Yöntem makalesi
Burada 3D kültür koşullarında domuz oositkapsülasyonu için iki protokol sunulmuştur. İlk olarak, kümülüs-oosit kompleksleri (COCs) fibrin-aljinat boncuklar kapsüllenir. İkincisi, florlu etilen propilen toz parçacıkları (mikrobiyoreaktörler) ile çevrilidir. Her iki sistem de 3B organizasyonlarını sürdürmek için en uygun koşulları sağlar.
Üreme biyolojisinde, suni döllenme ve embriyo transfer teknolojisi ile başlayan biyoteknoloji devrimi, yumurta tüp bebek olgunlaşma (IVM), tüp bebek (IVF) ve somatik hücreden nükleer transfer ile evcil hayvanların klonlanması gibi yardımcı üreme tekniklerinin geliştirilmesine yol açmıştır. IVM özellikle önem eger bir yöntemdir. Ticari olarak önemli veya nesli tükenmekte olan türlerde üretim aralığının azaltılması, in vitro insan üremesi ile ilgili araştırmalar ve hücre tedavileri için transgenik hayvanların üretimi gibi uygulamalar için olgun, kaliteli oositlerin tedariki için platform teknolojisidir. Yumurta kalitesi terimi olgunlaşmayı tamamlama, döllenme ve sağlıklı yavrular olma yetkinliğini içerir. Bu iyi kalitede oositler IVF prosedürleri de dahil olmak üzere başarılı döllenme için her şeyden önemli olduğu anlamına gelir. Bu, sadece insan yumurtalarının değil, diğer büyük memeli türlerinin de büyümesini destekleyecek güvenilir bir kültür yöntemi geliştirmekte birçok zorluk teşkil eder. IVM'de ilk adım yumurtaların in vitro kültürüdür. Bu çalışma, domuz yumurtası 3D kültür için iki protokol açıklar. İlk olarak, 3D model kümülüs kompleksleri (COCs) bir fibrin-aljinat boncuk interpenetrating ağ kapsüllenir, hangi fibrin ve aljinat karışımı aynı anda jellenir. İkincisinde, COC'lar bir damla orta alanda askıya alınır ve sıvı mermerler (LM) olarak tanımlanan mikrobiyoreaktörleri oluşturmak için florürlü propilen (FEP; heksofloropropilen ve tetrafloroetilen kopolimeri) ile kapsüllenirler. Her iki 3D sistem de gaz tüp bebek kültür ortamını korur. Ayrıca, boşluk kavşaklarının düzlemesini ve bunun sonucu olarak bozulmalarını önleyerek, yumurta ve çevresindeki foliküler hücreler arasındaki işlevsel ilişkiyi koruyarak COCs 3D organizasyonunu sürdürürler.
Üç boyutlu (3D) olanlar da dahil olmak üzere çeşitli kültür sistemlerinin geliştirilmesi, gelişimin en erken aşamalarında bile foliküllerden izole edilen yumurtaların büyümesi ve olgunlaşması için en uygun koşulları sağlamayı amaçlamaktadır. Bu yardımlı üreme teknikleri için büyük önem taşımaktadır (ART), özellikle kanser tedavisi sonrası kısırlık ile mücadele eden kadınların artan sayıda görünümünde1. In vitro koşullarda yumurtaların olgunlaşması (IVM) zaten hayvancılık üreme amacıyla in vitro embriyo üretimi için kullanılan iyi kurulmuş bir tekniktir2. Ancak, çoğu memeli türünde, kümülüs-oosit komplekslerinin (COC) yük....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Aşağıdaki prosedürler Jagiellonian Üniversitesi Zooloji ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü Hayvan Refahı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Domuz kümülüs-oosit komplekslerinin izolasyonu
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Her iki IVM sistemi kullanan COC'larda granülosa hücreleri birbirine sıkıca yapışmış ve kurtarılan COC'ların çoğunda bozulmadan kümülüs hücresi katmanları bulunurdu(Şekil 1A,B). Ayrıca kümülüs hücrelerinin önemli bir kısmı korunmuştur.
COCs canlılık analizinden elde edilen sonuçlar, 3Boyutlu in vitro koşullarda domuz yumurtalarının kapsülasyonu için uygulanan her iki sistem de optimum büyüme koşullarını sağladığını doğrulamıştır
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sadece yumurtanın değil, onu çevreleyen kümülüs hücrelerinin de tüp bebek büyümesini sürdürebilme ve aynı zamanda olgunlaşmasını destekleyebilme yeteneği, başarılı yardımcı üreme teknolojileri için ve özellikle insan veya domuz gibi uzun süreli foliküler büyüme uygulanan türlerde somatik hücre/oosit etkileşimlerinin anlaşılmasını ilerletmek için son derece önemlidir. Sürekli geliştirilmiş IVM teknikleri polikistik over sendromu (PCOS), erken yumurtalık yetmezliği veya kesin kısırlık (onkoterapi) durumlarında üreme seçene.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Yazarlar çok müteşekkir: dr Waclaw Tworzydlo (Gelişimbiyoloji ve Omurgasız Morfoloji Bölümü, Zooloji ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Jagiellonian Üniversitesi) TEM teknik tesisleri için; Teknik yardım için Bayan Beata Snakowska'ya (Endokrinoloji Anabilim Dalı, Zooloji ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Jagiellonian Üniversitesi); Hücre Biyolojisi ve Görüntüleme Bölümü, Zooloji ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Jagiellonian Üniversitesi, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japonya). Bu çalışma Polonya Ulusal Bilim Merkezi'nin 2018/29/N/NZ9/00983 sayılı hibe ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Genel< / güçlü > | |||
| Antibiyotik Antimikotik (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | İşleme Ortamı için% 2,5 nihai konsantrasyon. PBS'de% 1 (adım 1.2) |
| DMEM / F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | İşleme ve Olgunlaşma Ortamı |
| DPBS (Ca, Mg olmadan), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | hem İşleme Ortamı hem de Olgunlaşma Ortamı için %10 nihai konsantrasyondur. (Adımlar: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stok Çözeltisi (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Kimyasalları | 600232 | 1x nihai konsantrasyon. Diğer marka kullanılabilir |
| Olgunlaşma Ortamı< / güçlü> | |||
| hCG (10 000 U'luk 1 ŞIŞE) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-aljinat boncuk< / güçlü > | |||
| Aljinat Liyaz | Sigma-Aldrich | A1603 | (Adım 2.11.1) |
| Trombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Adım 2.1) |
| Kalsiyum Klorür | Sigma-Aldrich | C5670 | (Adım 2.1) |
| Fibrinojen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Adım 2.2) |
| Sodyum Aljinat | Sigma-Aldrich | W201502 | (Adım 2.3) aljinat çözeltisi için kullanın |
| < güçlü > Sıvı Mermer< / güçlü> | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morfolojik inceleme | |||
| CANLI/ÖLÜ Canlılık/Sitotoksisite Kiti, memeli hücreleri için | Thermo Fisher | L3224 | (Adım 4.1.) Yayılan floresan: kalsein için 494 nm, EthD-1 için 528 nm; Ölçü: kalsein için 517 nm, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Montaj Ortamı | Vektör Laboratuvarları | H-1000 | montaj ortamı |
| Yapısal inceleme | |||
| Glutaraldehit çözeltisi | Sigma-Aldrich | G5882 | %2.5 nihai konsantrasyon (Adım 4.2.1.) |
| LR Beyaz reçine | Sigma-Aldrich | L9774 | (Adım 4.2.4.) |
| Metilen mavisi | Sigma-Aldrich | M9140 | (Adım 4.2.5.) |
| Osmiyum Tetroksit | Sigma-Aldrich | O5500 | (Adım 4.2.3.) |
| Sodyum kakodilat trihidrat | Sigma-Aldrich | C0250 | 0.1M sodyum kakodilat tamponu (pH 7.2) hazırlamak için kullanın |
| Uranil Asetat | POCH | 868540111 | (Adım 4.2.4.) |
| Özel aletler, aletler | |||
| 30 mm Pteri kabı | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri kabı | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Hücre Kullanımlı Pipetleyici | RI Yaşam Bilimleri | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Yaşam Bilimleri | 8-72-4155/20 | |
| Isıtma Tablosu | SEMIC | Diğer markalar kullanılabilir | |
| İnkübatör | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Diğer markalar kullanılabilir |
| Steril petri kabı (10 cm) | NEST Biyoteknoloji | 704002 | |
| 0.2 & mikro ile steril şırınga filtreleri; m | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Termos | Quechua | 5602589 | Diğer markalar kullanılabilir |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste