Yöntem makalesi

Yenidoğan Farelerde Hipoksi-İskemi Sırasında Sürekli Video Elektroensefalogram

DOI:

10.3791/61346

⸱

11 Haziran 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Virginia, 2Department of Neurology, University of Virginia, 3Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 4Brain Institute, University of Virginia, 5Department of Neuroscience, University of Virginia

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede hipoksi-iskemi geçiren yenidoğan farelerde birden fazla derinlik elektrodu kullanılarak sürekli video EEG kayıtları için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hipoksi iskemi yenidoğan nöbetlerinin en sık nedenidir. Hayvan modelleri, yenidoğan nöbetleri ve hipoksi iskemisinin altında kalan mekanizmaları ve fizyolojiyi anlamak için çok önemlidir. Bu makalede, hipoksi iskemisi sırasında nöbetleri tespit etmek ve EEG arka planını analiz etmek için yenidoğan farelerinde sürekli video elektroensefalogram (EEG) izleme yöntemi açıklanmaktadır. Video ve EEG'nin birlikte kullanılması, nöbet semiyolojisinin tanımlanmasına ve nöbetlerin onaylanmasına izin verir. Bu yöntem ayrıca deneysel zaman dilimi boyunca güç spektrogramlarının ve EEG arka plan desen eğilimlerinin analizine izin verir. Bu hipoksi iskemi modelinde yöntem, yaralanmadan önce EEG kaydının normatif bir taban çizgisi elde etmesine ve yaralanma ve iyileşme sırasında iyileşmesine izin verir. Toplam izleme süresi, yavruların anneden dört saatten uzun süre ayrılamaması ile sınırlıdır. Bu yazıda hipoksik-iskemik nöbetlerin bir modelini kullanmış olsak da, yenidoğan video EEG izleme için bu yöntem kemirgenlerde çeşitli hastalık ve nöbet modellerine uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hipoksik iskemik ensefalopati (HIE) yılda 1000 yenidoğanda 1,5'ini etkileyen ve yenidoğan nöbetlerinin en sık nedeni olan bir durumdur1,2. Hayatta kalan bebekler serebral palsi, zihinsel engellilik ve epilepsi gibi çeşitli nörolojik engelliler için risk altındadır3,4,5.

Hayvan modelleri hipoksi iskemi ve yenidoğan nöbetlerinin patofizyolojisini anlamada ve araştırmada kritik bir rol oynar6,7. Modifiye vannucci modeli, doğum sonrası 10 (p10)7,8'de hipoksi iskemisini (HI) indük etmek için kullanılır. Bu yaştaki fare yavruları nörolojik olarak kabaca tam insan yenidoğanı terimine çevirir9.

Bu yaralanma modeli ile birlikte kullanılan sürekli video elektroensefalografi (EEG) izleme, yenidoğan hipoksik iskemik nöbetlerin daha iyi anlaşılmasına ve karakterizasyonuna olanak tanır. Önceki çalışmalar kemirgenlerdeki yenidoğan nöbetlerini analiz etmek için video kayıtları, sınırlı EEG kayıtları ve telemetri EEG kayıtları dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanmıştır10,11,12,13,14,15,16. Aşağıdaki yazıda, hipoksi-iskemi sırasında fare yavrularında sürekli video EEG kaydetme sürecini derinlemesine ele alıyoruz. Yenidoğan fare yavrularında sürekli video EEG izleme için bu teknik çeşitli hastalık ve nöbet modellerine uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan çalışmaları Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

1. Elektrot bina / kablo binası

  1. Dişi bir soket konnektörüne bağlı bir elektrot yapmak için tek kutuplu yalıtımlı paslanmaz çelik tel (0,005" çıplak çap, 0,008" kaplamalı) kullanın (dişi kap konnektörü 0,079).
  2. Hayvanları amplifikatöre bağlamak için özel yapım bir kablo kullanın.
    1. 4 kanallı bir birliğe erkek 4 pinli konnektör (Erkek konnektör 0,079") takın, operasyonel amplifikatörle (op-amp) eşleşen 4 kanallı birlik kazanç empedansı. 9 V bataryaya bağlanan kablolara 10K direnç takın. Op-amp'ye bağlı olmayan bir topraklama teli pilin orta noktası olarak işlev görür.
    2. Kablonun bir ucunun (AWG, 0,012" OD) op-amp'ye ve kablonun diğer ucunun amplifikatöre bağlanması.

2. Elektrot implantasyon ameliyatı

  1. Aşağı doğru bir akış başlığında% 4-5 izofluran ile yavruyu (doğum sonrası gün 9) uyuşturun. İşlemin başlamasından önce, yavrulara bupivacaine enjekte edin (0.02-0.05 mL, % 0.25 deri altı lokal infiltrasyon).
  2. Hayvan hareketsiz hale geldikten sonra, burun konisi ile stereotaktik bir aşamaya aktarın. Başı sabit tutmak yumuşak olduğu için kulak çubuğunun ters tarafını kullanın. Bu yaşta, yavrular kulak çubuğunun sivri ucını kullanmak için tam olarak gelişmiş bir kulağa sahip değildir.
  3. Izofluran akışını kısın ve% 2.5-3'te koruyun. Ameliyat prosedürü boyunca yavrunun sabit nefes alışını takip edin. Ağrı yanıtını kontrol etmek için kuyruğu kıstırın ve sonra kesi devam edin.
  4. Kafatasındaki kesi alanını betadin ve alkolle sterilize edin (3 döngü alternatif iyot ve% 70 etanol). Kesi bölgesinin görülebilecek şekilde çevredeki vücut kısmını örtün.
  5. Kafa derisini gözlerin biraz üstünden ön-arka açın ve yaklaşık 0,5 cm deriyi geri çek. Fare kafasını stereotaksik sahnede yeniden konumlandırın, böylece cilt açıkta kalan kafatasını dışarı doğru çeker.
  6. Pamuklu çubuk kullanarak kafatasına hidrojen peroksit uygulayın ve kafatasını neşter bıçağı kullanarak kazıyın. Kafatası çok yumuşaktır; kazıma yaparken dikkatli olun.
  7. Bir damla (yaklaşık 50 μL) yapıştırıcı uygulayın ve aplikatörünü kullanarak açıkta kalan kafatası bölgesine yayın. Yapıştırıcıyı ayarlamak için 40 sn UV ışığına maruz bırak.
  8. Referans olarak maruz kalan bregmayı kullanarak koordinatları ölçün. Hipokampus 'un CA1 bölgesinde [-3,5 mm Dorsal-Ventral (DV), ±2 mm Medial-Lateral (ML), -1,75 mm Derin (D)] ve parietal kortekste iki taraflı implant elektrotları [-1,22 mm DV, ±0,5 mm ML, -1 mm D] ve beyincikte bir referans elektrot17. İşaretli bölgede bir delik oluşturmak için 32 G iğne kullanın.
  9. Kafatasının yüzeyindeki kanı temizleyin. Kadın soket konektörüne stereotaksik kol yardımıyla takılan daha düşük elektrotlar beyne ve diş akrilik ile yerine sabitlenin. Elektrotları beyne yerleştir. Soket konnektör kulaklığı, diş akrilik ile birbirine yapışmış kafatasının üzerine oturur.
  10. Elektrot sabitlendikten sonra interskapular bölgeye ketoprofen (5 mg / kg) deri altından enjekte edin. Yavruları annenin arkasına koy.
    NOT: Çöplerin yarısını teker teker tanıtmak yerine anneye aynı anda kulaklıkla tanıtın. Bu, annenin yavrunun kulaklığını zarar vermesini önleyecektir.

3. EEG kurulumu ve kaydı (temel/yaralanma öncesi)

  1. Elektrot implantasyonundan sonra 24 saat iyileşmeden sonra, her hayvanı EEG kaydı için ısıtılmış (37 °C) özel yapım pleksiglas bir odaya yerleştirin. Bu oda aynı zamanda bir hipoksi odası olarak da hizmet verecektir.
  2. Odadaki yavruları esnek bir kablo (özel yapım op-amp kablosu) ile bir video-EEG izleme sistemine bağlayın.
    NOT: Kulaklık yerindeyken, fareler serbestçe hareket halindedir ve davranışlarda herhangi bir fark sergilemez. Elektrot tellerine bağlandıktan sonra, yavrunun oda boyunca serbestçe hareket edebilmesi için doğru miktarda gevşeklik sağlamak için teller oda bağı içinde ayarlanmalıdır.
  3. EEG verilerini 1000 Hz'de bir çim amplifikatörü kullanarak 1K kazançla dijitalleştirin. Daha sonra yazılımı (örneğin LabChart Pro) kullanarak EEG sinyalini (3-70 Hz arasında bant geçiş filtresi) gözden geçirin.
  4. Şahdamar ligasyon prosedürü için hayvanların bağlantısını kesmeden önce 30 dakika boyunca yaralanma öncesi temel EEG kaydedin.

4. Sol şahdamar ligasyonu

  1. Yavruyu (doğum sonrası gün 10) aşağı doğru bir akış başlığında% 4-5 izofluran ile uyuşturun ve bir su banyosu pedinde özel olarak düzenlenmiş kuruluma yerleştirin. Hayvan supine yerleştirin ve ön ayakları kağıt bantla sabitleyin.
    1. Izofluran akışını% 2-3'e düşürün. Ağrı tepkisi için kuyruğu kıstırın ve işlem boyunca nefes almayı izleyin.
  2. Boynun sol tarafındaki kesi alanını (mandibula ve köprücük kemiği arasında) betadin ve alkol (3 döngü alternatif iyot ve% 70 etanol) ile sterilize edin.
  3. Mikros makas kullanarak boynun sol tarafında yaklaşık 1 cm uzunluğunda bir kesi yapın. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, şahdamarını açığa çıkarmak için deri altı dokusunu ve cildi dikkatlice geri çekin. Vagus sinirini (artere yanal çalışan) tanımlamaya ve hassas bir şekilde ayırmaya ve arterden geri çekmeye özen edin.
  4. Mikroforceps kullanarak arterin altına 5 cm uzunluğunda steril ipek dikiş iplik. Tıkanmış akışa arterin etrafına çift düğümlü bir dikiş bağlayın.
  5. Fazla dikişi kesin ve deri altı dokusunu ve cildini geri çekerek maruz kalan arteri kapatın. Kesiği kapatmak için veteriner bağını kullanın.
  6. Hayvanı, ısınan bir şilteye yerleştirilen oda sıcaklığında bir odaya sürekli EEG izlemeye geri yerleştirin. Hazneyi açmamak için yavru çekirdek sıcaklığının nokta kızılötesi sıcaklık kontrollerini alın. Hayvanın hipoksiden önce 1 saat boyunca iyileşmesine izin verin.

5. EEG ve hipoksi

  1. FiO2'i (ilham alan oksijenin fraksiyonu) bir oksijen monitörü aracılığıyla oda içinde sürekli olarak izleyin.
  2. Hazneyi % 100 N2 için 60 L / dk N2 ve% 100 O2 için 0.415 L / dk ile yıkayın. Haznedeki oksijen doygunluğu %12'ye ulaştığında, O2 akışını değiştirmeden tutarken N2 akışını 10 L/dk'ya düşürin. Küçük ayarlamalarla FiO2'yi 45 dakika boyunca %8'de koruyun.
  3. 45 dakikalık hipoksi maruziyetinin ardından FiO2'yi %21'e döndürün.
  4. Yavruların odada iyileşmesini ve hipoksi sonrası 2 saat boyunca EEG'de izlenmesini sağla.
  5. Kayıt süresi tamamlandıktan sonra, fareleri EEG kaydından çıkarın ve anneye geri dönün.

6. EEG analizi

  1. EEG dosyasını LabChart Pro'da video ile analiz edin. Kör bir araştırmacının EEG'yi nöbetler ve arka plan desenleri için işaretlemesini söyle17. Nöbetler, net evrim ile yüksek frekanslı ritmik keskin dalga deşarjları (≥3x taban çizgisi) ile 10 saniyeden fazla süren elekrografik bir olay olarak tanımlanır17.
  2. İkinci bir kör araştırmacı incelemesinin anlaşma için rastgele işaretlenmiş olayları geçirmesini haline geçirin.
  3. İşaretli her elektrografik olay için ilişkili videoyu gözden geçirin ve yenidoğan kemirgen davranışsal nöbet skoruna göre analiz edin16. Kısaca, bu puan 0-6 arasında değişmektedir (hareketsizlik şiddetli tonik-klonik davranış). Nöbet semiyolojisini daha da karakterize etmek için, yanallık için davranışı analiz edin (multifokal/bilateral hareketler ve odak/tek taraflı vs. karışık).
  4. Bir güç spektrogramı oluşturun. 1024 veri noktası boyutuna sahip Cosine-Bell veri penceresine sahip hızlı fourier dönüşümü kullanın. %87,5'lik bir pencere çakışması yardımıyla spektrogramda düzgün bir x ekseni oluşturun. Gücü μV218 olarak ifade edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöbet semiyolojisi

Yenidoğan hipoksi-iskemi maruziyeti farelerde hem genelleştirilmiş hem de odak nöbetleriyle sonuçlanır (Şekil 1A-C). Video EEG kayıtları, elekrografik bulguların videodaki davranışla ilişkilendirilmesini sağlar. Bu davranışlar daha önce yayınlanan yenidoğan kemirgen davranışsal nöbet skoru (BSS)16 kullanılarak puanlanmıştır. BSS'ye ek olarak, olayları odak/tek taraflı, ikili veya karışık olup olm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hipoksik-iskemik nöbetler sırasında yenidoğan farelerde sürekli video-EEG izleme için bir model sunduk. EEG ile birlikte video analizi, nöbet semiyolojisinin karakterizasyonuna izin verir. EEG analizi, güç spektrogramlarının çıkarılmasına ve arka plan genlik analizine izin verir.

Elektrotların doğru ve dikkatli yerleştirilmesi bu protokolde çok önemlidir, çünkü elektrot yerleştirme veya yanlış yerleştirme sırasında yaralanma sonuçları önemli ölçüde etkileyebilir. Yaralanmadan önce normal temel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiç kimse.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki finansman kaynaklarını kabul ediyoruz: NIH NINDS – K08NS101122 (JB), R01NS040337 (JK), R01NS044370 (JK), Virginia Üniversitesi Tıp Fakültesi (JB).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SURGERY
Ball Point AplikatörüMetrex Research8300-Fi-bond aplikatörü
Kranioplast (Toz/Reçine)ColteneH00383Perm Reline/Power
I-BondKulzer GmbH, Almanya
LOOK İpek SütürCerrahi Uzmanlık CorporationSP115LOOK SP115 Siyah Örgülü İpek Emilmeyen cerrahi sütür
RS-5168 Botvin ForsepsRoboz Cerrahi AletRS5168Ameliyat/ligasyon için Forcep
RS-5138 Graefe ForsepsRoboz Cerrahi AletRS5138Ameliyat/ligasyon için Forcep
I-Bond Blast Lite için UV ışığıFirst MediaBL778I-bond
Vannas Mikrodiseksiyon Makasıiçin UV ışığıRoboz Cerrahi AletRS5618Ligasyon için Makas
Vet Bond3M Vetbond1469SBVet Tutkalı
HIPOKSI
HipoksidialStarr Yaşam Bilimleri
Oksijen sensörüTıbbi ÜrünlerMiniOxI- oksijen analizörü / hipoksi teçhizatı için sensör
<>EEG KAYITI
dişi priz konektörü 0.079 "Mill-Max Manufacturing Corp832-10-024-10-001000Digikey Çim Amplifikatöründen Sipariş Edildi
Natus Nöroloji Anonim ŞirketiÇim Ürünü
LabChart ProADI InstrumentsYazılımı Sistemi çalıştırmak için
Erkek Soket Konnektörü 0.079"Mill-Max Manufacturing Corp833-43-024-20-001000Digikey İşlemsel
AmplifikatörTexas Instruments, Dallas, TX, ABD'denTLC2274CDTLC2274 Dörtlü Düşük Gürültülü Ratıktan Raya İşlemsel
Amplifikatör İşlemsel AmplifikatörTexas Instruments, Dallas, TX, ABDTLC2272ACDRTLC2274 Dörtlü Düşük Gürültülü Raydan Raya İşlemsel Amplifikatör
Paslanmaz Çelik telSistemleri7914000.005 "Çıplak / 0.008" Kaplamalı 100 ft
Ultra Esnek TelMcMaster-Carr9564T136 Çeşitli renklerde gazlı bez teli
sipariş edildi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vasudevan, C., Levene, M. Epidemiology and aetiology of neonatal seizures. Seminars in Fetal & Neonatal Medicine. , (2013).
  2. Volpe, J., et al. Neonatal Seizures. Volpe's Neurology of the Newborn. , Elsevier. 275-321 (2018).
  3. Shankaran, S., et al. Network EKSNNR. Childhood outcomes after hypothermia for neonatal encephalopathy. New England Journal of Medicine. 366 (22), 2085-2092 (2012).
  4. Pappas, A., et al. Cognitive outcomes after neonatal encephalopathy. Pediatrics. 135 (3), 624-634 (2015).
  5. van Schie, P. E., et al. Long-term motor and behavioral outcome after perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy. European Journal of Paediatric Neurology. 19 (3), 354-359 (2015).
  6. Rensing, N., et al. Longitudinal analysis of developmental changes in electroencephalography patterns and sleep-wake states of the neonatal mouse. PLoS One. 13 (11), 1-17 (2018).
  7. Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurology. 9 (2), 131-141 (1981).
  8. Burnsed, J. C., et al. Hypoxia-ischemia and therapeutic hypothermia in the neonatal mouse brain--a longitudinal study. PLoS One. 10 (3), 0118889(2015).
  9. Semple, B. D., et al. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Progress in Neurobiology. , 1-16 (2013).
  10. Comi, A. M., et al. Gabapentin neuroprotection and seizure suppression in immature mouse brain ischemia. Pediatric Research. 64 (1), 81-85 (2008).
  11. Comi, A. M., et al. A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse. Pediatric Neurology. 31 (4), 254-257 (2004).
  12. Kadam, S. D., White, A. M., Staley, K. J., Dudek, F. E. Continuous Electroencephalographic Monitoring with Radio-Telemetry in a Rat Model of Perinatal Hypoxia-Ischemia Reveals Progressive Post-Stroke Epilepsy. Journal of Neuroscience. 30 (1), 404-415 (2010).
  13. Burnsed, J., et al. Neuronal Circuit Activity during Neonatal Hypoxic - Ischemic Seizures in Mice. Annals of Neurology. 86, 927-938 (2019).
  14. Sampath, D., White, A. M., Raol, Y. H. Characterization of neonatal seizures in an animal model of hypoxic-ischemic encephalopathy. Epilepsia. 55 (7), 985-993 (2014).
  15. Sampath, D., Valdez, R., White, A. M., Raol, Y. H. Anticonvulsant effect of flupirtine in an animal model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Neuropharmacology. 123, 126-135 (2017).
  16. Kang, S. K., et al. and sex-dependent susceptibility to phenobarbital-resistant neonatal seizures: role of chloride co-transporters. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-16 (2015).
  17. Zanelli, S., Goodkin, H. P., Kowalski, S., Kapur, J. Impact of transient acute hypoxia on the developing mouse EEG. Neurobiology of Disease. 68, 37-46 (2014).
  18. Lewczuk, E., et al. EEG and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2017).
  19. Wu, D., Martin, L. J., Northington, F. J., Zhang, J. Oscillating gradient diffusion MRI reveals unique microstructural information in normal and hypoxia-ischemia injured mouse brains. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1366-1374 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

S rekli Video EEGNeonatal Fare ModeliElektrot mplantasyon CerrahisiEEG KaydG Spektrogram AnaliziN bet TespitiKarotis Arter Ligasyonunspirasyonel Oksijen FraksiyonuVideo EEG zleme

İlgili makaleler