Yöntem makalesi

Klamidya Trachomatis'te Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım

DOI:

10.3791/61365

⸱

10 Haziran 2020

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Idaho

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Klamidya trachomatisgelişimsel mutantları tanımlamak ve izole etmek için yönlendirilmiş ileri genetik yaklaşımda floresan organizatör-muhabirler, canlı hücre mikroskobu ve bireysel dahil çıkarma kullanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre içi bakteriyel patojen Klamidya trachomatis iki morfolojik ayrık gelişim formundan oluşan bir gelişim döngüsünden geçer. Replikatif olmayan temel cisim (EB) konaklayıcının enfeksiyonunu başlatır. Bir kez içinde, EB reticulate vücut (RB) içine ayırt eder. RB daha sonra bulaşıcı EB formuna geri ayırt etmeden önce, çoğaltma birden fazla tur uğrar. Hücre türleri arasında geçiş başarısızlığı ya ana konak işgali veya çoğaltma önler gibi bu döngü klamydial sağkalım için gereklidir.

Klamidya'nın zorunlu hücre içi doğasınedeniyle genetik tekniklerde sınırlamalar hücre tipi gelişiminde rol oynayan moleküler mekanizmaların tanımlanmasını engellemiştir. Canlı hücre mikroskobu ile birlikte hücre tipi anahtarlamanın gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine olanak tanıyan yeni bir çift promotör-muhabir plazmid sistemi tasarladık. Hücre tipi gelişimin düzenlenmesinde yer alan genleri belirlemek için, canlı hücre promotör-muhabir sistemi, çift muhabir in kimyasal mutagenezi birleştirerek ileri genetik bir yaklaşım geliştirilmesi için kaldıraçlı, görüntüleme ve altered gelişimsel kinetik ile Klamidya izleme, mutantların klonal izolasyon izledi. Bu ileri genetik iş akışı genetik yollar geniş bir yelpazede içine yönlendirilmiş sorgulama için değiştirilebilir esnek bir araçtır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klamidya trachomatis (Ctr) onun hayatta kalma ve proliferasyon için gerekli olan bir bifhasik gelişim döngüsü ile ilerler zorunlu bir hücre içipatojen1. Bu döngü iki gelişimsel formdan oluşur: temel gövde (EB) ve retikülat gövdesi (RB). EB çoğaltma yetersiz ama etkili veya indüklenen endocytosis2ile hücre invazyonu aracılık . Bir kez ana bilgisayarda, EB çoğaltıcı RB olgunlaşır. RB, sonraki enfeksiyon turlarını başlatmak için EB'ye geri dönmeden önce birden fazla çoğaltma turu yapar.

Genetik araçların sınırlı dizi biyokimyasal çalışmalar veya vekil sistemlerin kullanımı için klamydial araştırma çoğu kısıtlamıştır. Sonuç olarak, gen regülasyonu ve gelişim döngüsünün kontrolü açıklaması zor olmuştur3,4. Klamydial alanında daha önemli sorunlardan biri klamydial gelişim döngüsünün yüksek çözünürlüklü zamansal izleme ve onun düzenlenmesinde yer proteinlerin belirlenmesidir. Klamydial gelişim döngüsü sırasında gen ekspresyonu geleneksel RNAseq, qPCR ve sabit hücre mikroskobu5dahil yıkıcı "bitiş noktası" yöntemleri ile yapılmıştır 5,6. Bu yöntemler paha biçilmez bilgiler sağlasa da, kullanılan teknikler zahmetli dir ve düşük zamansal çözünürlüğesahiptir 5,6.

Son on yıl içinde, Ctr genetik manipülasyon plazmid dönüşüm ve mutagenesis,7,8,9için yöntemlerin giriş ile ilerlemiştir. Bu çalışma için, plazmid tabanlı bir sistem bir enfeksiyon boyunca gerçek zamanlı olarak bireysel inklütal gelişimi izlemek için geliştirilmiştir. Bir chlamydial transformant hem bir RB ve EB hücre tipi özel organizatör-muhabir ifade oluşturuldu. RB özel muhabiri floresan protein Yonca erken RB gen euo upstream organizatörü eriterek inşa edilmiştir. EUO geç EB ilişkili genlerin bir alt kümesi bastırır transkripsiyondüzenleyici10. HCTBorganizatörü , EB nükleoid yoğuşması dahil bir histon benzeri protein kodlar, doğrudan mKate2 (RFP) upstream EB özel muhabir oluşturmak için klonlandı11. hctBprom-mKate2/euoprom-Clover için omurga p2TK2SW27oldu. HctB ve euo organizatörleri Ctr-L2 genomik DNA'sından güçlendirilmiştir. Her organizatör dizisi belirtilen klamydial gen artı ilgili ORF ilk 30 nükleotit (10 amino asit) için öngörülen transkripsiyon başlangıç alanının yukarı ~ 100 baz çiftleri oluşuyordu. Floresan FP varyantları ticari olarak Ctr kodonu optimize gen blokları olarak elde edildi ve her bir klamydial gen ve promotör ilk 30 nükleotit ile çerçeve içinde klonlanmış. IncD terminatör doğrudan mKate2 aşağı klonlanmış oldu. İkinci organizatör-muhabir incD terminatör aşağı yerleştirildi. P2TK2SW2'deki ampisilin direnç geni(bla)pBam4'ten aadA geni (Spectinomycin direnci) ile değiştirildi. Bu son yapı p2TK2 sonuçlandı-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Şekil 1A) Ctr-L27dönüştürülmüştür . Bu RB/EB muhabiri, canlı hücre mikroskopisi kullanılarak tek dahil ler içinde gelişim döngüsünün gözlemlemesine olanak sağlar (Şekil 1B,C).

Organizatör-muhabir yapımımızı kimyasal mutagenez ile birlikte kullanan bir protokol, Ctr serovar L2'nin mutajenleşmiş popülasyonlarından gelişimsel anormallikler sergileyen bireysel klonları izlemek ve izole etmek için bir protokol geliştirildi. Bu protokol, tek tek klamydial inklüetlerin doğrudan izlenmesine, zaman içinde gen ekspresyonunun izlenmesine, değişmiş bir gelişimsel gen ekspresyonu deseni ifade eden klamyal klonların tanımlanmasına ve Klamidya'nın tek tek içermelerden klonal izolasyonuna olanak sağlar.

Bu protokol özellikle klamydial gelişime dahil olan genlerin tanımlanması için oluşturulmuş olsa da, herhangi bir sayıda kimydial genetik yolu sorgulamak için kolayca uyarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde kullanılan tüm Python komut dosyaları Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing

1. Mutagenize Muhabiri Klamidya

NOT: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EB'ler, eksenik ortam CIP-1'de etil metansülfonat (EMS) kullanılarak doğrudan mutajenleştirildi, çünkü bu ortam EB enfektivitesinin bakımını ve bakımını destekler12.

  1. P2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover reporter plazmid ve pelet ile dönüştürülmüş ~3 x 107 EB içeren buz üzerinde bir chlamydial stokunu 4 °C'de 30 dakika boyunca 30 dakika boyunca 14.000 x g olarak eritin.
    NOT: Bu deneylerde kullanılan klamidya organizmaları 1x sakaroz-fosfat-glutamat tamponunda (SPG) -80 °C'de %30 renografin yoğunluğu saflaştırılmış ve dondurulmuştur.
  2. Supernatant atın ve 10 s için% 10 güç buz üzerinde sonication ile CIP-1 tampon 100 μL EB pelet yeniden askıya. 100 μL'lik EB süspansiyonunu mutajenize edilmiş ve sahte işlenmiş numuneler için iki 50 μL'lik aliquots'a bölün.
  3. Ayrı bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüp içinde 20 mg/mL EMS-CIP-1 çözeltisi hazırlayın. Bunu yapmak için, 375 μL toplam hacim de 6.8 μL EMS ekleyin.
  4. EMS-CIP-1 çözeltisinin 50 μL'sini mutagenez için klamydial aliquotlardan birine ve 50 μL'lik CIP-1'i sadece sahte mutagenez için diğer chlamydial aliquot'a ekleyin.
    NOT: Son EMS konsantrasyonu 10 mg/mL'dir. Konlamyal titer, EMS konsantrasyonu ve bu protokolde kullanılan maruz kalma süresi bulaşıcı soyundan yaklaşık olarak %60-80 azalmaya yol açmaktadır. Bu azalma düzeyi konlamidial genom başına ~5-20 DNA lezyonlarına karşılık gelir8.
  5. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka. Mutajenize eB'ler bölüm 2 monolayers enfekte doğrudan kullanılacaktır.
    DİkKAT: EMS bilinen bir karsinojendir. EMS ile temas eden tüm ekipman ve malzemeler imha edilmeden önce 24 saat boyunca 1 M NaOH içinde ıslatılmalı, protokol ve EMS malzemelerinin temizliği sırasında eldivenler her zaman kullanılmalıdır.

2. Mutant Ctr görüntüleme

  1. Mutajenize Ctr görüntüleme ve izolasyon için konak hücre kültürü
    1. Tohum 6 iyi cam alt plaka ile 6 x 105 Cos-7 hücreleri (ATCC) iyi başına 2 mL tam medya (RPMI-1640% 10 fetal sığır serum ve 10 mg / mL gentamicin ile desteklenmiştir). Mutagenized Ctr görüntüleme için bu cam alt plaka kullanın.
    2. 1 mL tam ortamda her 1 x 105 Cos-7 hücresi (ATCC) içeren 24 kuyu polistiren plakatohum. İlgi izole Klamidya reenfeksiyon için bu polistiren plaka kullanın.
    3. Her iki plakayı da yaklaşık 18 saat boyunca %5 CO2, 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Hücreler biraraya geldiğinde, medyayı 1 μg/mL siklohekamid ile tamamlanmış tam ortamla değiştirin ve bir gecede kuluçkaya yatırın.
  2. Ev sahibi hücre kültürünü mutajenize Ctr ile enfekte etmek
    1. 1,5 mL/kuyu buz gibi HBSS'de 1,5 mL/kuyu buz gibi HBSS'de 1,5 mL/kuyubuz gibi eB'ler ile cam alt plakanın 5 kuyusu ile enfekte edin.5 Bu da mutagenez nedeniyle ~%70 mortalite oranı beklendiği için ~ 0.3'ün MOI'sine neden olacaktır.
    2. Kalan kuyuya 1,5 mL/kuyu buz gibi HBSS'de ~2 x 105 sahte mutajenize edilmiş EB'lerle bulaştırın. Mutagenez olmadan, daha az mortalite bekliyoruz, böylece inokül üçte biri ~ 0.3 MOI elde etmek için kullanılır.
      NOT: ~0.3 MOI, konak hücrelerinin tek bir EB tarafından enfekte olmasını sağlar ve klonal izolasyon için enfekte hücreler arasında yeterli ayrımı sağlar.
    3. Plakayı 37 °C'de 15 dakika boyunca, sallanan bir şekilde kuluçkaya yatırın.
    4. Enfekte konak hücreleri önceden ısıtılmış (37 °C) HBSS içeren 1 mg/mL heparin ile hemen ardından hbss durulama ile yıkayın. Heparinin çıkarıldığından emin olmak için heparini hemen HBSS ile durulayın, heparini tekrarlayın.
      NOT: Heparin inhibe eder ve konak hücre ile EBs13arasındaki erken elektrostatik etkileşimleri tersine çevirebilir. Heparin yıkar henüz konak hücrelerine girmek için, enfeksiyon senkronize EBs kaldırmak. Hücreler yıkanırken, hücrelerin kuyuların yüzeyinden sislodize siniönlemek için bunu nazikçe yaparlar. HBSS ve heparin çözeltileri artık EMS içerir ve imha edilmeden önce 24 saat boyunca 1 M NaOH içeren bir kabın içine konulmalıdır.
    5. HBSS'yi önceden ısıtılmış (37 °C) görüntüleme ortamının 4 mL/kuyusu (komple ortam, 1 μg/mL siklohekamid, 20 mM HEPES ve fenol kırmızısı yok) ile değiştirin.
    6. Sıcaklık kontrolüne yardımcı olmak ve buharlaşmayı azaltmak için ara boşlukları önceden ısıtılmış (37 °C) deiyonize H2O ile doldurun. Plakayı 37 °C inkübatörde %5 CO2 ile 10 saat kuluçkaya yatırın.
  3. Mikroskop kurulumu ve görüntüleme
    NOT: Çok renkli çok konumlu otomatik canlı hücre floresan görüntüleme gelişimsel gen ekspresyonu dinamikleri farklı klamydial mutantlar tanımlamak için zaman atlamalı görüntüleri toplamak için kullanılır. Bu protokol, otomatik mikroskop kontrolü için açık kaynak μManager yazılım paketini kullanır14.
    1. Mikroskop kurulumu 10 saat sonrası enfeksiyon başlayın. Mikroskop sahne kuluçka makinesini %5 CO2, 37 °C'ye ayarlayın. Enfekte 6 kuyu cam alt plakayı sahne kuluçka makinesine yerleştirin ve numune termistini h2O'ya yerleştirin.
    2. Yüksek İçerik Tarama(HCS) eklentisini kullanarak XY aşamasını kalibre edin. Eklentiler | Edinme Araçları | HCS Site Jeneratörü μManager mikroskop kontrol yazılımı (JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
    3. 6 kuyulu plaka şablonunu seçin ve HCS eklentisi(JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4)içinde her biri için 12 görüş alanından (FOV) oluşan bir görüntüleme konum listesi oluşturun. Sahne Konumu Listesini açın ve manuel olarak odaklanın ve Aşama Kontrol eklentisini(JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6)kullanarak her FOV için ilk Z konumunu ayarlayın. Eksik hücreleri olan veya tek bir tek katmanlı içermeyen herhangi bir FOV'un XY koordinatlarını ayarlayın.
      NOT: Her görüntünün yakalanması için gereken süre nedeniyle, 30 dk aralığında en fazla 72 FOV alınabilir.
    4. Görüntüleme için 20x objektif lens kullanın. Bu büyütme, istenen çözünürlüğü sağlarken ~ 8 dahil fov başına görüntülenmesine olanak sağlar.
    5. Bu veri analizi(JoVE61365_screenfile7)sonra ilgi dahil bulmak için kullanılacak gibi pozisyonlar listesini kaydedin.
    6. Otomatik görüntüleme(JoVE61365_screenfile8)için odak ayarlamak için görüntüleme yazılımında Otomatik Odaklama seçeneğini kullanın.
    7. μManager'da görüntü tabanlı otofokusu kullanarak en tutarlı netleme sonuçlarını üretmek için aşağıdaki seçimleri ve değerleri kullanın. Otomatik netleme özellikleri penceresinde açılan menüden OughtaFocus'u seçin ve aşağıdaki ayarları kullanın. OughtaFocus-SearchRange_μm: 350, OughtaFocus-Tolerance_μm: 0.5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-Pozlama: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Evet, OughtaFocus-Maximize: SharpEdges, OughtaFocus-Kanal: DIC.
      NOT: Kırpma faktörünü azaltarak otofokus görüntüleme penceresini azaltmak daha tutarlı otomatik odaklama sağlar. OughtaFocus-ShowImages için Evet'i seçmek, kullanıcının otofokus görüntüsünü görüntülemesini sağlar.
    8. 30 dk zaman aralıkları(JoVE61365_screenfile9)ile 24 saat görüntüleme ile gelişim döngüsünün kinetik yakalayın. 12-36 HPI arasında görüntüleme Klamidya'nın gelişim döngüsünü tamamlamasını sağlar ancak konak hücreyi etkilemez.
    9. GFP ve RFP kanallarında sırasıyla %4 ve %18 yoğunlukta 250 ms maruziyeti olan hücre monokatmanlarınıgörüntüleyin (JoVE61365_screenfile10). 514/30 nm bandpass emisyon filtresi ile 470 nm'de uyarma ile Yonca (GFP) sinyalini algıla. mKate2 (RFP) sinyalini 595 nm'de uyarma ve 641/75 nm bandpass emisyon filtresi ile tespit edin.
      NOT: Uyarma yoğunluğunu en aza indirmek, Klamidya'yaflorofor fotobeyaztasyon unu ve fototoksisiteyi en aza indirmek için çok önemlidir. Pilot çalışmalarda 200-300 ms pozlama ile çözülmüş bir görüntü oluşturmak için minimum uyarma yoğunluğu ampirik olarak belirlenmelidir.
    10. Odak dilimin her iki tarafında sona eren bir odak aralığıyla birden çok Z dilimi yakalayın. Bu deneyde, 20x büyütme, bu 10 μm adımlar(JoVE61365_screenfile11)4 dilim ile elde edilmiştir.
    11. Edinme penceresinde birden çok dilimi görüntülemek için Göreli Z'yi seçin. Göreli Z seçeneği, görüntüleme konum listesinde kaydedilen Z düzlem konumunu bir sonraki zaman aralığının başlangıç noktası olarak kullanır. Floresan görüntüleme kanalları için uygun Z-ofset değerlerini girdi(JoVE61365_screenfile12).
      NOT: Görüntü tabanlı odaklama sistemi kusurludur ve 24 saat görüntüleme süresi boyunca bu odak kaymasına yol açar. Her zaman noktası için 3-4 Z odak düzlemi yakalayarak odak içi bir görüntünün korundi olduğu bulunmuştur. Floresan görüntü kanalları ile DIC kanalı arasındaki odak düzlemleri arasındaki farklılıkları düzeltmek için Z-ofset gereklidir. Bu Z-ofsetin ampirik tayini gerekecektir.
    12. Kök dizinini seçip denemeyi adlandırarak görüntüleri kaydedin. Görüntüleri tiff yığın dosyaları(JoVE61365_screenfile13)olarak kaydetmek için μManager resim yığını dosya seçeneğini kullanın.
    13. Çoklu D Edinme penceresinde(JoVE61365_screenfile13) Edinme Yorumları kutusuna deneysel ayrıntıları kaydedin. yani, Peki A1: Tedavi edilmezse kontrol. Peki A2-3 ve B1-3: EMS Mutantlar. Görüntüleme: 12-36HPI. Görüntü edinimi 12 HPI'dan başlatın.
      NOT: μManager kullanıyorsanız, deneme tamamlandıktan sonra programı, deneysel kurulumu ve mikroskop donanımını çalıştırarak bırakın. Mutasyona uğramış popülasyonun analizi tamamlandıktan sonra görüntüleme siteleri dahil izolasyon için tekrar ziyaret edilecektir.

3. Değişmiş gelişimsel fenotiplerle mutajenleştirilmiş Klamidya'yı tanımlamak ve izole etmek

  1. Odak içi görüntü yığını oluşturma
    1. Zaman noktası başına 4 Z dilimi içeren kaydedilen görüntü verilerini kullanarak Z yığınlarından en çok netleme görüntüsünü ayıklayın. Kurtoz ölçüm seçeneğini kullanın (Analiz | Ölçü)ImageJ / FIJI otomatik olarak odak Z dilim (en yüksek kurtosis puanı) en tanımlamak ve sadece bu odak içi görüntüler ile yeni bir görüntü yığını oluşturmak için. Python komut dosyası, bu işlemi otomatikleştirmek için tamamlayıcı bir dosya(Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py)olarak ekolarak ekolarak yer almaktadır.
  2. Floresan ekspresyonunu bireysel içermelerde ölçme
    NOT: İki muhabirin ifade kinetiğini ölçmek için açık kaynak görüntü analizi uygulaması ImageJ/FIJI ve eklenti Trackmate15'ikullanın. Trackmate 'noktalar' tanımlar (bu durumda eklemeler karşılık gelir) ve zaman içinde her dahil için X, Y konumu ve sinyal yoğunluğu nu kaydeden bir zaman atlamalı görüntü yığını ile onları izler(JoVE61365_screenfile14). Bu bilgiler CSV dosyası olarak kaydedilir ve çözümleme için özel bir Python not defterine aktarılır.
    1. Eklentileri tıklatarak Bio-formatlar İthalatçı kullanarak ImageJ/FIJI'deki odak içi Z-azaltılmış görüntü yığınını açın | Bio-Formats | Bio-formatları İthalatçı. Hyperstack ve Composite (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16)seçeneğini belirleyin.
    2. İşlem'e tıklayarak resim arka planını çıkarma | 50,0 piksellik Rolling ball yarıçapı kullanarak Arka Planı çıkarın ve Doymuş pikseller için görüntü kontrastını %0,3'e çıkarın (İşlem | Kontrastı geliştirin). Görüntü değerlerini 10.0 ile çarpma (İşlem | Matematik | Çarpın) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
    3. In Trackmate (Eklentiler | İzleme | Trackmate), 48 piksel (ampirik görüntüleme sonunda inclusion boyutuna göre belirlenir) tahmini blob çapı seçin. 8,0 piksellik Bağlantı maksimum mesafesi ve Boşluk kapatma maksimum mesafesi ve 1(JoVE61365_screenfile23 - JoVE61365_screenfile25) boşluk kapatma maksimum kare boşluğu seçerek parçasız dahil parça üretin.
      NOT: Trackmate'in tüm döngü boyunca dahil edilmeleri tanımlama ve izleme yeteneğini geliştirmek için ImageJ/FIJI'deki görüntü matematik işlevini kullanarak euobalo ve hctBbalo kanalları birlikte eklenerek ayrı bir görüntü kanalı oluşturulur. Bu kanal daha sonra Trackmate tarafından zaman içinde eklemeleri tanımlamak ve izlemek için kullanılır. Euobalo ve hctBbalo kanallarının floresan değerleri daha sonra kanal 2 ve 3'e kaydedilir.
    4. Minimum sürekli süreyi karşılayan kayıt parçaları: Parça süresi: 20(JoVE61365_screenfile26). Parçaları analiz edin ve Parçaların istatistiklerindeki Spotları Bir CSV dosyası(JoVE61365_screenfile27)olarak kaydedin.
      NOT: Bu işlem, ek verilerde(TrackMate_Zreduced_JOVE.py)sağlanan özel bir Python komut dosyası kullanılarak otomatikleştirilmiştir.
  3. Değiştirilmiş gelişim profillerine sahip dahil etme parçalarını belirleme
    NOT: İçermeleri belirlemek için Chlamydia değiştirilmiş gelişimsel profillerle, her dahil etme parçası Python dizüstü bilgisayar kullanılarak görselleştirildi. Bu görselleştirmeler, sahte tedavi edilen popülasyondan farklı kinetik gen ekspresyonu profilleri ile içermelerin belirlenmesine olanak sağlar. Değiştirilmiş gelişimsel programlamaile kapsayıcıların tanımlanmasında kullanılan Python dizüstü bilgisayar, ek verilerde (EMS_Screen-İşaretle).
    1. EMS_Screen-Markdown Python Notebook'taki Alma hücresini kullanarak, izleme istatistikleri CSV dosyalarındaki Noktalar'dan gelen dahil parça verilerini Pandas veri çerçevesine aktarın.
    2. Taban çizgisi, Taban Çizgisi Çıkarma hücrelerini kullanarak her parçanın minimum değerini parça değerlerinin geri kalanından çıkararak her parçayı düzeltin. Pickle hücre olarak kaydet kullanarak elde edilen değerleri turşu dosyası olarak kaydedin. Bu, daha sonraki alma için temel çıkarmadan sonra kanal değerlerini kalıcı olarak kaydeder.
      NOT: Temel çıkarma, her dahilin başlangıç floresan yoğunluğunu sıfıra ayarlar.
    3. Floresan profilleri tam olarak yakalanmayabileceğinden, Filtre Kenarları hücresini kullanarak FOV'un kenarlarına yakın eklemelerden gelen izleri ortadan kaldırın; bu izler yanlış pozitif gelişimprofilleri üretebilir.
    4. Deneysel başlangıç zamanıtotalFramesve görüntüleme zaman aralığını kullanarak görüntü dilimlerinden zamana(startTime, interval) zamana (startTime, interval)değerleri ayarlayın. Time-lapse Calibration Parça Süresi Filtresi hücresini kullanarak denemenin son 20 saatini (16-36 HPI) sürmeyen izlemeleri filtreleyerek kısmi dahil etme okumalarını hariç tutarak okumaları hariç tutarak.
    5. Tedavi hücre atama ile deneysel duruma göre tek tek veri çerçeveleri içine parça ayrı izler. Büyüme Filtresi hücresini kullanarak yeterli büyüme gösteren eklemeler için filtre uygulayın. Büyüme Filtresi hücresinde, son iki kod satırındaki değerleri değiştirerek euoprom kanalının floresan yoğunluk eşiğini ampirik olarak ayarlayın. Bu büyümedi Klamidya filtre olacaktır.
      NOT: Eşik filtreleri ayarlarken dikkatli olun, filtre çok düşükse ortaya çıkan dağılım çizimleri gürültülü olacaktır, ancak filtreleme çok yüksek ayarlanırsa önemli mutantlar ortadan kaldırılabilir.
    6. Mutajenize edilmiş parça/kuyu sayısını, sahte işlem görmüş parça/kuyu sayısına bölerek EMS'nin neden olduğu yüzde mortaliteyi hesaplayın. Mock-treated parça/kuyu sayısını hesaplamak için, sahte işlem görmüş parça sayısını ilk seyreltme faktörü 3 ile çarpın. Bu görevi gerçekleştirmek için Count Inclusion Tracks'i kullanın ve Yüzde Ölüm Yüzdesi hücrelerini hesaplayın.
    7. Hesapla hücresini kullanarak her parça için hem erken hem de geç muhabirler için yarı maksimal ifade süresini hesaplayın. Bu değerler, gelişimsel mutantları tanımlamak için mutajenize edilmiş ve sahte popülasyonları karşılaştırmak için kullanılacaktır.
    8. Half-Max Plot hücre içinde her organizatörün yarım max ifade için zaman görselleştirmek için bokeh çizim paketi kullanın, hctBbalo karşı yarım maksimal ifade euobalo süresi grafik. Bokeh etkileşimli parça kimliği gezginini kullanarak sahte işlem gören dağılım bulutu dışında kalan mutant popülasyonun içermelerini belirleyin. İlgi nin eklenmesinin FOV ve XY koordinatlarını not edin (Şekil 2).
      NOT: Her bir klonun doğrulanması ve istatistiksel olarak değerlendirilmesi daha sonra gerçekleştirileceği için, kontrol bulutunun dışına görsel olarak düşen aday eklemeleri seçin.
    9. Animasyonlu Çizim hücre içinde çizim aracı Plotly16kullanarak hctBbalokarşı euobalo ifade yoğunlukları grafik tarafından zaman içinde dinamik olarak organizatör ifade kinetik değişiklikleri görselleştirmek . Plotly'nin dağılım fonksiyonu zaman içinde gen ekspresyonunu canlandırmak için kullanılır (Video 1).
    10. Bokeh paketini kullanarak belirli bir zaman noktasında (yani 28 HPI) euobalo ve hctBbalo ifadesini çizerek, İçerme Bulucu hücresindeki Plotly animasyonlu grafiğinden bir anlık görüntü görselleştirin(Şekil 3). Adım 3.3.8'de açıklandığı gibi mutant popülasyonundan eklemeleri belirleyin.
      NOT: Bu analizin hızlı bir şekilde yapılması gerekir (<4 h) dahil edilmeler hala genişliyor ve enfeksiyon dan sonra konak hücreleri ~48 saat lyse başlayacaktır.
  4. Gelişimsel mutantları ilgi nin dahil edilmesinden izole edin
    NOT: Klamidya'yı değişmiş gen regülasyonunu gösterdiği belirlenen inklütiflerden izole etmek için kılcal iğneli bir mikromanipülatör kullanılmıştır. Well ID, FOV ve X,Y ilgi eklemekoordinatları bölüm 3.3'teki veri görselleştirmesi kullanılarak belirlenmiştir.
    1. Bir alev içinde kılcal tüp merkezi tutarak ve ayrılana kadar kılcal tüpün her iki ucunu çekerek kılcal iğneler hazırlayın. Bir mikroskop slayt üzerinde çekilen ucu kırarak çekilen kılcal iğne bir açıklık oluşturun. İğneyi kırmak için, kapalı ucu mikroskop kaydırağının buzlu kısmına bir açıyla yerleştirin ve basınç uygulayın.
      NOT: Kılcal tüp özellikleri 1.0 mm O.D., 0.5 mm I.D. idi.
    2. İğne açmanın yaklaşık olarak mikroskop altında bir ekleme büyüklüğünde olup olmadığını kontrol edin, 20x hedefi.
    3. Prepull ~ 25-30 kılcal iğneler aday eklemeizolasyon için (dahil başına bir iğne).
    4. Mikroenjektörü hava kabarcıklarının bulunmamasını sağlayarak mineral yağile doldurun.
    5. Mikroenjektöre cam kılcal bir iğne takın ve herhangi bir hava kabarcığı sildi. Kılcal iğneyi tam ortama yerleştirin ve ortamı yarıya kadar çekin. Kılcal iğnenin ortamla doldurulması kuyudaki yağ kontaminasyonunu önler.
    6. 2.3.5 adımından μManager'da kaydedilen konum listesini kullanarak, Python görselleştirme not defterinde tanımlanan ilgi alanının kuyuya ve FOV'una geçirin.
    7. Kapiller iğneyi xy koordinatlarına lokalize etmek için mikromanipülatörün joystick'ini kullanın.
    8. Ekstraksiyon için EB'leri görselleştirmek için 595 nm uyarma kanalını ve iğne görselleştirme için faz/DIC beyaz ışık kanalını kullanın. Kapiller iğneyi dahil etmek için manevra, dahil yırtılma ve sonra mikroenjektör kullanarak kapiller iğne içine EBs çizin.
    9. Adım 2.1.2'de hazırlanan 24 kuyu polistiren plakanın tek bir kuyuya kapiller iğneden EB'leri atın. Kılcal iğneyi çıkarın ve bir sonraki eklenme ekstraksiyonu için taze bir kılcal iğne ile değiştirin. Tüm aday eklemeler için bölüm 3.4'u tekrarlayın.
      NOT: Genişleme ve yeniden görüntüleme için yeterince yüksek bir titre sağlamak için, konak hücrelerin çoğunluğu enfekte olana kadar bir% 5 CO2, 37 ° C inkübatör içinde inkübat mutant izole (~ 1 hafta). Farklı izole farklı büyüme oranları gösterebilir gibi kuyular yakından izlenmelidir.
  5. Hasat mutant izole
    1. Buz üzerinde, 1 mL mikropipet ucu ile kazıyarak enfekte monolayer bozun. Medya, hücre enkaz aktarın ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüp içine Klamidya yayımladı.
    2. Pelet Klamidya santrifüj ile 30 dk 4 °C, >14,000 x g. 75 μL buz soğuğu 1x SPG'de süpernatant ve resuspend peletçıkarın. Aliquot üç içine 1.5 mL vida-kapak mikrosantrifüj tüpler. -80 °C'de saklayın.

4. Mutant izole fenotiplerin doğrulanması

  1. Mutajenize izole görüntüleme için konak hücre kültürü
    1. 100 μL'lik tam ortamda her kuyu başına 1,6 x 104 Cos-7 hücresi (ATCC) içeren 96 kuyu cam alt plakatohum. %5 CO2, 37 °C'de kuluçka. Hücreler yaklaşık 24 saat içinde biraraya ulaşmalıdır. Hücreler konduktan sonra, 1 μg/mL sikloheximid ile takviye tam medya ile medya değiştirin, gece kuluçka.
  2. Fenotipik doğrulama için aday izole hücreleri enfekte
    1. Buz üzerinde mutant klonları ve yabani klamidya ları eritin.
    2. Hazırlanan 96 kuyu plakasında, izole başına bir sütun (11 sütun) kullanarak mutant izole iki kat seri seyreltme gerçekleştirin. 100 μl HBSS'de 1:20'lik bir başlangıç seyreltme ile başlayın.
      NOT: Klamidya'nın seri seyreltmesi mutant numunelerin MOI < 1'de görüntülemesini sağlamak için yapılır.
    3. Kalan (12.) kolona MOI ~0.5'te yabani tip Klamidya ile bulaş.
      NOT: Yabani klamidya mutajenize izolasyonlara karşı karşılaştırma için bir kontrol olarak kullanılır.
    4. 37 °C'de 15 dk sallayarak kuluçka.
    5. Enfekte konak hücreleri önceden ısıtılmış (37 °C) HBSS ile 1 mg/mL heparin ve HBSS bölüm 2.2'de belirtildiği şekilde yıkayın.
    6. Önceden ısıtılmış (37 °C) görüntüleme ortamının kuyubaşına 200°L'lik bir kısmını değiştirin.
    7. Ara boşlukları önceden ısıtılmış (37 °C) deiyonize H2O ile doldurun.
    8. %5 CO2, 37 °C'de 10 saat kuluçkaya yatırın.
  3. Mikroskop kurulumu
    NOT: Mikroskop kurulumu için bölüm 2.3'e bakın, bu bölüm yalnızca gerekli kurulum değişikliklerini içerecektir.
    1. HCS eklentisinden 96 kuyu plaka şablonu seçin.
    2. Ampirik olarak her mutant izole için bir MOI < 1 karşılık gelen kuyuları belirleyin. Euo organizatörü kontrolündeki yonca ifadesi ~10 HPI'de gözlemlenebilir ve içermelerin erken görselleştirilmesi mümkün olur(Şekil 1B).
    3. Mutant başına moi < 1'e karşılık gelen üç kuyu seçin ve kuyu başına iki FOV'dan oluşan bir görüntüleme konum listesi oluşturun.
      NOT: Donanım kısıtlamaları nedeniyle zaman aralığında sadece 72 görüntü alınabilir, bu durum 12 örnek görüntülenirse kuyu başına iki görüntüleme sitesi kullanılarak her sulandırma başına üç seyreltme (kuyu) eşittir.
    4. 12 HPI'den başlayarak 30 dk aralıklarla 36 saat boyunca her mutantın gelişim döngüsünü kaydedin.
    5. Deneysel ayrıntıları Satın Alma Yorumları kutusuna kaydedin. yani e., Peki ABC1: wildtype kontrolü. Peki ABC2: Mutant zorlanma 1, ABC3: Mutant suşu 2, vb ... Görüntüleme: 12-48 HPI.
    6. Görüntü edinimi 12 HPI'dan başlatın.

5. İzole doğrulama için veri analizi

  1. Odak içi görüntü yığınları oluşturun ve floresan ifadesini tek tek eklemelerde ölçün
    1. Bölüm 3.1 - 3.2'de belirtildiği gibi her dahil etme için floresan yoğunluk izleri oluşturun.
  2. Ctr mutagenized izole doğrulayın
    NOT: Mutant yalıtmalarının değiştirilmiş gelişimsel profillerini doğrulamak için, ifade profilleri Python not defteri kullanılarak wildtype ifade profiliyle karşılaştırılır. Değiştirilmiş gelişimsel programlama ile mutant klonların doğrulanması için kullanılan Python dizüstü tamamlayıcı veriler(clone_check-Markdown)sağlanır.
    1. Bölüm 3.3'te yapıldığı gibi, clone_check-Markdown Python not defterindeki dahil etme izleme verilerini içe aktarın ve filtreleyin.
    2. Ortalama yı hesapla ve STD hücresini kullanarak her yalıtma ve yabani tipi kontrol popülasyonunun izlerinden ortalama ve standart sapmayı (STD) hesaplayın.
    3. Graph Iso vs WT hücre çizimi ile her mutant klonun ortalama (SEM) ortalama ve standart hatası, mutant ekspresyonun un wildtype örneğinden farklı olup olmadığını belirlemek için wildtype kontrolüne karşı(Şekil 4).
    4. İzleyen mutant popülasyonun mutant izlerini çizerek ve bölüm 3.3'te (3.3.7-3.3.10 adımları) yapıldığı gibi bir dağılım çizimi kullanarak yabani tip ekleme izlerini karşılaştırarak klonal olup olmadığınıbelirleyin( Şekil 2 , Şekil 3). İzole karışık bir popülasyonsa, arsa, bir popülasyonun vahşi tiple örtüştünü ve vahşi tip dağılım bulutunun dışında ikinci bir ayrı popülasyon ugösterir. Popülasyon karışık görünüyorsa mutant bölüm 3.4'te açıklanan orijinal prosedür kullanılarak yeniden izole edilebilir.
      NOT: İzole edilen bir izolenin gelişimprofilinin istatistiksel olarak wildtype'tan farklı olup olmadığını belirlemek için, her yalıtma eğrisi ANOVA kullanılarak wildtype ile karşılaştırılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organizatörümüzün-muhabir chlamydial zorlanmamızın direkt EMS mutagenezi, enfektelikte ~u azalma ile sonuçlandı. Açıklanan canlı hücre görüntüleme protokolü kullanılarak, ~600 dahil etme 24 saatlik bir süre boyunca görüntülendi ve izlendi. Her iki muhabirin floresan ifade kinetiği özel Python not defteri komut dosyaları kullanılarak görselleştirildi. İzolasyon için aday mutajenize Chlamydia belirlemek için iki görselleştirme yaklaşımı uygulanmıştır. İlk metodoloji (adım 3.3.8) euo ve hctB organ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klamydial gelişim döngüsünü kontrol eden mekanizmaların incelenmesi, mevcut genetik araçların sınırlamaları nedeniyle engellenmiştir. Canlı hücreli otomatik mikroskopi ile birlikte organizatör-muhabirkla Klamidya'yı istihdam eden bir sistem, 24 saatlik bir süre içinde bireysel içermelerde hücre tipi gelişimin izlenmesini sağlayan bir sistem inşa edilmiştir. Bu sistem, kimyasal mutagenez ve doğrudan dahil izolasyon ile birlikte hızlı ve klonsal klamidya değiştirilmiş gelişimsel profilleri ifade seçmek iç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Washington State Üniversitesi'nden Dr. Anders Omsland'a CIP-1 baltalı medyayı sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH hibe R01AI130072, R21AI135691 ve R21AI113617 tarafından desteklenmiştir. Idaho Üniversitesi ve Merkezi Modelleme Karmaşık Etkileşimler için kendi NIH hibe P20GM104420 aracılığıyla başlangıç fonları tarafından ek destek sağlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
24 oyuklu polistiren plakalarCorning3524İzolatların yeniden enfeksiyonu için hücre kültürü büyümesi
6 oyuklu cam alt plakalarCellvisP06-1.5H-NGörüntüleme için hücre kültürü büyümesi
96 oyuklu cam alt plakalarNunc165305Görüntüleme için hücre kültürü büyümesi
Kalın çizgi CO2 ÜnitesiOKO LabsCO2 ÜNITESI BLSahne inkübatörü CO2 kontrolü
Kalın çizgi T ÜnitesiOKO LabsH301-T-UNIT-BL-PLUSSahne inkübatörü sıcaklık kontrolü
Borosilikat cam kılcal borularSutter EnstrümanB1005010Kılcal borular
BrightLine bant geçiren emisyon filtresi (514/30nm)SemrockFF01-514/30-25Fluoescent filtre küpü
BrightLine bant geçiren emisyon filtresi (641/75nm)SemrockFF02-641/ 75-25Fluoescent filtre küpü
CellTram VarioEppendorf5196000030Mikroenjektör
Chlamydia trachmatis serovar L2ATCCVR-577Chlamydia trachomatis
CIP-1 ortamıKurum içiNAAxenic media. %1 FBS, 25 & mu ile desteklenmiş IPB; M amino asitler, 0.5
mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT ve 50 μ M GTP, UTP ve
CTP. (Omsland, A. 2012) kendi bünyesinde yapılmıştır.
Cos-7 hücreleri (ATCC)ATCCCRL-1651Afrika yeşil maymun böbrek hücresi (konakçı hücreler)
SikloheksimidMP Biyomedikaller194527Konak hücre büyüme inhibitörü
Etil metansülfonat, %99Acros OrganicsAC205260100Mutagen
Fetal Plexİkizler Biyo-Ürünler100-602Baz büyüme ortamı için takviye
Fiji/ImageJhttps://imagej.net/FijiNAAçık kaynak Görüntü analiz yazılımı. https://imagej.net/Fiji
Galaxy 170 S CO2 inkübatörüEppendorfCO1700100XHücre kültürü inkübasyon
gblokları (Floresan FP varyantları: Yonca ve mKate2)Entegre DNA Teknolojileriklonlama için Ctr optimize edilmiş FP varyanlarının NA gblock ORF'leri
15710-064Büyüme ortamı için antibiyotik
HBSS (Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi)Corning21-020-CMKonak hücreler durulanır
Heparin sodyumAmersham Life Science16920konak hücre ve EB'ler arasındaki erken elektrostatik etkileşimleri inhibe eder ve tersine çevirir
HEPES 1MGE Life SciencesSH30237.01Büyüme ortamı için pH tamponu
InjectManEppendorf5179 000.018Mikromanipülatör
Jupyter Notebookhttps://jupyter.org/NAİnklüzyon izlerinin görselleştirilmesi. https://jupyter.org/
Lambda 10-3Sutter AletiLB10-3Filtre tekerleği kontrol cihazı
Oko TouchOKO LabsBold line T ve CO2 Ünitesini kontrol etmek içinOko Touch
Arayüzü Önceki XY aşamasıÖncekiH107Motorlu XY mikroskop aşaması
PrismR SantrifüjLabnetC2500-RSıcaklık kontrollü mikrosantrifüj
Problot Hibridizasyon fırınıLabnetH1200AChlamydia Proscan II ile enfeksiyon için Sallanan İnkübatör
ÖncekiH30V4XYZ mikroskop kademe kontrol cihazı
Arıtıcı Sınıf 2 Biyogüvenlik KabiniLabconco362804Hücre kültürü çalışması
RPMI-1640 (fenol kırmızısı yok)Gibco11835-030Görüntüleme için baz büyüme ortamı
RPMI-1640 (fenol kırmızısı)GE Yaşam BilimleriSH30027.01Temel büyüme ortamı
kapsamıLED uyarma LED'leri (470nm, 595nm)kapsamLEDF140Uyarma ışığı
Sonik Ayırıcı Model 500Fisher Scientific15-338-550Sonikatör, klamidyal pelet yeniden askıya alma
Aşama inkübatörüOKO LabsH301-K-FRAMEKüme kuyusu plakası inkübasyon odası
sükroz-fosfat-glutamat tamponu 1X (SPG)Kurum içiNAKlamidyal depolama tamponu. (10 mM sodyum fosfat [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sükroz, 0.50 mM L-glutamik asit; pH 7.4)
T-75 ŞişelerTermo Bilimsel156499Hücre kültürü büyümesi
TE 300 ters mikroskopNikon16724mikroskop
THOR LEDThor LabsLEDD1BBeyaz ışık
TripsinCorning25-052-CIPlakalara tohumlamak için konakçı hücreleri şişeden çıkarır
Zyla sCMOSAndorZYLA-5.5-USB3görüntüleme kamerası
&mikro; Manager 2.0gammahttps://github.com/micro-manager/micro-managerNAAçık kaynak otomatik mikroskop kontrol yazılım paketi
P2TK2SW2 Gentamisin 10mg/ml Gibco'ya ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. AbdelRahman, Y., Belland, R. The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).
  2. Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).
  3. Yu, H. H. Y., Tan, M. σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia. Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).
  4. Koo, I., Stephens, R. A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).
  5. Grieshaber, S., et al. Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity. Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065(2018).
  6. Belland, R., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).
  7. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).
  8. Nguyen, B., Valdivia, R. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
  9. Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. MBio. 7 (1), 01817(2016).
  10. Rosario, C. J., Tan, M. The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes. Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).
  11. Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).
  12. Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).
  13. Su, H., et al. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).
  14. Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14-20 (2010).
  15. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  16. Plotly Technologies Inc. Collaborative data science. , Montréal, QC. https://plot.ly (2015).
  17. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  18. Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).
  19. Sega, G. A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate. Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).
  20. Ferguson, L., Denny, W. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands. Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Live Cell MicroscopyDual Promoter Reporter SystemChemical MutagenesisCell Type SwitchingDevelopmental CycleElementary BodiesReticulate BodiesClonal Isolation

İlgili makaleler