Method Article

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

DOI:

10.3791/61375

⸱

May 24th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Section of Cell and Developmental Biology, University of California, San Diego, 2Department of Entomology and Plant Patholog, Auburn University, 3Tata Institute for Genetics and Society, University of California, San Diego

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Culex quinquefasciatus, kuş sıtması, Batı Nil virüsü (WNV), Japon ensefalit, Doğu at ensefaliti, lenfatik filariasis ve Saint Louis ensefaliti gibi çeşitli vektör kaynaklı hastalıkların vektörüdür. Özellikle, kuş sıtması çok sayıda endemik ada kuşu türünün neslinin tükenmesinde önemli bir rol oynarken, WNV Amerika Birleşik Devletleri'nde önemli bir vektör kaynaklı hastalık haline gelmiştir. C. quinquefasciatus biyolojisi hakkında daha fazla bilgi edinmek ve genetik kontrol araç kutularını genişletmek için, bu türdeki genom mühendisliği için daha verimli ve uygun fiyatlı yöntemler geliştirmemiz gerekir. Bununla birlikte, Culex sivrisineklerine özgü bazı biyolojik özellikler, özellikle yumurta salları, genom mühendisliği için gerekli mikroenjeksiyon işlemlerinin yapılmasını zorlaştırmıştır. Bu zorlukları ele almak için, Culex sivrisineklerinin benzersiz özellikleriyle ilişkili teknik engelleri azaltmaya odaklanan optimize edilmiş bir embriyo mikroenjeksiyon protokolü geliştirdik. Bu prosedürler, C. quinquefasciatus'ta başarılı mikroenjeksiyon için gerekli olan yumurta toplama, yumurta salı ayırma ve diğer elleçleme prosedürleri için optimize edilmiş yöntemleri göstermektedir. CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisi ile birleştiğinde, bu prosedürler, bu önemli, ancak şu anda yetersiz olan hastalık vektöründe gelişmiş genom mühendisliği yapmak ve genetik kontrol teknolojileri geliştirmek için gerekli olan bölgeye özgü, verimli ve kalıtsal germline mutasyonları elde etmemizi sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. quinquefasciatus, genellikle güney evi sivrisinek olarak bilinen, Batı Nil virüsü (WNV), Japon ensefalit, Saint Louis ensefaliti ve Doğu at ensefaliti dahil olmak üzere çok sayıda patojenin yetkin bir vektörüdür. Özellikle, 1999'da New York'ta ilk kez tespit edildiğinden beri, WNV, 1999 ve 2018 yılları arasında yaklaşık 2.300 ölümle sonuçlanan 50.000'den fazla insan vakası ve 2008-2019 yılları arasında bildirilen 4.500'den fazla at vakası ile kıta Amerika Birleşik Devletleri (ABD) genelinde önemli bir vektör kaynaklı hastalık halinegelmiştir. Buna ek olarak, Kuzey Amerika'da bulunan en az 23 kuş türü, WNV3'ünbir sonucu olarak kurtarılamaz olarak sınıflandırılan en az 12 tür ile WNV enfeksiyonlarından etkilenmiştir. WNV'nin insan, at ve kuş popülasyonları üzerindeki etkisi, vektörlerinin fırsatçı beslenme davranışından kaynaklanmaktadır. Tipik olarak, kuşlar WNV için birincil konaktır ve insanlar ve atlar tesadüfi veya çıkmaz konaklardır. C. quinquefasciatus tarafından vektörlenen bazı patojenler sadece kuş sıtma paraziti, Plasmodium relictumgibi kuşları enfekte eder. Hawaii'de, C. quinquefasciatus kuş sıtmasının ana vektörüdür ve birçok yerli kuş türünün neslinin tükenmesine neden olmuştur4,5.

C. quinquefasciatustarafından bulaşan hastalıkları kontrol etmek için, araştırmacılar ve vektör kontrol ajansları insektisit uygulaması6gibi yaygın olarak kurulmuş sivrisinek popülasyon kontrol araçlarını kullanmıştır , ancak, bu yöntemler türlere özgü değildir ve birçok C. quinquefasciatus popülasyonunda insektisitlere karşı direnç yüksek olduğu için sınırlıetkilidir. Wolbachiatabanlı nüfus kontrol stratejileri gibi diğer kontrol teknikleri son yıllardageliştirilmiştir 10,11, ancak Wolbachia enfeksiyonu ile ilişkili fitness maliyetleri bu vektör için bu yaklaşımın fizibilitesini sınırlamak12. Aedes aegypti13 , 14, Anopheles gambiae15 ve Anopheles stephensi16gibi diğer sivrisinek türlerinde geliştirilen genetik tabanlı kontrol yöntemleri de vardır , patojene dirençli sivrisineklerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere17,18,19, gerekli genom mühendisliği araçları ise C. quinquefasciatus için de geliştirilebilir bu tür için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, C. quinquefasciatus biyolojisi, bu vektörde benzer genetik teknolojilerin geliştirilmesini zorlaştıran diğer Aedes ve Anopheles sivrisinek vektörlerinden büyük ölçüde farklıdır. CRISPR tabanlı genom mühendisliği teknolojilerinin ortaya çıkmasıyla, hassas genom mühendisliği giderek daha önemsiz, uygun fiyatlı ve uyarlanabilir hale geldi ve sonuç olarak çok çeşitli türlerde yeni genetik araçların geliştirilmesine yol açtı.

CRISPR tabanlı teknolojilerle mutasyonlar üretmek için, istenen lociyi tamamlayan Cas9 proteini ve sentetik kılavuz RNA (sgRNA) karışımı, blastoderm öncesi evre embriyolara mikroenjakt edilir. C. quinquefasciatus dişileri yumurtalarını yüzen bir sal yapısına bağlı gruplar halinde bıraktıklarından (Şekil 1), Aedes ve Anopheles sivrisineklerinin bir özelliği olan ovipositing bireysel yumurtaların aksine, embriyo mikroenjections bu türlerde giderek daha karmaşık hale gelir. Culex larvaları da su yüzeyi ile temas halinde olan her yumurtanın ön tarafından ortaya çıkar (Şekil 1), bu nedenle yumurta yönelim sonrası manipülasyon bu türlerde önemlidir. Burada Cas9 proteini ve sgRNA'nın C. quinquefasciatus embriyolarına mikroenjeksiyonu için tasarlanmış ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Bu protokol, zamanında yumurta toplama ve yumurta hayatta kalma için anahtar olan belirli adımlarla embriyo sağkalım ve genom mutasyon oranlarını iyileştirmek için Culex biyolojisine özgü özellikleri barındıracak şekilde tasarlanmıştır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. C. quinquefasciatus koloni yetiştirme

  1. Böcek yurdu kafeslerinde C. quinquefasciatus yetişkinlerinin birden fazla kolonisi kurun.
    NOT: Koloniler Cornell Üniversitesi20'deDr. Laura Harrington tarafından sağlanmıştır. Culex sivrisineklerinin yetiştirilmesi için ayrıntılı protokoller diğer literatürde bulunabilir21.
    1. Sivrisinekleri 25 ± 1 °C'de% 30 nemde 12:12 saat gündüz:gece döngüsü ile koruyun.
    2. Kafese fitili olan bir şeker çözelti kabı sokarak veya pamuk toplarını şeker çözeltisi ile doyurarak ve kafesin içine yerleştirerek% 20 şeker çözeltisi reklam libitum sağlayın.
  2. Sivrisineklerin kan beslemeden önce en az 3 gün çiftleşmelerine izin verin(Şekil 2A).

2. C. quinquefasciatus blastoderm öncesi evre embriyoların toplanması

  1. Eklozyondan 3-6 gün sonra, dişilere sentetik bir zardan 1-2 mL sitratlanmış sığır kan unu sağlayın ve bir kan besleme sisteminde yaklaşık 40 ° C'ye ısıtın (Şekil 2B). Culex sivrisinekleri için kullanılabilecek alternatif kan besleme protokolleri de vardır (örneğin, bkz.hakem 21).
    NOT: C. quinquefasciatus kuş kanı tercihi ile bilinir. Bazı laboratuvarlar kan yemek kaynakları21 , 22,23için uyuşturulmuş canlı kuşlar veya kuş kanı kullanır. Bununla birlikte, bu özellik birden fazla nesil için seçilirse, koloniler sığır kanı veya küçük kemirgenlerle beslenmek için eğitilebilir / seçilebilir.
    1. Kadınların kan beslemeden sonra en az 3 gün dinlenmesine izin verin, mikroenjeksiyon deneyleri için yumurtlamayı teşvik etmeden önce oogenez ve yumurta olgunlaşması geçirin.
  2. Embriyonik mikroenjections gününde, organik olarak aşılanmış yumurtlama suyu ile bir yumurtlama kabı oluşturun. Yumurtlama suyu, tavşan dışkısı (50 g/L), ayrışan ot (4,5 g/L) veya balık yemi (25 g/L) fermente edilerek 5 veya daha fazla gün boyunca sudayapılmalıdır 24,25.
  3. Yumurtlama kabını kafese yerleştirin ve tüm kafesi karanlık bir yere yerleştirin (Şekil 2C).
  4. Her 30 dakikada bir, yumurta salları için fincanı kontrol edin.
    1. Yumurta salları varsa, salları bir boya fırçası ile kepçeleyarak toplayın ve ıslak bir filtre kağıdına yerleştirin (Şekil 2D,E).

3. C. quinquefasciatus blastoderm öncesi evre embriyolarının hizalanması

  1. Yumurtaları salın üzerine bastırarak ve ince uçlu bir boya fırçası ve toskunluk kullanarak yumurtaları ayrı ayrı sataşarak sallardan ayırın (Şekil 2E).
  2. Tek tek yumurtaları, cam bir slaydın üstüne yerleştirilmiş ince bir çift taraflı yapışkan bant şeridine hizalayın (Şekil 2F).
  3. Hizalama yaparken, daha kolay erişilebilirlik için her yumurtanın ön tarafını aynı yöne yönlendirmeye çalışın.
    NOT: Çift taraflı yapışkan bant içermeyen alternatif bir yumurta hizalama yöntemi daha önce yayınlanan bir Nasonia vitripennis embriyo mikroenjeksiyonprotokolünde bulunabilir 26.
  4. Yumurtaları halokarbon yağ karışımı ile örtün.
    NOT: Halokarbon karışımı, iki halokarbon reaktifi ve suyu (9:1:20, halokarbon 700 : halokarbon 27 : Ultra saf su) hafifçe karıştırarak ve ardından halokarbon yağının su doygunluğunu kolaylaştırmak için karışımı gece boyunca 25οC'de inkübe ederek önceden hazırlanabilir.

4. Mikroenjections için iğne hazırlama

  1. Bir cam mikropipette puller kullanarak alümilikat kılcal cam iğneleri oluşturun.
    1. İğne çekmenin kullanım kılavuzundan alınan talimatlara göre, iğne çekme makinesine bir aluminosilikat kılcal cam yerleştirin.
      NOT: Kuvars ve borosilikat kılcal iğneler de kullanılabilir, ancak bu deney için alüminasilikat, nispeten uygun fiyatlılığı ve dayanıklılığı nedeniyle tercih edilir.
    2. Irdat'ı 516'ya, Hızı 100'e, Gecikmeyi 70'e, 97'ye ve Basıncı iğne çekeceğinde 500'e ayarlayın.
    3. Çekme talimatlarına göre iğne çekmeyi etkinleştirin ve ek iğneler için gerektiği gibi tekrarlayın.
      NOT: Enjeksiyon işlemi sırasında, iğneler genellikle tıkanır veya yanlışlıkla kırılır, bu nedenle tek bir deney için ek iğnelerin çekilmesi şiddetle tavsiye edilir.
  2. Dönen elmas aşındırıcı plaka üzerindeki çekilen iğnenin ucuna 50° açıyla yaklaşık 10 sn boyunca hafifçe dokunarak iğne ucunu eğimli yapın.
    NOT: İğneyi eğimli hale getirmek, sıvının akmasını sağlamak için açar ve aynı zamanda embriyoya daha kolay nüfuz etmek için daha keskin bir uç oluşturur. Uygun bir iğne örneği önceki bir makalede görülebilir26.
  3. Çekilen ve eğimli iğneleri petri kabına modelci kilinin çizgilerine gömerek saklayın.
    NOT: İğne uçları için en iyi kaliteyi sağlamak için iğneler enjeksiyon zamanına mümkün olduğunca yakın bir şekilde taze çekilmeli ve eğimlenmelidir.

5. Enjeksiyon karışımının yüklenmesi

  1. Genom modifikasyon reaktiflerinden (örneğin, 200 ng/μL sgRNA ve 200 ng/μL Cas9 karışımı) oluşan enjeksiyon karışımını veya tercih edilen enjeksiyon çözeltilerini hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
    NOT: Bu karışım yumurtaların atılmasını beklerken hazırlanabilir. Cas9 ve sgRNA üretimi ve mikroenjeksiyon için hazırlık hakkında daha fazla ayrıntı önceki yayınlarda bulunabilir27,28,29,30.
  2. Bir mikro doldurucu ucu kullanarak enjeksiyon iğnesine 2 μL enjeksiyon karışımı yükleyin.

6. Mikroenjeksiyon kurulumu

  1. Doldurulmuş enjeksiyon iğnesini elektronik bir mikroenjektöre bağlı olarak kurulmuş bir mikromanipülatöre yerleştirin.
  2. Hizalanmış yumurtaları içeren cam slaydı bileşik bir mikroskop aşamasına yerleştirin.
  3. Mikromanipülatör ve bileşik mikroskobu kullanarak, iğneyi embriyonun arka ucuna 25-35 ° açıyla nişan almak için hizalayın.

7. Embriyo mikroenjeksiyon (Şekil 2G)

  1. İğneyi embriyoya dikkatlice yerleştirin ve karışımı embriyo hacminin yaklaşık% 10'u kadar bir miktara enjekte edin (yumurtaların büyüklüğüne bağlı olarak 700-800 pL).
    NOT: Enjekte ederken yumurta hafifçe şişmelidir, ancak çok fazla sıvı enjekte edilirse yumurta patlayabilir veya sitoplazmik sıvı dışarı sızabilir.
  2. Bir seferde yaklaşık 20 yumurta enjekte edin, ardından embriyo kurtarma prosedürlerini durdurun ve gerçekleştirin.
    NOT: Enjekte ederken, iğnelerin tıkanma veya kırılma olasılığı yüksektir. İğneden akan enjeksiyon sıvısı eksikliği ile belirlenebilecek bir tıkanıklık meydana gelirse, ya elektronik mikroenjektör üzerindeki temiz fonksiyonla iğneyi temizlemeyi deneyin ya da iğneyi yeniden beveling deneyin. Her iki adım da işe yaramazsa, hazırlanan yumurtaların nemlendirilmesini sağlarken hızla yeni bir iğneye geçin.

8. Embriyo kurtarma ve kuluçkalama

  1. Yumurtaları en az 5 dakika bozulmadan bırakın. Enjeksiyondan 20 dakika sonra, temiz bir boya fırçası ile hafifçe fırçalayarak halokarbon yağını dikkatlice çıkarın (Şekil 2H).
  2. Yumurtaları bir boya fırçası kullanarak hafifçe kaldırın ve bir fincan çift damıtılmış suya yerleştirin (Şekil 2I). Yumurtaları su yüzeyinde tutmaya özen edin.
  3. Yumurtaları kuluçka için günlük 7 gün boyunca kontrol edin (Şekil 2J).
  4. Normal larva yetiştirme prosedürlerini izleyin21.

9. Genom modifikasyonu taraması

  1. Enjekte edilen sivrisinekleri stereoskop kullanarak mutant fenotipler içintarayın ( Şekil 2K).
    1. Kolayca tanınabilir bir fenotipe sahip olmayan mutasyonları PCR amplifikasyonu, T7 Endonuclease I tahlil ve hedef bölgenin alt kavunlanmasıyla doğrulayın31.
  2. Mikrop içindeki kalıtsal mutasyonları tespit etmek için enjekte edilen bireyler arasında ek haçlar kurun.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce yayınlanan deneylerde bu yöntem, koyu göz pigmentasyonunun gelişimi için kritik olan bir genin somatik ve germline mutasyonlarını başarıyla üretmek için kullanılmıştır, beyaz (CPIJ005542)30 (Tablo 1). CRISPR/Cas9 tarafından üretilen somatik mutasyonlar, enjekte edilen bireylerin pupal evre gözlerinde pigmentasyon kaybı taraması ile puanlandı (G0). Somatik mutasyonlar genellikle bazı hücrelerin mutant fenotipe sahip olduğu mozaik fenotipler olarak mevcuttu. Örneğin, beyaz genin somatik mutasyonları, pigmentasyondan yoksun fenotipler ve vahşi tip pigmentli fenotip30ile ommatidia karışımı ile sonuçlandı. Bununla birlikte, beyaz genin germline mutasyonu olduğunda, yeni nesil (G1)tam beyaz gözlü fenotipi miras haline geldi. Germline mutasyon oranları mozaik G0 bireyleri arasında geçiş yaparak ve tamamen beyaz gözlü yavrular için puanlama ile belirlendi (G1). Bu deneyler% 64 ila% 82 embriyo sağkalım oranının yanı sıra% 37 ila% 57 somatik mutajensis oranı ve% > 61 germline mutajensis oranı (Tablo 1)ile sonuçlandı. Aynı gendeki birden fazla lociyi hedeflemek için sgRNA'ları çoklayıcı yaparak, somatik ve germline mutajensis oranları yukarı doğru% 86'ya kadar yükseldi(Tablo 1). Ek olarak, birçok nesil boyunca, beyaz mutantların canlı homozigöz stokları laboratuvarda başarıyla tutulmuştur.

figure-results-1
Şekil 1: C. quinquefasciatus yumurta salı ve tek yumurta morfolojisi.
Dorsal (A), lateral (B) ve ventral (C) C quinquefasciatus yumurta sallarının manzarası. C. quinquefasciatus dişileri yumurtalarını daha soğanlı ön tarafı su yüzeyine dokunurken, daha sivri arka su yüzeyinden(D)uzağa bırakırlar. A- ön; P- posterior Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Mikroenjeksiyon ile C. quinquefasciatus mutantları oluşturmak için zaman çizelgesi.
Mikroenjeksiyon için C. quinquefasciatus kolonisi hazırlama ve embriyo toplama zaman çizelgesi (A-D). Toplanan yumurtalar daha sonra aynı yönde hizalanır ve halokarbon yağı (F)ile kaplanır . Yumurtalar daha sonra enjekte edilir (G) ve halokarbon yağını(H)çıkarmadan önce en az 5 dakika dinlenmesine izin verilir. Yumurtalar daha sonra kuluçka (J) için temiz bir su kaynağına (I) aktarılır ve mutant fenotipler (K) için taranır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

BekaSomatik mozaikçilik (G0)Germline mutajensis (G1)
sgRNA#injected♂♀Toplam (%)♂♀Toplam (%)G1 mutantlar (%)
wsgRNA-150152035(70)7(47)13(65)20(57)128(69)
wsgRNA-25093241(82)3(33)12(38)15(37)51(61)
wsgRNA-350171532(64)7(41)8(53)15(47)157(72)
wsgRNA-1/wsgRNA-25071623(46)5(71)12(75)17(74)123(79)
wsgRNA-1/wsgRNA-35013922(44)10(77)6(67)16(73)72(81)
wsgRNA-2/wsgRNA-350171027(54)13(76)8(80)21(78)101(85)
wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-350111021(42)9(82)9(90)18(86)149(86)

Tablo 1: Beyazı hedefleyen tek ve çoklamalı gRNA'larla enjekte edilen embriyoların sağkalım ve mutasyon oranları. Tablo30'dan izin atılmış olarak yeniden yazdırılır

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sivrisinek vektör kontrolü için genetik olarak tasarlanmış araçlar üretme çabalarıyla, yaygın sivrisinek hastalığı vektörleri için embriyo mikroenjeksiyon protokolleri geliştirmeye ve optimize etmeye ihtiyaç vardır. Aedes ve Anopheles sivrisinekleri için yöntemler geliştirilmiş olsa da, Culex için özel olarak tasarlanmış bir protokol minimal olarak araştırıldı. Genel olarak sivrisinek embriyo enjeksiyon protokolleri 3 genel adıma ayrılabilir: 1) embriyo toplama ve hazırlama, 2) embriyo enjeksiyonu ve 3) enjeksiyon sonrası iyileşme. Mutantların başarılı bir şekilde üretilebilmesi için, üç adımın da hedef türler için optimize edilmesi gerekir. Embriyo mikroenjeksiyon için bu değiştirilmiş protokol, Culex sivrisineklerinin başarılı genom mühendisliği için özeldir.

Embriyo toplamayı en üst düzeye çıkarmak embriyo mikroenjeksiyon protokollerinde yaygın bir darboğazdır. Kısa sürede toplanan yumurta sayısını artırmak için, sivrisinekler kan unu sonrası 2-3 gün boyunca bir yumurtlama substratından kısıtlandı. C. quinquefasciatus'un memeli kaynaklarının veya memeli kanıyla beslenen membranların aksine kuş kan kaynaklarını tercih etme eğiliminde olduğunu belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, birçok araştırmacı kan beslemek için güvenilir bir canlı kuş veya kuş kanı kaynağı elde etmekte zorlanabilir, bu nedenle laboratuvar stokları daha erişilebilir kan kaynaklarıyla beslenmek için uyarlanabilir. C. quinquefasciatus ve diğer çoğu Culex vektörü için yumurtlama ipuçları sağladığından, yumurtlama substratı için besin bakımından zengin su kullanmak da çok önemlidir. Mikroenjeksiyon için uygun sayıda yumurtanın mevcut olduğundan emin olmak için laboratuvarlar arasında optimize edilmesi gerekebilecek besin bakımından zengin su üretmek için birçok yöntem vardır. Örneğin, bu yöntem 5 veya daha fazla gün boyunca deiyonize suda fermente edilen tavşan dışkısı ile en başarılı olsa da, diğer araştırmacılar besin kaynağı olarak ot veya balık yemi ve hatta bazıları damıtılmış su ile daha fazla başarıya sahiptir21.

Culex sivrisinekleri sallara yumurta grupları bıraktığından, yumurta toplamak oldukça basittir. Yumurtalar, tüm salı bir boya fırçasıyla kepçeleyarak basitçe toplanabilir. Yumurta ayrımı daha karmaşıktır, ancak başarılı enjeksiyon için gereklidir. Yumurtalar, boya fırçası veya toskun ile yumurtalar arasında hafif aşağı doğru basınç uygulanarak saldan dikkatlice ayrılabilir. Bazı uygulamalarla, birden fazla kullanıcı tek yumurtaları yumurta sallarından güvenilir bir şekilde ayırabildi. Her yumurtayı ayırdıktan sonra, yumurtalar mikroenjeksiyon sırasında yumurtaları stabilize eden çift taraflı yapışkan bantta aynı yönde hizalanır. Yumurtalar konik arka uca enjekte edilir ve halokarbon yağının eklenmesi, manipülasyon sırasında yumurtaları nemli tutar.

Mikroenjeksiyon sırasında embriyo hasarını sınırlamak için enjeksiyon iğnelerinin uygun mukavemete sahip olması ve uygun bir açıyla eğimli olması gerekir. 50° açıyla 10 saniye boyunca eğimli alümilikat iğneler en iyi sonuçlara sahipti, ancak borosilikat ve kuvars iğneler daha az dayanıklı ve daha pahalı olsalar da da çalışabilir. Ek olarak, uygun iğne eğimi Cas9 ve sgRNA karışımlarının daha iyi akışını kolaylaştırır ve embriyoya daha kolay nüfuz etmek için daha keskin bir nokta oluşturur. Çoğu durumda, eğim, tıkanmış iğneleri değiştirmek için zaman ve çaba harcamak yerine tıkanmış iğneleri hızlı bir şekilde düzeltmenin etkili bir yoludur.

Enjeksiyondan sonra, yumurtalar en az 5 dakika bozulmadan kalmalı ve halokarbon yağı hemen ardından temiz bir boya fırçası ile hafifçe fırçalanarak çıkarılmalıdır. Halokarbon yağının çıkarılmasından sonra, enjekte edilen yumurtalar, tipik olarak enjeksiyondan sonraki 3 gün içinde meydana gelen yumurtadan çıkmak için suya yerlenebilir. Pratik ve yeterli sayıda yumurta ile, bu protokol C. quinquefasciatus'ta tutarlı somatik ve germline mutasyonları elde edebilir ve diğer Culex sivrisineklerine kolayca adapte olması gereken kadar çok yönlüdür.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen O.S.A.'ya yönlendirilen UCSD başlangıç fonları tarafından desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
9 oz şeffaf plastik pet bardakKaratC-KC9Böcek Yetiştirme ve Yumurta Toplama
Alüminosilikat cam kılcal boru 1mm (dış çap) X 0.58mm (iç çap)Sutter InstrumentsBF100-58-10Mikroenjeksiyon, borosilikat ve kuvars iğneleri de kullanılabilir ancak biz alüminosilikat
BloodColorado Serum Company31025'itercih ettikKoloninin bu kan kaynağına adapte olması birden fazla nesil aldı. Diğer kan kaynakları da muhtemelen aynı derecede uygundur. Kan kaynağı seçimi ile ilgili protokol notlarına bakınız.
BugdormBugdorm4F2222Böcek Yetiştirme Kafesi
Cas9 ProteiniPNABioCP01
Mikroenjeksiyon Bileşik MikroskobuOlympus BX41Mikroenjeksiyon, embriyo enjeksiyonu için
Elmas aşındırıcı plaka (0.7u ila 2.0u uç boyutları)Sutter Instruments104EMikroenjeksiyon, beveler
DNase / RNase içermeyen damıtılmış ile kullanılacak Suİnvitrojeni10977-015Mikroenjeksiyon
Çift Taraflı BantScotchB084NVQGXDMikroenjeksiyon, embriyo hizalama
Femtojet 4x veya 4i programlanabilir mikroenjektörEppendorfMikroenjeksiyon
Femtotips Mikro yükleyici uçlarıFisher ScientificE5242956003Mikroenjeksiyon
Filtre KağıdıWhatman1001-090Mikroenjeksiyon, embriyo toplama
İnce uçlu boya fırçasıZEM2595Mikroenjeksiyon, embriyo hizalama
Halokarbon yağı 27Sigma-AldrichH8773Mikroenjeksiyon, embriyo hizalama
Halokarbon yağı 700Sigma-AldrichH8898Mikroenjeksiyon, embriyo hizalama
HemotekHemotekPS5Hattı Bakımı
Mikroelektrot BevelerSutter AletleriBV10Mikroenjeksiyon, iğne eğimi Mikropipet
ÇektirmeSutter AletleriP-1000 veya P-2000Mikroenjeksiyon, iğne çekme
Mikroskop SlaytlarıFisherbrand12-550-A3Mikroenjeksiyon, embriyo hizalama
Kurumayan Modelleme KilJoviB0025Z71IMMikroenjeksiyon, iğne depolama
Stereo MikroskopOlympusSZ51Mikroenjeksiyon, embriyo hizalama için
ŞekerDominoyetişkin şeker kaynağı için% 20 şeker çözeltisi.
T7 Endonükleaz INEBM0302Mikroenjeksiyon malzemelerinin hazırlanması
TOPO TA Klonlama KitiThermoFischer ScientificK451020Mikroenjeksiyon malzemelerinin hazırlanması
Ultra ince uçlu forsepsFisher Scientific16-100-121Mikroenjeksiyon, embriyo hizalama
NLS'li

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019).">Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019).
  2. https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020).">APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020).
  3. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).">Luke George, T., et al. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).
  4. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).">van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).
  5. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880(2017).">Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880(2017).
  6. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406(2019).">Martins, W. F. S., et al. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406(2019).
  7. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).">Norris, L. C., Norris, D. E. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).
  8. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).">Corbel, V., et al. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).
  9. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17(2015).">Yadouléton, A., et al. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17(2015).
  10. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288(2015).">Atyame, C. M., et al. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288(2015).
  11. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440(2011).">Atyame, C. M., et al. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440(2011).
  12. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).">Almeida, F., et al. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).
  13. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701(2020).">Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701(2020).
  14. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11(2007).">Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11(2007).
  15. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).">Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  16. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).">Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
  17. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).">Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
  18. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103(2020).">Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103(2020).
  19. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017(2011).">Isaacs, A. T., et al. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017(2011).
  20. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403(2011).">Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403(2011).
  21. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542(2017).">Kauffman, E., et al. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542(2017).
  22. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1(2012).">Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1(2012).
  23. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253(1954).">Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253(1954).
  24. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).">Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).
  25. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).">Allgood, D. W., Yee, D. A. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).
  26. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990(2017).">Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990(2017).
  27. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).">Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).
  28. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).">Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
  29. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).">Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).
  30. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).">Li, M., et al. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).
  31. https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020).">New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Embryo MicroinjectionCulex QuinquefasciatusEgg Raft SeparationCRISPR Cas9Germline MutagenesisNeedle PreparationHalocarbon OilMicromanipulator UseSomatic MutationsEgg Collection

Related Articles