Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kök Hücre Yapışması için Janus Baz Nanotüpler ve Fibronektin ile Biyomimetik Nano Matris İmalatı

3.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61317

⸱

10 Mayıs 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

Bu makalede

Özet

Bu protokolün amacı, Janus baz nanotüpleri (JBNTs) ve fibronektin (FN) ile bir biyomimetik nanomatrixin (NM) montajını göstermektir. İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC' ler) ile birlikte kültürlendiğinde, NM'ler hMSC'lerin yapışkanını teşvik etmede mükemmel biyoaktivite sergiler.

Özet

Kök hücre ankrajını artırabilen bir doku mühendisliği biyolojik iskelesi olarak hizmet edecek bir biyomimetik NM geliştirilmiştir. Biyomimetik NM, sulu bir çözeltide kendi kendine montaj yoluyla JBNT'lerden ve FN'den oluşturulur. JBNT'ler iç hidrofobik içi boş kanallar ve dış hidrofilik yüzeylerle 200-300 μm uzunluğundadır. JBNT'ler pozitif olarak ve FN'ler negatif olarak ücretlendirilir. Bu nedenle, nötr sulu bir çözeltiye enjekte edildiğinde, NM demetlerini oluşturmak için yaygın olmayan yapıştırma yoluyla birbirine bağlanırlar. Kendi kendine montaj işlemi, herhangi bir kimyasal başlatıcı, ısı kaynağı veya UV ışığı olmadan birkaç saniye içinde tamamlanır. NM çözeltisinin pH'ı FN'lerin izoelektrik noktasından (pI 5.5-6.0) daha düşük olduğunda, NM demetleri pozitif yüklü FN varlığı nedeniyle kendiliğinden serbest kalacaktır.

NM'nin hücre dışı matrisi (ECM) morfolojik olarak taklit ettiği bilinmektedir ve bu nedenle, hMSC yapıştırmasını geliştirmek için mükemmel bir platform sağlayan enjekte edilebilir bir iskele olarak kullanılabilir. Hücre yoğunluğu analizi ve floresan görüntüleme deneyleri, NM'lerin negatif kontrole kıyasla hMSC'lerin ankrajını önemli ölçüde artırdığını gösterdi.

Giriş

İnsan mezenkimal kök hücreler (hMSC'ler), dokuların yenilenmesine ve bakımına yardımcı olan farklı mezenkimal soylar boyunca kendini yenileme ve kendini farklılaştırma potansiyelini göstermiştir1. Farklılaşma potansiyeline dayanarak, hMSC'ler mezenkimal doku yaralanmaları ve hematopoetik bozukluk tedavisi için aday olarak kabul edilir2. hMSC'ler doku onarımını, anjiogenezini artırarak ve iltihabı azaltarak yara iyileşmesini teşvik etme yeteneğini göstermiştir3. Bununla birlikte, biyokimyasal veya biyomalzemeler yardımı olmadan, hMSC'lerin bir hedef dokuya ulaşması ve istenen yerde çalışması için verimlilik düşüktür4. Lezyonlara yapışmak için hMSC'leri çekmek için çeşitli tasarlanmış iskeleler kullanılsa da, uzun bir kemiğin ortasındaki büyüme plakası kırığı gibi bazı bölgelere, düzensiz şekilli bir yaralı bölgeye mükemmel bir şekilde sığmayan geleneksel önceden imal edilmiş iskeleler tarafından kolayca erişilemez.

Burada, kendi kendine yerinde monte edilebilen ve ulaşılması zor bir hedefe enjekte edilebilen bir biyomimetik nanomalzeme geliştirdik. Enjekte edilebilir biyo-iskele NM, Janus baz nanotüpler (JBNTs) ve fibronektinden (FN) oluşur. Rozet Nanotüpleri (RNTs) olarak da bilinen JBNT'ler, DNA baz çiftlerinden, özellikle timin ve adenden türetilir, burada5,6,7. Şekil 1'degörüldüğü gibi, nanotüpler, türetilmiş DNA tabanının altı molekülü hidrojen bağları aracılığıyla kendi kendine birleşerek bir düzlem oluşturduğunda oluşur6. Daha sonra altı molekül, 200-300 μm uzunluğa kadar olabilen güçlü bir pi istifleme etkileşimi7aracılığıyla bir düzlemde birbirlerine yığılır. JBNT'ler morfolojik olarak kollajen liflerini taklit etmek için tasarlanmıştır, böylece FN onlarla reaksiyona girecektir.

FN, hücre dışı matriste (ECM)9bulunan yüksek moleküler ağırlıklı yapışkan glikoproteindir. Bunlar kök hücrelerin ECM'nin diğer bileşenlerine, özellikle kollajen10'abağlanmasına aracılık edebilir. JBNT'leri morfolojik olarak kollajen liflerini taklit etmek için tasarladık, böylece FN onlarla reaksiyona girerek kararsız bağlanma yoluyla birkaç saniye içinde NM oluşturabilir. Bu nedenle, NM, geleneksel olarak imal edilmiş iskeleler tarafından erişilemeyen bir kemik kırılma bölgesine enjekte edilecek umut verici bir biyo-iskeledir. Burada, enjekte edilebilir NM, doku yenilenmesi için bir iskele görevi görebilme potansiyellerini sergileyen hMSC ankraj in vitro'yu geliştirmek için mükemmel bir yetenek sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. JBNT'lerin Sentezi

NOT: JBNT monomer daha önce yayınlandı olduğu gibi hazırlanmıştır11.

  1. Bileşik A1 sentezi
    1. 25 mL toluen ve 2,5 mL N, N-dimetilformamid içinde 8,50 g 2-siyanoasetik asit ve 9,80 g etilkarbamat içeren bir çözelti hazırlayın. Damla yönünde 4,90 mL fosforel klorür ekleyin. Daha sonra karışımı 70 ° C'ye ısıtın ve 1,5 saat karıştırmaya devam edin.
    2. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına soğutun ve 100 g buzlu su dökün. Sulu tabakayı etil asetat (3 x 250 mL) ile çıkarın ve 100 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, soluk sarı bir katı elde etmek için uçucuları vakum altında filtreleyin ve buharlaştırın.
    3. Sarı katıyı silika jel flaş sütun kromatografisine (%3 metanol/dikloromethane) tabi tutarak beyaz bir toz olarak 15,61 g bileşik A1 elde edin.
  2. A2 bileşiği sentezi
    1. 3.12 g bileşik A1 ve 2.75 g potasyum karbonatı 50 mL N, N-dimetilformamid karıştırın. Oda sıcaklığında 2 saat karıştırın.
    2. Reaksiyon süspansiyonu için 2,6 mL karbon disülfid ekleyin. 4 saat karıştırmaya devam edin.
    3. Reaksiyon karışımına 0 °C'de mutlak etanol ekleyin. Sarı çökeltiyi filtreleyin ve dietil eter ile yıkayın. Soluk sarı katı olarak 6,18 g bileşik A2 elde etmek için vakum altında bir gecede kurutun.
  3. A3 bileşiği sentezi
    1. 15 mL asetonitril içine 2,7 mL metil iyodür ekleyin. Ayrıca, 6,18 g A2 ila 80 mL su/asetonitril (7:3 oranı) ekleyerek ayrı ayrı bir A2 bileşik çözeltisi hazırlayın. Hem çözeltileri karıştırın hem de oda sıcaklığında 30 dakika karıştırın.
    2. Reaksiyon karışımını 95 °C'ye ısıtın ve 3 saat boyunca karıştırmaya devam edin.
    3. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına soğutun ve ardından uçucuları vakum altında buharlaştırin.
    4. Kalıntıyı 100 mL etil asetat ile 3x çıkarın ve salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, sarı bir katı elde etmek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.
    5. Sarı katıyı silika jel flaş sütun kromatografisine (%30 etil asetat/hexanes) maruz kalarak A3 bileşiğin 4,52 g'ını açık sarı katı olarak elde edin.
  4. A4 bileşiği sentezi
    1. 20 mL etanol içine 925 μL allylamin ekleyerek alllamin çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiyi, 75 mL mutlak etanolde 3,14 g A3 eklenerek hazırlanan bileşik A3 çözeltisine damla yönünde ekleyin, 30 dakikadan fazla. Daha sonra reaksiyon karışımını reflüye 16 saat ısıtın.
    2. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına soğutun ve sarı bir katı vermek için uçucuları buharlaştırin.
    3. Sarı katıyı silika jel flaş kolon kromatografisine (%50 etil asetat/heksanlar %2 metanol/dikloromethane) tabi tutarak beyaz kristal olarak 1,80 g bileşik A4 elde edin.
  5. A5 bileşiği sentezi
    1. 14 mL mutlak etanol içine 2,05 g guanidinyum hidroklorür ve 7,8 mL sodyum etoksit (etanolde% 21 wt) ekleyin. Karışımı 15 dakika boyunca 45 °C'ye ısıtın.
    2. Çözünmeyen malzemeyi filtreleyin ve filtratı doğrudan 40 mL mutlak etanol içine 2,70 g A4 ekleyerek hazırlanan A4 bileşiği çözeltisine ekleyin. Reaksiyon karışımını reflüye 16 saat ısıtın.
    3. 2,65 g bileşik A5 elde etmek için çökeltmeyi beyaz olmayan bir katı olarak filtreleyin.
  6. Bileşik A6 sentezi
    1. 1 dakika boyunca 120 mL tetrahidrofuranda 2,11 g bileşik A5 ve 1,10 g 4-Dimetilaminopyridine eklenerek elde edilen bulamaç karışımına yavaşça 24,9 mL trietilamin ekleyin. Oda sıcaklığında 2 dakika karıştırın.
    2. Reaksiyon karışımına damla yönünde 20,7 mL di-tert-butil dikarbonat ekleyin ve oda sıcaklığında 40 saat karıştırmaya devam edin.
    3. Reaksiyonun söndürülmesi için 20 mL su ekleyin. Uçucuları vakum altında buharlaştır.
    4. Kırmızı viskoz kalıntıyı 500 mL etil asetat ile çıkarın. Ardından, 250 mL su, 75 mL% 10 sitrik asit, 200 mL su ile 2x, 200 mL doymuş sodyum bikarbonat ve 200 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, kırmızı/turuncu bir katı vermek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.
    5. Katıyı silika jel flaş kolon kromatografisine (%0-20 etil asetat/heksanes) vererek beyaz köpük olarak 3,87 g bileşik A6 elde edin.
  7. Bileşik A7 sentezi
    1. Aseton/suda (8:1, 58,5 mL) A6 (2,93 g) bileşik çözeltisine damla yönünde N-metilmorfolin N-oksit (suda% 50 wt.% ekleyin) ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırın.
    2. Karışıma 3 dakikalık bir süre boyunca damla yönünde osmiyum tetraoksit (%4 sulu çözelti) ekleyin ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırmaya devam edin.
    3. Çözelti renksiz olana kadar reaksiyonun 1.0 M sulu sodyum sülfit ile söndürülmesi. Suda beyaz bir bulamaca neden olmak için vakum altındaki uçucuları çıkarın. Kalıntıyı 350 mL diklorometan ile çıkarın ve ardından 150 mL su ile yıkayın ve ardından 150 mL salamura ile yıkayın.
    4. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, beyaz bir katı olarak 2,45 g bileşik A7 elde etmek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.
  8. Bileşik A8 sentezi
    1. 35 mL dikloromethane/suda (6:1, 35 mL) 1,36 g bileşik A7 karışımına 760 g sodyum periodide ekleyin ve 42 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırın.
    2. Çözünmeyen malzemeyi filtreleyin ve filtratı vakum altında yoğunlaştırın. Elde edilen kalıntıyı 250 mL diklorometan ile çıkarın ve ardından 100 mL su ve 100 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, ham ürünü vermek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.
    3. Ham ürünü silika jel flaş kolon kromatografisine (%5-40 etil asetat/altıgen, daha sonra %5 metanol/dikloromethane) 1,08 g bileşik A8 verimine tabi tutunun.
  9. Bileşik A9 sentezi
    1. 1,2-dikloroetan 15 mL'de 830 mg bileşik A8 çözeltisi hazırlayın. Damlacık çözeltisini 6-benzyloxycarbonylamino-2-L-amino-heksanoik asit trimetilsilyl etil ester (649.5 mg) karışımına ekleyin ve N,N-diisopropylethylamine (591 μL) 24 mL'de 1,2-dikloroetan 3 dakika boyunca karıştırın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırın.
    2. Çözeltiye 360,3 mg sodyum triacetoxyborohidrit ekleyin ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırmaya devam edin.
    3. Reaksiyon karışımını 6 mL su ile söndürin. Reaksiyon karışımını 200 mL diklorometan ile 3x çıkarın ve suda% 10 sitrik asit 200 mL, 200 mL su ile 2x, 200 mL doymuş sodyum bikarbonat ve 200 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, ham ürünü elde etmek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.
    4. Ham ürünü 885 mg bileşik A9 elde etmek için silika jel flaş sütun kromatografisine (%5-30 etil asetat/heksanes) tabi edin.
  10. JBNT monomer sentezi
    1. 0,54 g bileşik A9 'ı (0,54 g) %94 trifluoroasetik asit/tiyoanisol çözeltisinin 10 mL'sinde çözün ve oda sıcaklığında 72 saat karıştırın.
    2. Reaksiyon karışımına dietil eter (80 mL) ekleyin ve çökeltmeyi santrifüjleyin. Süpernatant içeren berrak trifluoroasetik asidi dökün ve beyaz çökeltiyi 168,6 mg ham JBNT monomer(Ek Dosya 1)elde etmek için dietil eter ve metanol ile yıkayın.
    3. Ham JBNT monomerini, ters faz sütununa sahip yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) ile arındırın. İzolasyon programı aşağıda listelenmiştir: Solvent A: % 100 su; solvent B: %100 asetonitril; solvent C: pH=1 HCl su çözeltisi; akış hızı: 3 mL/dk (bkz. Tablo 1).
    4. Yaklaşık 7.2 dakikada en büyük zirveyi toplayın.

2. JBNT / FN için İmalat

  1. 40 μL 1 mg/mL FN sulu çözeltiye ve pipete birkaç kez 80 μL 1 mg/mL JBNT sulu çözelti ekleyin.
  2. Yaklaşık 10 s pipetlemeden sonra beyaz katı süspansiyonun varlığını kontrol edin.
    NOT: NM'nin kendi kendine montaj sürecini yakalamak için bir video çekildi (Ek Dosya 2).

3. Liyofilize örneklerin gözlemlenmesi

NOT: Bu adım, JBNT'lerden ve FN'den yapılan NM'nin iskele yapısını göstermek için gerçekleştirilir.

  1. Lyophilized malzeme gözlemi için FN, JBNT ve FN/JBNT NM çözümlerini hazırlayın. 20 μg/mL'lik bir FN çözeltisi yapmak için 10 μL 100 μg/mL FN'yi 40 μL damıtılmış su ile seyreltin.
  2. 45 μL DI suda 5 μL 1 mg/mL JBNT seyrelterek 100 mg/mL JBNT çözeltisi hazırlayın.
  3. NM çözeltisini oluşturmak için 35 μL DI suda 10 μL 100 μg/mL FN ve 5 μL 1 mg/mL JBNT karıştırın.
  4. Sırasıyla FN, JBNT çözümü ve NM çözümü ile 96 kuyulu yuvarlak alt mikro plakalardan oluşan üç kuyuyu kapla. Her kuyu 50 μL çözelti alır.
  5. NM'nin iskele yapısını görselleştirmek için aşağıda açıklandığı gibi liyofilizasyon gerçekleştirin.
    1. Plakayı gece boyunca -80 °C'de dondurun.
    2. Lyophilized cihazı ve vakum pompasını açın.
    3. Sistemin sıcaklığını -50 °C'ye düşürmek için soğuma düğmesine basın.
    4. Donmuş plakayı liyofilize enstrümana koyun ve aletlerin tüm açıklıklarını kapatın.
    5. Sistem basıncını 0,9 mbar'a düşürmek için başlat düğmesini tıklatın.
    6. 4 saat sonra, havalandırma düğmesine basın ve sistem basıncını atmosferik basınca artırmak için vanayı açın.
    7. Tabağı teofiliz aletinden çıkar.
    8. FN, JBNT'leri ve ortaya çıkan kendi kendine monte edilmiş NM'yi gözlemlemek için bir mikroskop kullanın. Malzemeler için bir kamera ile birkaç fotoğraf çekin.

4. Absorpsiyon spektrum ölçümü

NOT: Kendi kendine monte edilmiş JBNT / FN NM12'yisunmak için FN ve JBNT'ler için spektrum değişikliğini kullanın.

  1. JBNT/FN NM çözeltisini hazırlamak için 30 μL 100 μg/mL FN'yi 15 μL damıtılmış su ve 5 μL 1 mg/mL JBNT ile karıştırın. Çözeltiyi birkaç kez pipetledikten sonra beyaz katı süspansiyon görülebilir.
    NOT: Çözeltideki son JBNT ve FN konsantrasyonları sırasıyla 100 μg/mL ve 60 μg/mL'dir. NM çözümünde kullanılana aynı konsantrasyonda JBNT'ler ve FN çözümleri de kontrol çözümleri olarak hazırlanmıştır.
  2. JBNT kontrol çözeltisini hazırlamak için 5 μL 1 mg/mL JBNT'yi 45 μL damıtılmış su ile seyreltin.
  3. FN kontrol çözeltisi hazırlamak için 30 μL 100 μg/mL FN'yi 20 μL damıtılmış su ile seyreltin.
  4. NM'nin montajını karakterize etmek için FN, JBNT ve JBNT/FN NM çözeltilerinin UV-vis emme spektrumunu spektrofotometre ile ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. UV-Vis düğmesini tıklatın. Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL damıtılmış su bırakın. 190-850 nm arasında boş olarak ölçün.
    2. Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL FN çözeltisi bırakın. FN çözeltisinin UV-Vis emilim spektrumunu 190 nm'den 850 nm'ye kadar ölçün.
    3. Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL JBNT çözeltisi bırakın. JBNT çözeltisinin emilim spektrumunu 190 nm'den 850 nm'ye kadar ölçün.
    4. Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL JBNT/FN NM çözeltisi bırakın. JBNT/FN NM çözeltisinin emilim spektrumunu 190 nm'den 850 nm'ye kadar ölçün.

5. İletim elektronik mikroskopisi (TEM) için JBNT/FN NM hazırlanması

  1. Temel plazma temizleyici ile negatif boyamadan önce birkaç ızgarayı temizleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. İki farklı işlemi takiben numuneler için negatif boyama gerçekleştirin.
    1. Ayrı ızgaralara 3 μL 1 mg/mL JBNT sulu çözelti ve 3 μL JBNT/FN NM çözeltisi bırakın ve 2 dakika bekletin. Ardından her ızgarayı %0,5 uranil asetat (UA) çözeltisinin 100 μL'si ile durulayın. Fazla çözeltiyi filtre kağıdı ile boşaltın ve ızgaraları havayla kurutun.
    2. 9 μL JBNT/FN NM solüsyonunun 3 μL%2,0 UA çözeltisi ile karıştırın ve birkaç kez pipetlayın. Pipet ızgaralar üzerinde karışık çözelti ve 2 dakika boyunca ızgaralarda tutun. Karışık çözeltiyi ızgaralardan çıkarmak ve ızgaraları oda sıcaklığında kurutmak için bir filtre kağıdı kullanın.
  3. Son olarak, numuneyi JBNT'ler, adım 5.2.1 ile lekelenmiş JBNT/FN NM ve TEM ile 5.2.2 adımı ile lekelenmiş JBNT/FN NM için karakterize edin.

6. In vitro biyolojik fonksiyon tahlil

  1. 200 μL negatif kontrol (NC, PBS), JBNT, FN ve JBNT/FN NM çözümlerini sırasıyla 8 iyi odalmış bir slayt kuyusuna ekleyin.
  2. Kuyuların dibindeki malzemeleri kaplamak için 8 kuyulu odalı örtü örtüsünü liyofilize aletle dondurun. Dondurarak kurutma protokolü adım 3.5 ile aynıdır.
  3. Daha sonra kuyulara 10.000 hücre /kuyu hMSC (Passage 3) ekleyin ve % 5 CO 2 ile 37 °C'de24saat kuluçkaya yatırın.
  4. Kuluçkadan sonra, hücre kültürü ortamını kuyulardan dışarı atın ve kültürü 1x PBS çözeltisi ile durulayın.
  5. Her kuyuya 100 μL sabitleyici çözelti ekleyin ve 5 dakika bekletin. Hücreleri 1x PBS ile iki kez hafifçe durulayın.
  6. Seyreltin 1% Triton-X 100 ila% 0.1. Her kuyuya 100 μL% 0.1 Triton-X 100 ekleyin ve 10 dakika bekletin. Hücreleri 1x PBS ile iki kez hafifçe durulayın.
  7. Rhodamine Phalloidin'i 1,65 μM'ye seyreltin. Hücreleri 1x PBS ile iki kez hafifçe durulayın.
  8. Floresan mikroskopla hücre görüntülerini yakalayın.
  9. Her grup için floresan görüntülerdeki hücre numaralarını sayın. Her kuyuda üç rastgele alanın ortalamasını alarak hücre yapışıklık yoğunluğunu hesaplayın.
  10. Tüm verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun. Tek kuyruklu bir t testi kullanarak istatistiksel analizler yapın, ardından istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edilen p<0.05 ile varyans analizi (ANOVA).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Çalışmalarımız, JBNT ve FN'nin NM oluşumunun hızlı olduğunu keşfetti, bu da 10 saniyede gerçekleşti. Şekil 2'degösterildiği gibi, JBNT çözeltisi FN çözeltisi ile karıştırıldığında ve birkaç kez pipetlendiğinde beyaz flokül elde edildi. NM'nin oluşum süreci tamamen biyomimetiktir. Harici uyaranlara gerek yoktur. İmalat süreci, çapraz bağlantı için ultraviyole ışık veya kimyasal başlatıcıya dayanan bazı gelişmekte olan biyomalzemelerden çok dahakolaydır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, DNA'dan ilham alan JBNT'ler ve FN ile oluşturulan kendi kendine monte edilmiş bir biyomimetik NM geliştirdik. JBNT çözeltisini hazırlarken, JBNT liyofilize tozu PBS yerine suya çözülmelidir, çünkü PBS, montajlarını engelleyen JBNT'lerin aglomerasyonuna neden olacaktır. Ayrıca, NM'nin nano-fibril yapılarını gözlemlemek istiyorsak NM de suda monte edilmelidir, çünkü PBS'deki tuz, görüntülerin çözünürlüğünü büyük ölçüde azaltabilecek NM lifleri ile birlikte gelecektir.

NM, hMSC'leri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Dr. Yupeng Chen, NanoDe Therapeutics, Inc.'in kurucu ortağıdır.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Kariyer Ödülü (1653702) ve Connecticut Üniversitesi tarafından finansal olarak desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,2-dikloroetanAlfa Aesar39121
2-siyanoasetik asitSigma-AldrichC88505
4-DimetilaminopiridinTCI AmerikaD1450
8 kuyu Odacıklı Kapak CamıThermo Fisher155409
96 oyuklu plakaCorning353072
mutlak etanolThermo FisherBP2818500
asetonSigma-Aldrich179124
asetonitrilSigma-Aldrich34851
alilaminSigma-Aldrich145831
Temel Plazma TemizleyiciHarrick PlasmaPDC32G
sitrik asitSigma-Aldrich251275
konsantre hidroklorik asitSigma-AldrichH1758
Deiyonize suThermo Fisher15230147
diklorometanSigma-Aldrich270997
dietil eterSigma-Aldrich296082
Di-tert-bütil dikarbonatSigma-Aldrich361941
etil asetatSigma-Aldrich319902
etilkarbamatSigma-AldrichU2500
FibronektinThermo FisherPHE0023
Fiksatif Çözelti (PBS'de hazırlanan% 4 formaldehit)Thermo FisherR37814
guanidinyum hidroklorürAlfa AesarA13543
hekzanlarSigma-Aldrich227064
İnsan mezenkimal kök hücrelerLonzaPT-2501
metanolSigma-Aldrich34860
metil iyodürSigma-Aldrich289566
N, N-DiizopropiletilaminAlfa AesarA17114
N, N-dimetilformamidSigma-Aldrich227056
N-Metilmorfolin N-oksitAlfa AesarA19802
Osmiyum tetraoksitAlfa Aesar45385
Penisilin-StreptomisinThermo Fisher15140163
Fosfat Tampon ÇözeltisiThermo Fisher20012050
fosforil klorürSigma-Aldrich201170
potasyum karbonatSigma-Aldrich347825
ters faz sütunuThermo Fisher25305-154630
Rhodamine PhalloidinThermo FisherR415
silika jelTCI AmericaS0821
sodyum bikarbonatSigma-AldrichS6014
sodyum etoksitAlfa AesarL13083
sodyum periyodiyitSigma-Aldrich71859
sodyum sülfatSigma-Aldrich239313
sodyum sülfitSigma-AldrichS0505
sodyum triasetoksiborohidrürAlfa AesarB22060
spektrofotometre (NanoDrop Bir / Bir < sup>c < / sup> UV-Vis)Thermo FisherND-ONE-W
Kök Hücre Büyüme Ortamı BulletKitLonzaPT-3001
tetrahidrofuranSigma-Aldrich401757
tiyoanisolSigma-AldrichT28002
toluenSigma-Aldrich179418
trietilaminAlfa AesarA12646
trifloroasetik asitAlfa AesarA12198
Triton X-100Thermo FisherHFH10
Tripsin-EDTA çözeltisiThermo Fisher25200056

Kaynaklar

  1. Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
  2. Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).
  3. Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).
  4. De Becker, A., Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy. World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).
  5. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  6. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  7. Fenniri, H., et al. Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization. Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).
  8. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  9. Van den Bogaerdt, A. J., et al. Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation. Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).
  10. Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand. Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).
  11. Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. U. S. Patent. , 20170362238A1 (2017).
  12. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage. Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).
  13. Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).
  14. Singh, P., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis. Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).
  15. Martino, M. M., et al. Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability. Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).
  16. Somaiah, C., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 10 (12), 0145068(2015).
  17. Ogura, N., et al. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).
  18. Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. 3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).
  19. Shi, W., et al. Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo. Advanced Material. 29, 1701089(2017).
  20. Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells. Small. 4 (6), 817-823 (2008).
  21. Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo. International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fibronektin Kendi Kendine D zenlenmesiDoku M hendisli i skelesiUV Vis SpektroskopisiFloresan MikroskobuTransmisyon Elektron Mikroskobunsan Mezenkimal K k H creleriH cre D Matriks Taklidi
Kök Hücre Yapışması için Janus Baz Nanotüpler ve Fibronektin ile Biyomimetik Nano Matris İmalatı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.