Burada sunulan, insan böbrek podositlerinin yüksek verimli (%>90) ve genetik manipülasyonlardan veya alt popülasyon seçiminden bağımsız olarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetülmesi için kimyasal olarak tanımlanmış bir protokoldür. Bu protokol 26 gün içinde istenen hücre tipini üretir ve nefrotoksisite testi ve hastalık modellemesi için yararlı olabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Olgun Böbrek Podositlerinin Kimyasal Olarak Tanımlanmış Koşullar Altında İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Rehberli Farklılaşması
Bu makalede
Özet
Özet
Böbrek hastalığı küresel nüfusun % 10'undan fazlasını etkiler ve federal harcamalarda milyarlarca dolara mal olur. Böbrek hastalığının en şiddetli formları ve nihai son aşama böbrek yetmezliği, genellikle endotel hücreleri ve böbreğin filtrasyon bariyerini oluşturmak için glomerüler bodrum zarı ile birlikte çalışan son derece uzmanlaşmış epitel hücreleri olan glomerüler podositlerin hasar görmesinden kaynaklanır. Böbrek tıbbındaki gelişmeler, birincil dokuların sınırlı mevcudiyeti ve podositler gibi fonksiyonel insan böbrek hücrelerinin türemesi için sağlam yöntemlerin bulunmaması nedeniyle engellenmiştir. Kök hücreler gibi yenilenebilir kaynaklardan podosit türetme yeteneği, insan böbrek gelişimi ve hastalığının mekanizmalarının mevcut olarak anlaşılmasına yardımcı olabileceği gibi terapötik keşif için yeni araçlar sağlayabilir. Bu protokolün amacı, insan kaynaklı pluripotent sap (hiPS) hücrelerinden yüksek verimlilik ve özgüllükle ve kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında olgun, post-mitotik podositler elde etmek için bir yöntem geliştirmekti. Bu yöntemle üretilen hiPS hücre türevi podositler, soyuna özgü belirteçleri (nefrin, podokin ve Wilm Tümörü 1 dahil) ifade eder ve olgun ve fonksiyonel podositlerle ilişkili özel morfolojik özellikleri (birincil ve ikincil ayak süreçleri dahil) sergiler. İlginç bir şekilde, bu özel özellikler, alanda yaygın olarak kullanılan ölümsüzleştirilmiş podosit hücre hattında özellikle yoktur, bu da burada açıklanan protokolün, tipik olarak insan böbrek biyolojisini incelemek için kullanılan mevcut podosit hücre çizgilerinden gelişimsel olarak daha olgun bir fenotipe sahip insan böbrek podositleri ürettiğini göstermektedir.
Giriş
İnsan pluripotent kök hücre kültüründeki gelişmeler, araştırmacılara insan vücudundaki hemen hemen her hücre tipini elde etmek için tasarlanmış yenilenebilir, ölçeklenebilir bir biyolojik malzeme kaynağı sağlayarak rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve ilaç taramasında devrim yapmayahazırdır 1. Bu strateji, özellikle elde edilmesi zor olan özel ve işlevsel hücre türlerini türetmek için yararlıdır. İnsan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücreleri2,3,4,5, somatik hücre kökenleri ve kişiselleştirilmiş tıp için temsil et....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Reaktiflerin hazırlanması
- 1x hiPS CCM çözeltisi elde etmek için hiPS hücre kültürü bazal ortamında çözülen 5x hiPS hücre kültürü ortamı (CCM) takviyesini seyreltin.
NOT: Dondurulmuş 5x hiPS CCM takviyesi, bir gecede ideal olarak 4 °C'de yavaş bir çözülme işlemi gerektirir. 1x hiPS CCM'nin aliquots'u -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir. - HiPS hücre kültürü için bodrum membran (BM) matrisi 1 kaplamalı plakaların hazırlanması: BM matrisi 1'i 4 °C'de buz üzerinde bir gecede çözün. Çözdükten sonra, üretici tarafından önerilen uygun seyreltme faktörlerine sahip aliquots hazırlayın.
NOT: Tipik olarak, aliquots, 50 mL konik bir tüpte 25 mL soğuk DME....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolün amacı, olgun insan podositlerinin kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında hiPS hücrelerinden türetilebileceğini göstermekti. Bu yazıda sunulan veriler, ilk kez test edilen ve mikoplazma içermeyen DU11 hiPS hücre hattı17kullanılarak oluşturulmuştır. Kromozomal analiz de yapıldı ve hücrelerin karyotipik olarak normal olduğu tespit edildi. Farklılaşmamış DU11 hiPS hücrelerinden başlayarak, Bu raporda özetlenen farklılaşma stratejisi (Şekil 1) önce kök .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu raporda, hiPS hücrelerinden böbrek glomerüler podositlerin üretimi için bir protokol açıklıyoruz. HiPS hücre türevi podositler olgun böbrek podosit fenotipi ile ilişkili morfolojik ve moleküler özellikler sergiler13. Önceki yayınlarda, hiPS hücre türevi podositlerin, perf kullanılabilir bir mikroakışkan organ-on-a-chip cihazında glomerüler mikrovasküler endotel hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde böbrek glomerülüsünün yapısını ve seçici filtrasyon işlevini taklit edebildiğimizi gösterdik
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
S.M. pluripotent kök hücrelerden böbrek podositlerinin üretimi için yöntemler için bekleyen bir patent üzerine bir yazardır (ABD patent başvurusu 14/950859). Geri kalan yazarlar rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma Duke Üniversitesi Pratt Mühendislik Okulu, Duke Tıp Fakültesi Nefroloji Bölümü, Duke Üniversitesi Tıp Bölümü'nden Bir Sandalye Araştırma Ödülü ve S.M.'ye Burroughs Wellcome Fonu PDEP Kariyer Geçiş Geçici Ödülü tarafından desteklendi. M.B, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı tarafından desteklendi. Bize CÖMERTÇE DU11 kök hücre hattını sağladığı için Bursac Laboratuvarı'na ve Duke Üniversitesi'ndeki Varghese Laboratuvarı'na doku kültürü tesisini grubumuzla geçici olarak paylaştığı için teşekkür ederiz. Bu yayın, Massachusetts Teknoloji Enstitüsü Novartis Kimya Profesörü Prof. Laura L.Kiessling'e 60.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hücreler< / güçlü > | |||
| DU11 insan iPS hücreleri | DU11 (Duke Üniversitesi klonu # 11) iPS hücre hattı, Duke Üniversitesi iPSC Çekirdek Tesisinde üretildi ve bize Duke Üniversitesi'ndeki Bursac Laboratuvarı tarafından sağlandı. Bu çizgi mikoplazma için test edildi ve en son Temmuz 2019'da laboratuvarımız tarafından karyotiplendi ve karyotipik olarak normal olduğu bulundu. | ||
| Büyüme Faktörleri ve Medya Takviyeleri | |||
| All-trans retinoik asit (500 mg) | 72262 | Kök Hücre Teknolojileri | |
| B27 serumsuz takviye edici gıda | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | Partiden partiye varyasyon gösterebilir |
| CultureBoost-R | ile Komple Orta Boy Kiti4Z0-500-R | Hücre Sistemleri | Podosit bakım ortamı |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 GlutaMAX takviyeli | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 glutamin takviyeli |
| Isıyla İnaktive Edilmiş FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| İnsan aktivini A | PHC9564 | Thermo/Life Teknolojiler | |
| İnsan BMP7 | PHC9544 | Termo / Yaşam Teknolojileri | |
| İnsan VEGF | PHC9394 | Termo / Yaşam Teknolojileri | |
| mTeSR1 ortamı | 05850 | Kök Hücre Teknolojileri | hiPS hücre kültürü ortamı (CCM) |
| Penisilin ve ndash; Streptomisin, sıvı (100&�) | 15140-163 | Termo / Yaşam Teknolojileri | |
| Y27632 ROCK inhibitörü | 1254 | Tocris | |
| Antikorlar< / güçlü > | |||
| Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 594 (ndash); konjuge ikincil antikorlar | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Termo / Yaşam Teknolojileri | |
| Brachyury (T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R& D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molekülleri | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) parçası | N-892012 | Iwai Kuzey Amerika | Bodrum membranı (BM) matrisi 2 |
| Matrigel hESC nitelikli matris, 5 mL flakon | 354277 | BD Biyoloji | Bilimleri Temel membran (BM) matrisi 1. Partiden partiye varyasyon gösterebilir |
| Enzimler ve Diğer Reaktifler | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Hücre ayırma çözümü |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimetil Sülfoksit (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO toksiktir. Kimyasal güvenlik başlığında ele alınmalıdır |
| Enzim içermeyen hücre ayrışma tamponu, Hank' S Dengeli Tuz | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Etanol çözeltisi, %70 (hacim/hacim), biyoteknoloji sınıfı | 97065-058 | VWR | Etanol yanıcı ve toksiktir |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehit (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA, eldivenler, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlükler dahil olmak üzere uygun kişisel koruma ekipmanlarına sahip bir kimyasal çeker ocakta kullanılmalıdır. Solumaktan ve cilt ile temasından kaçının. |
| Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Steril Distile Su | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Tripsin-EDTA, %0,05 | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirasyonlu pipetler, ayrı ayrı sarılmış | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Santrifüj | B99516 | Beckman Coulter | |
| Konik santrifüj tüpü, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Konik santrifüj tüpü, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryobox'lar | 3395465 | Termo/Yaşam Teknolojileri | Dondurulmuş halde saklamak için aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Sabit ve lekeli iPS hücrelerinin ve türevlerinin görüntülerini elde etmek için kullanılan floresan mikroskobu |
| Hemositometre | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 inkübatörü | 51030403 | Thermo/Life Technologies | iPS hücrelerinin ve türevlerinin |
| rutin kültürü ve bakımı içinAxioCam 503 kamera ile donatılmış ters Zeiss Axio Observer | 491916-0001-000 (mikroskop); 426558-0000-000(kamera) | Carl Zeiss Mikroskobu | Podosit farklılaşmasının her aşamasında canlı iPS hücrelerinin ve türevlerinin faz kontrast görüntülerini elde etmek için kullanılır |
| Kimberly-Clark nitril eldivenler | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, büyük | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, küçük | 21905-026 | VWR | |
| P10 hassas bariyerli pipet uçları | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 bariyerli pipet uçları | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 bariyerli pipet uçları | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 bariyerli pipet uçları | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 bariyerli pipet uçları | P1122 | Denville Scientific | |
| Serolojik pipet, 10 mL, ayrı ayrı sarılmış | 356551 | Corning | |
| Serolojik pipet, 25 mL, ayrı ayrı sarılmış | 356525 | Corning | |
| Serolojik pipet, 5 mL, ayrı ayrı sarılmış | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 &; m, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Steril Mikrosantrifüj Tüpleri | 1138W14 | Thomas Scientific | Büyüme faktörlerini ayırmak için |
| Doku kültürü– Corning | 353043 | ||
| ; işlenmiş altı kuyulu plakalar | 353046 | Corning | |
| VWR beyaz techuni laboratuvar önlüğü | 10141-342 | VWR | |
| Geniş eğimli hücre kaldırıcı | 3008 | Corning |
Kaynaklar
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
