filmine sarılmış 1-2 saat boyunca 37 °C'de veya en az 24 saat boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın. BM matrisi 1 kaplamalı plakalar 2 haftaya kadar 4 °C'de saklanabilir.
- Bodrum membran (BM) matrisi 2 hazırlanması - kaplamalı plakalar: 5 μg / mL'lik son bir konsantrasyon hazırlamak için 9 mL steril damıtılmış suda uygun miktarda BM matrisi 2'yi seyreltin. 12 kuyu plakasının her kuyusuna 700 μL BM matris 2 çözeltisi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya bırakın.
- BMP7, Activin A ve VEGF'nin her biri için 100 μg/mL stok çözümlerini aşağıdaki gibi hazırlayın: BMP7'yi %0,1 (wt/vol) BSA içeren steril damıtılmış suda yeniden inşa edin ve %0,1 (wt/vol) BSA içeren steril PBS'de Activin A ve VEGF'yi ayrı ayrı yeniden inşa edin. Sık donma-çözülme döngülerini önlemek için, her stok çözeltisinden 100 μL aliquots hazırlayın ve 6 aya kadar -20 ° C'de saklayın.
- 10 mg Y27632'yi 3.079 mL steril damıtılmış suda eriterek 10 mM'lik bir Y27632 stok çözeltisi hazırlayın. Stoktan Aliquot 100 μL ve 6 aya kadar -20 °C'de saklayın.
- 30 mM stok çözeltisi hazırlamak için 2 mg CHIR99021'i 143,4 μL steril DMSO'da çözün. 5 μL aliquots hazırlayın ve -20 °C'de 1 aya kadar (veya üreticinin tavsiyesine göre) saklayın.
- 3.33 mL steril DMSO'da 10 mgall-trans retinoik asit çözün. 500 μL aliquot hazırlayın ve -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.
2. Kültür medyasının hazırlanması
- 100 ng/mL Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 ve 1x B27 serumsuz takviyenin glutamin takviyesi ile uygun bir DMEM/12 hacminde nihai konsantrasyonuna karşılık gelen stok çözümlerini yeniden oluşturan mezoderm farklılaşma ortamını hazırlayın.
NOT: Mezoderm farklılaşma ortamı, farklılaşma adımlarından önce ve deneyin ölçeğine uygun bir hacimde taze olarak hazırlanmalıdır (tipik olarak, iki 12 kuyu plakası için 50 mL ortam yeterlidir). - DMEM/F12'de 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 ve 1x B27 serumsuz takviyeye karşılık gelen stok çözümlerini glutamin takviyesi ile yeniden oluşturan ara mezoderm farklılaşma ortamını hazırlayın.
NOT: Gerekirse, ortam% 1 (vol/vol) Penisilin-Streptomisiin ile desteklenebilir. Glutamin takviyesi ile DMEM/F12 kullanarak ortamın hacmini ayarlayın. Bu ortam büyük gruplar halinde hazırlanabilir; bununla birlikte, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için daha küçük aliquotlarda (örneğin, 50 mL konik tüplerde 45 mL) saklanması önerilir. Bu ortam -20 °C'de 3 aya kadar saklanabilir ve kullanımdan önce bir gecede 4 °C'de çözülebilir. - Podosit indüksiyon ortamını son konsantrasyon 100 ng/mL BMP7'ye yeniden inşa larak hazırlayın, 100 ng/mL activin A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 serumsuz takviye ve glutamin takviyesi ile DMEM/F12'de 0.1 μM all-trans retinoik asit. Ortamı ışıktan koruyun (örneğin, kabı folyo kağıtla sararak).
NOT: Bu ortam büyük gruplar halinde hazırlanabilir ve karanlıkta -20 °C'de 3 aya kadar saklanabilir. Dondurulmuş aliquots kullanılmadan önce 4 °C'de bir gecede çözülmelidir. - DMEM/F12'ye %10 (vol/vol) ısı inaktive FBS ekleyerek 25 mL tripsin nötralize edici çözelti hazırlayın ve steril koşullarda filtreleyin.
- Kök hücre türevli podositlerin farklılaşma sonrası bakımı için, üreticinin yönergelerine göre bazal ortama takviye ekleyerek podosit bakım ortamı ile Komple Orta hazırlayın ve iki haftaya kadar 4 °C'de saklayın.
3. HiPS hücre kültürü ortamını kullanarak besleyici içermeyen hiPS hücre kültürü
- ÖNCEDEN kaplanmış plakalardan BM matrisi 1'in artık çözeltisini epire edin ve kuyuları 1 ila 2 mL ısıtılmış DMEM / F12 ile 3 kez yıkayın.
- Aspirat hiPS hücrelerinden hiPS CCM harcadı ve hücreleri ısıtılmış DMEM / F12 ile 3 kez durulayın. 1 mL sıcak hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve hücrelerin ayrıştırilmesine yardımcı olmak için 37 °C'de 1 dakika kuluçkaya yatırın. Bir doku kültürü mikroskobu altındaki hücrelerin görsel incelemesini gerçekleştirin ve hücre kolonilerinin kenarlarının yuvarlatılmış göründüğünden emin olun, ardından hücre deklasment çözeltisini hücrelerden hızlı bir şekilde epire edin (hücre kolonilerinin gevşek de olsa hala plakaya bağlı olmasını sağlayın). Hücre ayırma çözümünü çıkarmak için hücreleri DMEM/F12 ile bir kez hafifçe durulayın.
- Hücre müfrezesi çözeltisi ile tedavi edilen hiPS hücrelerine (6 kuyulu bir plakanın her kuyusunda) 3 mL hiPS CCM ekleyin. Bir hücre kaldırıcı kullanarak kolonileri kazıyın ve gevşek yapışmış hücreleri yerinden çıkarmak için hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı hafifçe pipet. Tüm hücrelerin toplanır emin olmak için plakayı iyice yıkayın.
NOT: Hücrelerde fazla makası önlemek için 5 mL pipet kullanılması önerilir. - Hücre süspansiyonunun 0,5 mL'lik kısmını, kuyu başına 2 mL hiPS CCM içeren yeni bir BM matrisi 1 kaplamalı 6 kuyu plakasının her kuyusuna aktarın. Hücre kolonilerini kuyulara dağıtmak ve % 5 CO2 inkübatörde 37 °C'de kuluçkaya yatmak için plakayı şekil sekiz şekilde hareket ettinin. Hücreler geçişe hazır olana veya farklılaşma deneyi için kullanılana kadar ortamı günlük olarak yenileyin (yaklaşık % 70 izdiah).
NOT: iPSC'lerin rutin geçişi için ideal koloni boyutu, hiPS CCM (ROCK inhibitörü olmadan) kullanılarak besleyici serbest koşullar altında 200-500 μm arasındadır. Hücreler ayrışma enzimleri veya tamponlar ile tedavi sırasında bireyselleştirilirse, hiPS CCM hücre canlılığını artırmak için ROCK inhibitörü (örneğin, 10 μM Y27632) ile desteklenebilir.
4. HiPS hücrelerinin mezoderm hücrelerine farklılaştırılması (gün 0-2)
- HiPS hücre kültürleri üstel büyüme aşamasındayken (yaklaşık olarak geçtikten sonra kültürden yaklaşık 4 gün sonra ve yaklaşık% 70 izdiah), kolonilerin kenarları içinde ve çevresinde kendiliğinden farklılaşmış hücrelerin varlığını görsel olarak inceleyin. Gerekirse, aseptik olarak farklılaşma alanlarını kazıyın.
- HiPS hücrelerinden hiPS CCM'yi aspire edin ve hücreleri ılık DMEM/F12 ile 3 kez durulayın. Hücreleri 37 °C'de 10 dakika boyunca 1 mL enzimsiz hücre ayrıştırma tamponu ile kuluçkaya yatırın ve mikroskop altında ayrışma olup olmadığını kontrol edin. Farklı hiPS hücre çizgileri arasındaki doğal farklılıklar nedeniyle, belirli bir hücre hattı için hücre ayrıştırma arabelleği için gerçek inkübasyon süresi belirlenmelidir.
- Gevşek yapışmış hücreleri yerinden çıkarmak ve hücre süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarmak için kuyuyu bir hücre kaldırıcı ile hafifçe kazıyın, ardından hiPS hücrelerini bireyselleştirmek için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme.
- Hücre süspansiyonu 15 mL ses seviyesine sıcak DMEM/F12 ve santrifüj ile oda sıcaklığında 290 x g'da 5 dakika boyunca getirin.
- Artık BM matrisi 1 ve ayrışma tampon bileşenlerini çıkarmak için hücreleri sıcak DMEM/F12 ile hafifçe emiş ve başka bir santrifüjleme turu için yeniden biriktirin.
- Yukarıda açıklandığı gibi, 1 mL mezoderm indüksiyon ortamında süpernatant ve resuspend hücrelerini aspire edin. 1 x 105 hücre/mL konsantrasyon elde etmek için gerekli olan uygun mezoderm farklılaşma ortamının hacmini belirlemek için hemositometre veya coulter sayacı kullanarak toplam hücre sayısını sayın.
- BM matrisi 2 kaplamalı plakalardan ECM solüsyonu aspire edin ve plakaları ılık DMEM/F12 ile iki kez durulayın. HiPS hücre süspansiyonu birkaç kez pipetleme ile hafifçe karıştırın. Hücre süspansiyonunun 1 mL'lik kısmını BM matrisi 2 kaplamalı 12 kuyu plakalarının her kuyusuna aktarın ve ardından hücreleri daha eşit dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın.
- Plakayı %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Ertesi gün mezoderm indüksiyon ortamını yenileyin.
NOT: 2 gün sonra hiPS hücre türevi mezoderm hücreleri ara mezoderm indüksiyonu için hazır olacaktır.
5. HiPS hücre türevi mezoderm hücrelerinin ara mezoderm haline farklılaşması (gün 2-16)
- Farklılaşma protokolünün 2. gününde mezoderm indüksiyon ortamını aspire edin ve kuyu başına 1 mL ara mezoderm indüksiyon ortamı ile yenilenin.
- Metabolik olarak aktif hücreler için doğru bir büyüme faktörleri ve küçük molekül eşiğini korumak için ortamı her gün yenileyin. Önemli miktarda hücre büyümesi ve medya besin maddelerinin hızlı tükenmesi varsa (ortamın sararması ile gösterilir), ara mezoderm farklılaşma ortamının hacmi 12 kuyu plakasının kuyusu başına 1,3 mL'ye yükseltilebilir.
- Ara mezoderm hücreleri elde etmek için ek 14 gün boyunca kültür hücreleri. 16. güne kadar, bu hücreler daha sonra kullanılmak üzere kriyoprezizasyon yapılabilir.
6. HiPS hücre türevi ara mezoderm hücrelerinin podositlere farklılaştırılması (16 ila 21 gün)
- Ara mezoderm hücrelerini ılık DMEM/F12 ile durulayın ve ardından 37 °C'de 3 dakika boyunca kuyu başına % 0,05 tripsin-EDTA başına 0,5 mL ile hücrelerin inkübasyonu. Hücrelerin ayrışmaya başladığından emin olmak için görsel inceleme gerçekleştirin.
- Hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri kazıyın ve hücre süspansiyonunu 1.000 μL pipet ucu kullanarak hücre süspansiyonunu birkaç kez kazıyın ve hücrelerin bireyselleştirilmiş (veya küçük kümelerini) elde edin.
NOT: Bu aşamada, toplanan hücreler protokolün zaman çizelgesi içinde ölümcül olarak farklılaştırılmış bir fenotip elde etmeyebileceğinden hücrelerin tamamen ayrıştığından emin olun. - Tripsin aktivitesini durdurmak için trypsin nötralize edici çözelti kuyusu başına yaklaşık 2 mL ekleyin.
- Hücreleri 50 mL konik bir tüpe aktarın ve DMEM/F12 kullanarak hacmi 50 mL'ye kadar getirin ve ardından hücre süspansiyonu oda sıcaklığında 201 x g'da 5 dakika santrifüjlayın.
- Podosit indüksiyon ortamındaki süpernatant ve resuspend hücrelerini epire edin. En iyi sonuçları elde etmek için, 12 kuyu plakasının yaklaşık 100.000 hücre/kuyusundan oluşan nihai bir tohumlama yoğunluğu sağlayın. Hücre süspansiyonu BM matrisi 2 kaplamalı plakalara ekleyin ve hücrelerin daha eşit dağıtılmasına yardımcı olmak için plakayı hafifçe sallayın.
- Hücreleri 37 °C ve% 5 CO 2'de kuluçkaya yatırın ve21.
NOT: Elde edilen hiPS hücre türevi podositler, podosit bakım ortamı ile tam ortam kullanılarak 2-4 hafta daha kültürde tutulabilir. Podosit bakım ortamına girdikten sonra, hücreler iki günde bir beslenebilir ve sonraki çalışmalar veya aşağı akış analizleri için kullanılabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolün amacı, olgun insan podositlerinin kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında hiPS hücrelerinden türetilebileceğini göstermekti. Bu yazıda sunulan veriler, ilk kez test edilen ve mikoplazma içermeyen DU11 hiPS hücre hattı17kullanılarak oluşturulmuştır. Kromozomal analiz de yapıldı ve hücrelerin karyotipik olarak normal olduğu tespit edildi. Farklılaşmamış DU11 hiPS hücrelerinden başlayarak, Bu raporda özetlenen farklılaşma stratejisi (Şekil 1) önce kök ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu raporda, hiPS hücrelerinden böbrek glomerüler podositlerin üretimi için bir protokol açıklıyoruz. HiPS hücre türevi podositler olgun böbrek podosit fenotipi ile ilişkili morfolojik ve moleküler özellikler sergiler13. Önceki yayınlarda, hiPS hücre türevi podositlerin, perf kullanılabilir bir mikroakışkan organ-on-a-chip cihazında glomerüler mikrovasküler endotel hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde böbrek glomerülüsünün yapısını ve seçici filtrasyon işlevini taklit edebildiğimizi gösterdik
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
S.M. pluripotent kök hücrelerden böbrek podositlerinin üretimi için yöntemler için bekleyen bir patent üzerine bir yazardır (ABD patent başvurusu 14/950859). Geri kalan yazarlar rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma Duke Üniversitesi Pratt Mühendislik Okulu, Duke Tıp Fakültesi Nefroloji Bölümü, Duke Üniversitesi Tıp Bölümü'nden Bir Sandalye Araştırma Ödülü ve S.M.'ye Burroughs Wellcome Fonu PDEP Kariyer Geçiş Geçici Ödülü tarafından desteklendi. M.B, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı tarafından desteklendi. Bize CÖMERTÇE DU11 kök hücre hattını sağladığı için Bursac Laboratuvarı'na ve Duke Üniversitesi'ndeki Varghese Laboratuvarı'na doku kültürü tesisini grubumuzla geçici olarak paylaştığı için teşekkür ederiz. Bu yayın, Massachusetts Teknoloji Enstitüsü Novartis Kimya Profesörü Prof. Laura L.Kiessling'e 60.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hücreler< / güçlü > | |||
| DU11 insan iPS hücreleri | DU11 (Duke Üniversitesi klonu # 11) iPS hücre hattı, Duke Üniversitesi iPSC Çekirdek Tesisinde üretildi ve bize Duke Üniversitesi'ndeki Bursac Laboratuvarı tarafından sağlandı. Bu çizgi mikoplazma için test edildi ve en son Temmuz 2019'da laboratuvarımız tarafından karyotiplendi ve karyotipik olarak normal olduğu bulundu. | ||
| Büyüme Faktörleri ve Medya Takviyeleri | |||
| All-trans retinoik asit (500 mg) | 72262 | Kök Hücre Teknolojileri | |
| B27 serumsuz takviye edici gıda | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | Partiden partiye varyasyon gösterebilir |
| CultureBoost-R | ile Komple Orta Boy Kiti4Z0-500-R | Hücre Sistemleri | Podosit bakım ortamı |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 GlutaMAX takviyeli | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 glutamin takviyeli |
| Isıyla İnaktive Edilmiş FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| İnsan aktivini A | PHC9564 | Thermo/Life Teknolojiler | |
| İnsan BMP7 | PHC9544 | Termo / Yaşam Teknolojileri | |
| İnsan VEGF | PHC9394 | Termo / Yaşam Teknolojileri | |
| mTeSR1 ortamı | 05850 | Kök Hücre Teknolojileri | hiPS hücre kültürü ortamı (CCM) |
| Penisilin ve ndash; Streptomisin, sıvı (100&�) | 15140-163 | Termo / Yaşam Teknolojileri | |
| Y27632 ROCK inhibitörü | 1254 | Tocris | |
| Antikorlar< / güçlü > | |||
| Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 594 (ndash); konjuge ikincil antikorlar | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Termo / Yaşam Teknolojileri | |
| Brachyury (T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R& D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molekülleri | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) parçası | N-892012 | Iwai Kuzey Amerika | Bodrum membranı (BM) matrisi 2 |
| Matrigel hESC nitelikli matris, 5 mL flakon | 354277 | BD Biyoloji | Bilimleri Temel membran (BM) matrisi 1. Partiden partiye varyasyon gösterebilir |
| Enzimler ve Diğer Reaktifler | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Hücre ayırma çözümü |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimetil Sülfoksit (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO toksiktir. Kimyasal güvenlik başlığında ele alınmalıdır |
| Enzim içermeyen hücre ayrışma tamponu, Hank' S Dengeli Tuz | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Etanol çözeltisi, %70 (hacim/hacim), biyoteknoloji sınıfı | 97065-058 | VWR | Etanol yanıcı ve toksiktir |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehit (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA, eldivenler, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlükler dahil olmak üzere uygun kişisel koruma ekipmanlarına sahip bir kimyasal çeker ocakta kullanılmalıdır. Solumaktan ve cilt ile temasından kaçının. |
| Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Steril Distile Su | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Tripsin-EDTA, %0,05 | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirasyonlu pipetler, ayrı ayrı sarılmış | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Santrifüj | B99516 | Beckman Coulter | |
| Konik santrifüj tüpü, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Konik santrifüj tüpü, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryobox'lar | 3395465 | Termo/Yaşam Teknolojileri | Dondurulmuş halde saklamak için aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Sabit ve lekeli iPS hücrelerinin ve türevlerinin görüntülerini elde etmek için kullanılan floresan mikroskobu |
| Hemositometre | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 inkübatörü | 51030403 | Thermo/Life Technologies | iPS hücrelerinin ve türevlerinin |
| rutin kültürü ve bakımı içinAxioCam 503 kamera ile donatılmış ters Zeiss Axio Observer | 491916-0001-000 (mikroskop); 426558-0000-000(kamera) | Carl Zeiss Mikroskobu | Podosit farklılaşmasının her aşamasında canlı iPS hücrelerinin ve türevlerinin faz kontrast görüntülerini elde etmek için kullanılır |
| Kimberly-Clark nitril eldivenler | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, büyük | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, küçük | 21905-026 | VWR | |
| P10 hassas bariyerli pipet uçları | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 bariyerli pipet uçları | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 bariyerli pipet uçları | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 bariyerli pipet uçları | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 bariyerli pipet uçları | P1122 | Denville Scientific | |
| Serolojik pipet, 10 mL, ayrı ayrı sarılmış | 356551 | Corning | |
| Serolojik pipet, 25 mL, ayrı ayrı sarılmış | 356525 | Corning | |
| Serolojik pipet, 5 mL, ayrı ayrı sarılmış | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 &; m, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Steril Mikrosantrifüj Tüpleri | 1138W14 | Thomas Scientific | Büyüme faktörlerini ayırmak için |
| Doku kültürü– Corning | 353043 | ||
| ; işlenmiş altı kuyulu plakalar | 353046 | Corning | |
| VWR beyaz techuni laboratuvar önlüğü | 10141-342 | VWR | |
| Geniş eğimli hücre kaldırıcı | 3008 | Corning |
Kaynaklar
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145(1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825(2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367(2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
