Yöntem makalesi

Mononükleer Fagositlerin Çok Parametreli Akış Sitometrik Analizi için Tüm Fare Gözlerinin Sindirimi

DOI:

10.3791/61348

⸱

17 Haziran 2020

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Medicine, Division of Rheumatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, monositler, mikroglia, makrofajlar ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere belirli oküler mononükleer fagositik popülasyonları tanımlamak için çok parametreli akış sitometrik analizi amacıyla tüm gözleri tek bir hücre süspansiyonuna sindirmek için bir yöntem sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğuştan gelen bağışıklık sistemi üveit, diyabetik retinopati ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu dahil olmak üzere oküler patofizyolojide önemli roller oynar. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, özellikle mononükleer fagositler, üst üste binen hücre yüzey belirteçlerini ifade eder, bu da bu popülasyonları tanımlamayı zorlaştırır. Çok parametreli akış sitometrisi, fare gözlerindeki monositleri, makrofajları, mikrogliaları ve dendritik hücreleri ayırt etmek için birden fazla hücre yüzey belirtecinin eşzamanlı, nicel analizine izin verir. Bu protokol, tüm fare gözlerinin enükleasyonunu, oküler diseksiyonu, tek bir hücre süspansiyonuna sindirimi ve miyeloid hücre belirteçleri için tek hücre süspansiyonunun lekelenmesini açıklar. Ek olarak, tek renk kontrolleri kullanarak voltajları belirlemek ve floresan eksi bir kontrol kullanarak pozitif kapıların sınırlandırması için uygun yöntemleri açıklıyoruz. Çok parametreli akış sitometrisinin en önemli sınırlaması doku mimarisinin olmamasıdır. Bu sınırlama, bireysel oküler bölmelerin çok parametreli akış sitometrisi veya ücretsiz immünoresans lekeleme ile aşılabilir. Bununla birlikte, immünofluoresans, nicel analiz eksikliği ve çoğu mikroskopta florofor sayısının azalması ile sınırlıdır. Lazer kaynaklı koroidal neovaskülarizasyonda mononükleer fagositlerin yüksek nicel analizini sağlamak için multi-parametrik akış sitometrisinin kullanımını açıklıyoruz. Ayrıca, çok parametreli akış sitometrisi, transkriptomik veya proteomik çalışmalar için makrofaj alt kümelerinin tanımlanması, kader haritalaması ve hücre sıralama için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğuştan gelen bağışıklık sistemi, kompleman aktivasyonunu ve iltihabı uyaran birden fazla hücre tipi içerir. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasında doğal öldürücü (NK) hücreler, mast hücreleri, bazofiller, eozinofiller, nötrofiller ve mononükleer fagositler bulunur. Monositler, makrofajlar ve dendritik hücrelerden oluşan mononükleer fagositler, üveit, diyabetik retinopati ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) dahil olmak üzere birden fazla oftalmik durum patofizyolojisinde yer1. Bu protokolde, neovasküler AMD2'ninbir fare modelinde çok parametreli akış sitometrik analizi kullanarak mononükleer fagositlerin tanımlanmasına odaklanacağız. Bu protokol diyabetik retinopati ve/veya üveit fare modelleri için uyarlanabilir, ancak bu hastalıkların sistemik doğası nedeniyle daha kapsamlı oküler diseksiyon önerilir.

Mononükleer fagositler çakışan hücre yüzeyi işaretleyicilerini ifade eder. Uzun ömürlü doku yerleşik makrofajlar ve mikroglia yumurta sarısı kese türevi eritromileoid progenitor3'ten kaynaklanırken, makrofajların ve dendritik hücrelerin geri dönüşümü kemik iliği türevi makrofaj dendritik hücre progenitor4'tenfarklıdır. Monositler, makrofajlar ve dendritik hücrelerde ortak olan fare hücresi yüzey işaretçileri CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17ve hücre içi işaretleyici Iba18 'iiçerir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, birden fazla dokudan gelen makrofajların, monositlerin ve dendritik hücrelerin transkriptomik analizi CD64'ü makrofaja özgü bir hücre yüzeyi işaretleyicisi olarak tanımlar6. Makrofajlar sağlıklı gözlerde iris, koroid, silier vücut ve optik sinirde tanımlanmıştır3. Alternatif olarak, dendritik hücre tanımlaması daha zordur; dendritik hücre tanımlamanın en özel yöntemi, Zbtb46-GFP muhabirfaresi 9kullanılarak kader eşlemesi gerektirir. Bu muhabir satırından bağımsız olarak, CD64 yokluğu ile birlikte CD11c ve MHCII ifadesi potansiyel dendritik hücreleritanımlayabilir 6,10. Normal gözlerde kornea, konjonktiva, iris ve koroidde dendritik hücreler tanımlanmıştır11. Mikroglia retinada bulunan, kan-retina bariyeri ile korunan ve yumurta sarısı kesesi progenitör hücrelerinden elde edilen özel makrofajlardır12. Sonuç olarak, retinal mikroglia monosit türevi makrofajlardan CD45 ekspresyon13 loş seviyeleri ve akış sitomemetri antikoru 14 olarak kullanılabilen yüksek Tmem119 seviyeleri ile ayırt edilebilir. Bununla birlikte, mikroglia aktivasyonu üzerine, CD45 yukarı regüle edilebilir15 ve Tmem119 aşağı düzenlenmiş olabilir3Mikroglia biyolojisinin karmaşıklığını gösteren ve bu muhtemelen hem AMD hem de fare modelinde geçerlidir. Son olarak, monositler klasik ve klasik olmayan dahil olmak üzere en az iki alt tipe ayrılabilir. Klasik monositler CCR2+Ly6CyüksekCX3CR1düşük ifadesini gösterir ve klasik olmayan monositler CCR2-Ly6CdüşükCX3CR1yüksek işaretleyicilerigösterir 5.

İşaretçi ekspresyonunun nicel analizinin gerekliliği nedeniyle, yani yüksek ve düşük/loş seviyeler, çok parametreli akış sitometrisi, göz ve diğer dokulardaki monositler, makrofajlar, mikroglia ve dendritik hücreler arasında ayrımcılık için ideal bir yöntemdir. Ek avantajlar arasında alt popülasyonların tanımlanması, hücre popülasyonlarını transkriptomik veya proteomik analiz için sıralamak için floresanla etkinleştirilen hücre sıralamasını (FACS) kullanma yeteneği ve kader haritalaması saydır. Çok parametreli akış sitometrisinin en büyük dezavantajı doku mimarisinin olmamasıdır. Bu, oftalmik diseksiyonun çeşitli oküler alt bölümlere girmesiyle aşılabilir: kornea, konjonktiva, iris, lens, retina ve koroid-sklera kompleksi. Ek olarak, doğrulayıcı immünofluoresans görüntüleme yapılabilir, ancak belirteç sayısı ve sağlam miktar eksikliği ile sınırlıdır.

Genom geniş ilişki çalışmaları AMD16ile birden fazla tamamlayıcı gen bağlamaktadır. Kompleman aktivasyonu anafilatoksin üretimine, lökosit alımına ve ortaya çıkan iltihaplanmaya yol açar. Kompleman reseptör eksikliği olan farelerde lazer yaralanması mononükleer fagosit alımını ve lazer kaynaklı koroidal neovaskülarizasyon (CNV) alanını azaltır17. Benzer şekilde, dokuya monosit alımında eksik olan C-C motifli kemokin reseptörü 2 (CCR2) nakavt faresi, hem mononükleer fagosit alımının azaldığını hem de lazer kaynaklı CNV alanı18. Bu veri bağlantısı, deneysel CNV ve muhtemelen neovasküler AMD ile mononükleer fagositleri tamamlar ve tamamlar. Bu ilişkiyi desteklemek için, kompleman reseptörleri neovasküler AMD19,20olan hastalarda periferik kan monositleri üzerinde disregüle edilir. Bu veriler AMD ve mononükleer fagositler arasında güçlü bir ilişki olduğunu göstermektedir.

Bu yazıda, çok parametreli akış sitometrisi kullanarak fare gözündeki mononükleer fagosit popülasyonlarını karakterize etmek için deneysel lazer kaynaklı CNV modelini kullanacağız. Lazer kaynaklı CNV, mevcut ilk hat neovasküler AMD tedavisinin etkinliğini gösteren neovasküler AMD'nin standart fare modelidir21. Bu protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu, oküler diseksiyonu, tek hücreli süspansiyona sindirimi, antikor boyama, tek renk kontrolleri kullanılarak lazer voltajlarının belirlenmesi ve floresan eksi bir (FMO) kontrolleri kullanılarak gating stratejisini tanımlayacaktır. Lazer kaynaklı CNV modelinin ayrıntılı bir açıklaması için lütfen önceki bir yayına bakın22. Bu protokolü kullanarak mikroglia, monositler, dendritik hücreler ve makrofaj popülasyonlarını tanımlayacağız. Ayrıca, lazer kaynaklı CNV modeli içinde makrofaj alt kümelerini daha fazla tanımlamak için MHCII ve CD11c'yi kullanacağız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm prosedürler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. C57BL/6 fareleri Northwestern Üniversitesi Karşılaştırmalı Tıp Merkezi'ndeki (Chicago, IL) bir bariyer tesisinde grup tarafından barındırıldı. Tüm hayvanlar, yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile 12/12 saat açık / karanlık döngüde barındırıldı.

1. Oküler doku koleksiyonu

  1. Her iki cinsiyette de 10-12 haftalık C57BL/6J fareleri, fare tepkisiz kalana ve artık solunamayana kadar karbondioksitin düzenlenmiş yönetimini kullanarak kurban edin. Ötanaziyi sağlamak için servikal çıkık veya diğer onaylanmış ikincil yöntemi gerçekleştirin.
    NOT: Oküler dokularda olmayan dolaşımdaki lökositleri çıkarmak için transkardiyal perfüzyon yapılabilir. Bu deneyde, sistemik perfüzyon, tedavi edilmemiş veya lazerle tedavi edilmiş tüm gözlerde tespit edilen mikroglia, monositler, makrofajlar veya dendritik hücrelerin sayısını azaltmaz. Bu nedenle, bu hücre tiplerinin çoğunluğu oftalmik dokularda bulunur ve bu adım isteğe bağlıdır.
  2. Gözleri enükle etmek için, prizden çıkarken gözün altına hafifçe bir çift kavisli tokmak yerleştirirken göz çukurunun yakınına bastırın. Gerçek gözü sıkmadan gözün altında kapalı olanpsları kıstırın. Gözü çevredeki konjonktivadan sökün (lütfen önceki yayına bakın)23.
  3. Optik sinir gözü ayırmak için kalan tek bağlantı olana kadar gözü yanal olarak çekin. Optik sinir genellikle gerginlikle kesilir, ancak optik siniri kesmek için bazen küçük bir makas gereklidir. Gözü 1,7 mL mikrosantrifüj tüpünde kalsiyum ve magnezyum ile soğuk 1x Hank'in Tamponlanmış Tuzlu Çözeltisine (HBSS) yerleştirin.

2. Oküler dokunun sindirimi

  1. Soğuk HBSS'de 0.1 mg/mL sindirim enzimi ve 0.2 mg/mL DNaz içeren sindirim tamponunu hazırlayın. Başlangıçta 2 mL steril suda 5 mg sindirim enzimini yeniden inşa edin. HBSS'de 10 mg/mL DNase ilk seyreltme hazırlayın. Sindirim tamponunun her 10 mL'si için (3 hayvan için yeterli) 9,4 mL soğuk HBSS'yi 0,4 mL yeniden inşa edilmiş sindirim enzimi ve 0,2 mL seyreltilmiş DNase I ile karıştırın.
    NOT: Bu konsantrasyonlar, hücre ölümünü azaltırken, tek hücrelerin optimal antikor lekeleme seviyelerini sağlamak için birden fazla deneyde ampirik olarak belirlendi. Kollajenaz D, hücre canlılığı azaltılmış ve CD45+ hücreler azalmış sindirim enzimine alternatif olarak denenmiştir. Sindirimi en iyi duruma getirmek için yinelemeli işlemle ilgili daha fazla ayrıntı için lütfen Tartışma'ya bakın.
  2. 10x toplam büyütmede bir diseksiyon mikroskobu altında, soğuk HBSS'de ince tokmaklar ve yay makası kullanarak kalan konjonktivayı ve optik siniri çıkarın.
  3. Temiz gözleri kuru bir diseksiyon kabına veya küçük bir tartım teknesine taşıyın. Sindirim tamponu çıkışı için gözde görsel eksenden ve bu ilk yaradan 90° uzağa iki delikli yara yapıldıktan sonra vitreus boşluğuna 30 G iğne ile donatılmış şırınga ile 0,15-0,20 mL/göz sindirim tamponu enjekte edin.
  4. 0,5 mm x 0,5 mm'den küçük tüm parçalarla yay makası ve ince askılar kullanarak tüm gözleri kıymalayın. Sonraki adımlarda pipet uçlarının tıkanmasını önlemek için lens dokusunu tokalar aracılığıyla künt mekanik bozulma ile ayrıştırmak. Her numune için, her biri 0,75 mL sindirim tamponu ile forseps ve makası küçük bir tabakta durulayın. Her örnek için yeni bir tabak kullanın.
  5. Pipet transferinde herhangi bir malzeme kaybetmemeye dikkat ederek P1000 pipet kullanarak yemeğin içeriğini buz üzerindeki bir ayrışma tüpüne aktarın. Yemeği ek 1,5 mL sindirim tamponu ile durulayın ve ayrışma tüpündeki toplam hacmi 3,25-3,50 mL'ye getirin.
  6. Dissosiyatif tüpü elektronik ayrıştırıcıya ters yerleştirin ve önceden yüklenmiş bir program olan oda sıcaklığında 200 rpm'de 1 dakika tek yönlü rotasyondan oluşan "m_brain_03_01" döngüsünü çalıştırın. Tüm dokunun sindirim tamponu ve bunun için rotor ve kalan tüm adımlarla temas halinde ayrışma tüpünün altında olduğundan emin olun.
  7. Ayrışma tüpünü 37 °C'de 200 rpm'de 30 dakika boyunca sallama inkübatörüne yerleştirin.
  8. 2.6 ve 2.7. İkinci 30 dk inkübasyondan sonra, adım 2.6'da olduğu gibi elektronik ayrıştırıcı kullanarak son bir mekanik sindirim gerçekleştirin.
  9. 10 mL soğuk akış tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun ve tüpleri buza yerleştirin.

3. Hücre süspansiyonunun hazırlanması

  1. Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için, durdurulan göz sindirim reaksiyonunu 50 mL konik santrifüj tüpünün üstüne yerleştirilmiş 40 μm'lik bir filtreden dökün. Pistonu 2,5 mL şırıngırdan kullanarak, kalan sindirilmemiş göz dokusu parçalarını filtreden geçirin.
  2. Sindirilmemiş göz dokusu parçalarını filtreden tekrar geçirmek için aynı pistonu kullanmadan önce ayrışma tüpünü 10 mL Akış tamponu ile yıkayın ve filtreyi durulayın.
  3. 5 mL Akış arabelleği kullanarak 3.2 adımını yineleyin.
  4. Ayrışma tüpünü yıkayın ve son 10 mL Akış tamponu ile filtreleyin.
    NOT: Toplam sindirim hacmi ve akış tamponu her numune için yaklaşık 38-40 mL'dir.
  5. Konik tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj edin. Hücre peletini bozmadan süpernatantı dekant.
  6. Steril suya 10x lysing çözeltisi ekleyerek 1x lising çözeltisi hazırlayın. Tüpü başka bir tüpe vurarak peletı parçala. Kırmızı kan hücrelerini lyse etmek için, oda sıcaklığında (RT) dönen 30 s için 1 mL 1x lising çözeltisi ekleyin.
  7. 20 mL Akış arabelleği ile reaksiyonu durdurun.
  8. Konik tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj edin. Hücre peletini bozmadan süpernatantı dekant.
  9. Tüpü başka bir tüpe vurarak peletin ayrıştırın. Tüp başına 5 mL soğuk 1x HBSS ekleyin.
  10. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj tüpler. Aspirat süpernatant.

4. Mononükleer fagositler için hücre süspansiyonunun lekelenerek boyanır

  1. Soğuk HBSS'de Canlı/Ölü boyası 1:5.000 seyrelterek numune başına 0,5 mL Canlı/Ölü lekesi hazırlayın.
  2. Peletin tamamen ayrıştırmasını sağlamak için bir P1000 pipet kullanarak her numuneye Canlı/Ölü lekesi ekleyin. Numuneleri 1,2 mL mikro titre tüplerine aktarın.
  3. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak için küçük bir aliquot (10 μL) alın (bkz. 4.4). Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca Canlı / Ölü lekeli örnekleri kuluçkaya yatırın.
  4. Örnek başına canlı hücre sayısını belirlemek için Trypan mavisini kullanarak hücreleri sayın.
    NOT: Tipik olarak, 10-12 haftalık bir C57BL/6J fareden 2 göz, 2 x 106'dan az canlı hücre içerir.
  5. Numuneleri 400 μL soğuk Akış tamponu ekleyerek yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin.
  6. Hücreleri 500 μL soğuk Akış tamponunda tamamen yeniden depolar. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin.
  7. 50 μL Fc bloğunda 5 x10 6 canlı hücreyi bloke edin (saflaştırılmış sıçan fare önleyici CD16/CD32'nin soğuk Akış tamponunda 1:50 seyreltme). 5 x 106'dan fazla canlı hücre varsa, hacimleri uygun şekilde artırın.
  8. Numuneyi tamamen dağıttığından emin olarak peletin içine Fc bloğu ekleyin. 4 °C'de 20 dakika kuluçkaya yaslanın.
  9. 5 x 10 6 canlı hücre başına doğrudan Fc bloğundaki hücrelere 50 μL antikor boyama çözeltisi ekleyin (çözeltiye dahil edilen her antikorun seçimi ve miktarı için Tablo1'e bakın) ve tamamen karıştırın. 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
    NOT: Antikor miktarları akış sitometresi konfigürasyona bağlıdır ve her laboratuvar ve cihaz için bağımsız olarak titratlanmalıdır. Filtrelerin ve aynaların cihaz yapılandırması için Tablo 2'ye bakın. Antikorları titratlamak için üreticinin önerisiyle başlayın ve boyama indeksini hesaplayın. Değişen antikor konsantrasyonlarının bir test çalışmasını gerçekleştirin (üreticinin tavsiyesinin hem üstünde hem de altında) ve boyama indeksinin tutulduğu en düşük antikor konsantrasyonu seçin. Ayrıca, tek renk kontrolünden daha az parlak pozitif boyama olduğundan emin olun. Negatif lekeli hücrelerin ölçek üzerinde olduğundan ve 1 x 102'deveya daha az bir tepeye sahip olduğundan emin olmak için lekelenmemiş hücreleri kullanın. Pozitif lekeli hücreleri tanımlamak için floresan eksi bir kontrol kullanın.
  10. Numuneleri 700 μL soğuk Akış tamponu ekleyerek yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin.
  11. İsteğe bağlı olarak, antikor boyamadan sonra, numuneler Akış tamponunda% 2 paraformaldehitin 500 μL'si ile sabitlenebilir. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika sabitlayın. Ardından, 4.10'da açıklandığı gibi bir yıkama gerçekleştirin. Sabit numuneleri 4 °C'de saklayın. Akış sitometrisi veri toplama gününde sayım boncukları eklenmelidir. Sabit numuneler 1-2 gün içinde akış sitometresinde çalıştırılmalıdır.
    DİkKAT: Paraformaldehit aşındırıcı ve sağlık açısından zararlıdır.
  12. Numuneleri 500 μL soğuk Akış tamponu kullanarak tekrar yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantın yarısını aspire edin.
  13. Peletleri yeniden alıp 96 kuyuya, U-bottom test plakasına aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj plakası. Süpernatantı dekante etmek için, plakayı ters çevirin ve güçlü bir sallamada sıvıyı rahatsız edici bir pelet olmadan bir lavabo havzasına yerinden sökün.
  14. Yeni bir 1,2 mL mikro titre tüpüne, 50 μL iyi girdaplı sayım boncukları yerleştirin.
  15. Peletleri 200 μL soğuk Akış tamponunda 96 kuyu plakasında yeniden depolar. Önceki adımdan itibaren boncukların üstüne hücre karışımı ekleyin. Toplam 250 μL / mikro titre tüpü hacminde akış sitometresi üzerinde çalıştırın.

5. Akış sitometrisi verilerinin toplanması

  1. Akış sitometresi açın ve hazırlayın. Burada listelenen talimatlar değiştirilmiş dört lazer sitometresi içindir (Tablo 2).
  2. Tüm hücrelerin her dedektör için ölçekte olduğundan emin olmak için her örnekten küçük bir aliquot içeren bir test örneği çalıştırın. Voltajları tüm hücrelerin ölçeğinde olacak şekilde ayarlayın.
  3. Boyama kokteylinde kullanılan her florofor için tek renk kontrolleri (SCC) çalıştırın(Tablo 3). Mikro titre tüpünü akış sitometresi aşamasına yerleştirmek için daha büyük bir 5 mL polistiren tüpe yerleştirin.
    NOT: BV421 (Pasifik Mavisi), FITC, PE, Alexa647 (APC) ve Alexa700 gibi kök floroforları kokteylle aynı antikoru gerektirmez (örneğin, CD64 PE için CD19 PE). Bununla birlikte, PE-CF594, PE-Cy7 veya APC-Cy7 gibi tandem floroforlar, konjuge floroforların potansiyel ayrışması nedeniyle SCC için kokteyl ile aynı antikoru gerektirir.
    1. 1,2 mL'lik titre tüpüne 2 damla kompanzasyon boncukları ve 1 μL hamster anti-mouse CD11c BV421 ekleyerek BV421 için SCC'yi oluşturun. CD11c BV421, 5.3.3'te açıklandığı gibi kappa yerine bir IgG lambda alt tipi olduğundan kompanzasyon boncukları kullanılır. 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yaslanın. 0,2 mL akış arabelleği ekleyin.
    2. Amin reaktif boncuklardan bir damla pozitif boyama boncukları (yeşil kapak) ve ardından 1 μL Canlı / Ölü boya ekleyerek Canlı / Ölü boyası için SCC oluşturun. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Amin reaktif boncuklarından negatif boncuklardan (beyaz kapak) bir damla ekleyin. 0,2 mL akış arabelleği ekleyin.
    3. Anti-sıçan ve anti-hamster Ig kappa boncuk setinden bir damla pozitif boyama boncukları (yeşil kapak) ekleyerek kalan SCC'leri oluşturun, ardından 1,2 mL'lik bir titer tüpünde listelenen antikor miktarı (Tablo 3). 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yaslanın. Anti-sıçan ve anti-hamster Ig kappa boncuk setinden negatif boncuklardan (beyaz kapak) bir damla ekleyin. 0,2 mL akış arabelleği ekleyin.
    4. Girdap tüm boncuk karışımları tamamen. SCC'leri 4 °C'de 3 güne kadar saklayın.
      NOT: Floresan muhabir fareler için SCC, tespit edilmemiş hücrelerdir.
    5. SCC'leri çalıştırırken, SCC örneğinin aynı dedektör kanalındaki bir hücre örneği için herhangi bir floresandan daha yüksek bir tepeye sahip olacak şekilde voltajları ayarlayın. Buna ek olarak, herhangi bir SCC'nin ilgi kanalındaki histogram zirvesi ile diğer kanallar arasında en az 0,5 Log farkı olacak şekilde voltajlar ayarlanmalıdır (Şekil 1).
  4. Olayları/saniyeyi 4000'in altında tutarak "Düşük" üzerinde örnekler çalıştırın. Akış hızı uygun şekilde düşürülemezse, numuneleri ek soğuk akış tamponu ile seyreltin. Sayım hesaplaması için gerekli olacağından eklenen birimi kaydedin (bkz. temsili sonuçlar).
  5. Örnek başına en az 3 x 106 olay toplayın. Bu, pigment granülleri ve sitometrenizdeki olaylar olarak sayan döküntüler nedeniyle hücre sayısından daha yüksek olabilir.
  6. Bölüm 6.4'te uygun gating stratejisi için Live/Dead dışındaki her florofor için bir Floresan Eksi Bir (FMO) kaydedin. FDO, biri hariç tüm floroforlarla boyanmış bir örnektir.
  7. Akış sitometresini üretici veya tesis talimatlarına göre temizleyin ve kapatın.

6. Akış sitometrisi verilerinin ek açıklaması

  1. Çözümleme yazılımını kullanarak yeni bir çalışma sayfası açın. Tüm örnekler ve tek renkli kontroller için FCS dosyalarını sitometreden içe aktarın.
  2. Ücret matrisi oluşturmak için SCC'leri kullanın.
  3. Kompanzasyon matrisini lekeli örneklerinize ve IPO'larınıza uygulayın.
  4. Kapıları çizmek için pozitif boyamayı belirlemek için IPO'ları kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1, SCC'ler ve kırmızı lazer hücreleri için telafi edilmemiş frekans histogramları gösterdi: Alexa647, Alexa700 ve APC-Cy7. Şekil 1A'da,macenta çizgisi Alexa647 için SCC'nin zirvesini gösterirken, camgöbeği çizgisi hedeflenen 0,5 Günlük farkını göstermiştir. Alexa700 ve APC-Cy7'deki tepe noktasının siyan hattının solunda (daha az parlak) olduğuna dikkat edin. Ayrıca, hücrelerin hepsinin macenta çizgisinin solunda olduğunu unutmayın. SCC zirvesinin sağındaki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok parametreli akış sitometrisi, karmaşık bir dokudaki birden fazla hücre tipinin nicel analizini sağlar. Bu raporda, fare gözünde lazer yaralanmasından sonra monositler, dendritik hücreler ve makrofaj alt kümeleri de dahil olmak üzere mononükleer fagosit popülasyonlarının akış sitometrik tespitini açıklıyoruz. Liyanage ve arkadaşları son zamanlarda nötrofilleri, eozinofilleri, lenfositleri, DC'leri, makrofajları, sızan makrofajları ve monositleri tespit etmek için benzer bir gating stratejisi bildirdi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JAL, NIH hibesi K08EY030923 tarafından desteklendi; CMC, NIH Ulusal Artrit ve Kas-İskelet Hastalıkları Enstitüsü'nden K01 hibesi (5K01AR060169) ve Lupus Araştırma Birliği'nden Yeni Araştırma Hibesi (637405) ile desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,6 ml mikrosantrifüj tüpleriFisher Scientific05-408-120
1,7 ml mikrosantrifüj tüpleriCostar3620
10 ml pipetlerFisher Scientific431031
15 ml konikThermoFisher339650
1x HBSS, 500 mlGibco14025-092
2,5 ml şırıngaHenke Sass Wolf7886-1
%20 paraformaldehit çözeltisiElektron Mikroskobu Bilimleri15713-S
25 ml pipetlerFisher Scientific431032
30 G iğneExel26437
3ml luer kilitli şırıngaFisher Scientific14955457
41 x 41 x 8 mm polistiren tartım kabıFisher Scientific08-732-112
50 ml koniklerFalcon352070
96 kuyulu, kapaksız U-dipli tahlil plakasıFalcon353910
Amin reaktif boncuklarThermoFisherA10628
Analiz yazılımıFlowJov 10
Anti-sıçan ve anti-hamster Ig kappa boncuk setiBD Biosciences552845
C57BL/6J farelerJackson Laboratuvarı664
Hücre sayacıInvitrogenAMQAX1000
Hücre sayacı slaytlarıInvitrogenC10283
Kompanzasyon boncuklarıThermoFisher01-1111-42
Sayım boncuklarıThermoFisher01-1234-42
Kavisli forsepsFisher Scientific16-100-123
Sindirim enzimiSigma Aldrich5401020001
Diseksiyon mikroskobuUlusal Optik ve Bilimsel Aletler, Inc.DC3-420T
Ayrışma tüpleriMiltenyi Biotec130-096-334
DNaseRoche10104159001
Elektronik ayrıştırıcıMiltenyi Biotec130-095-937
FACS Diva yazılımıBD Biosciences
Fc bloğu, sıçan anti-fare CD16 / CD32BD Biosciences553142
İnce forsepsIntegra Miltex17035X
Akış tamponuMiltenyi Biotec130-091-221
Akış sitometresiBD Biosciences
Akış tüpleriFalcon352008
Hamster anti-fare CD11c BV421BD Biosciences562782
Buz kovasıFisher Scientific07-210-123
Canlı/Ölü boyaThermoFisher65-0866-14
Lizing solüsyonu, 10x solüsyonBD Biosciences555899
Mikro titre tüpü ve rafFisher Scientific02-681-380
Fare anti-fare CD64 PEBioLegend139304
Fare anti-fare NK1.1 PECF594BD Biosciences562864
P1000 pipet uçlarıDenville ScientificP2404
P1000 pipetleyiciGilsonFA10006M
P2 pipet uçlarıeppendorf22491806
P2 pipetleyiciGilsonFA10001M
P20 pipetleyiciGilsonFA10003M
P200 pipet uçlarıDenville ScientificP2401
P200 pipetleyiciGilsonFA10005M
Pipet adamFisher ScientificFB14955202
Sıçan anti-fare B220 PECF594BD Biosciences562313
Sıçan anti-fare CD11b APC-Cy7BD Biosciences557657
Sıçan anti-fare CD19 AlexaFluor 700BD Biosciences557958
Sıçan anti-fare CD19 PEBD Biosciences553786
Sıçan anti-fare CD4 PECF594BD Biosciences562314
Sıçan anti-fare CD45 FITCThermoFisher11-0451-82
Sıçan anti-fare CD45 PE-Cy7BD Biosciences552848
Sıçan anti-fare CD8 PECF594BD Biosciences562315
Sıçan anti-fare Ly6CBD Biosciences
Sıçan anti-fare Ly6G PECF594BD Biosciences562700
Sıçan anti-fare MHC II AlexaFluor 700BioLegend107622
Sıçan anti-fare Siglec F PECF594BD Biosciences562757
Sıçan anti-fare Tim4 AlexaFluor647BD Biosciences564178
Sallama inkübatörüLabnet311DS
Yaylı makasGüzel Bilim Araçları15024-10
Steril hücreli süzgeç, 40 mm naylon ağFisher Scientific22363547
Steril su, 500 mlGibcoA12873-01
Sallanan kova santrifüjüeppendorf5910 R
Tripan mavisi, %0,4 çözeltiGibco15250061
561085

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
  2. Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
  3. O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
  4. Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
  5. Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56(2012).
  6. Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
  7. Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099(2019).
  8. Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935(2013).
  9. Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
  10. Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313(2014).
  11. Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
  12. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  13. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636(2016).
  14. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  15. Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
  16. McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
  17. Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
  18. Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
  19. Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
  20. Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
  21. Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
  22. Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502(2015).
  23. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814(2011).
  24. Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
  25. Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
  26. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  27. Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
  28. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ok Parametreli Ak SitometrisiFare G z DigestyonuTek H cre S spansiyonuH cre Y zey MarkerlarFloresan Eksiltme Bir FMOAk Sitometrisi GatingMakrofaj Alt GruplarMikroglia Tan mlamaDendritik H cre Analizi

İlgili makaleler