Yöntem makalesi

İskemik Böbrek Hasarı Fare Modelinin Böbrekteki MikroRNA'ları için Kantitatif Bir Tespit Yöntemi

DOI:

10.3791/61378

⸱

11 Eylül 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak akut böbrek hasarı olan bir fare modelinin böbreklerinde mikroRNA ekspresyonunu tespit etmek için bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, iskemik böbrek hasarı fare modelini ve mikroRNA örneklerinin dikkatli bir şekilde çıkarılmasını vurgular.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA'lar (miRNA'lar) çeşitli hastalık durumlarında yer alır ve farelerde hastalıkların erken teşhisi ve tedavisi için etkili biyobelirteçlerdir. Bununla birlikte, miRNA'ların saflaştırılması ve akut böbrek hasarı (AKI) farelerinin böbreklerinde ekspresyonlarının tespiti için standart protokoller iyi bir şekilde oluşturulmamıştır. Bu çalışma, kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanılarak renal iskemi-reperfüzyon ile indüklenen bir ABI fare modelinin böbreklerindeki miRNA'ları saflaştırmak ve nicelikini belirlemek için etkili ve basit bir protokol geliştirmiştir. Bu protokol beş adımdan oluşur: 1) renal iskemi-reperfüzyon ile ABH'nin indüksiyonu, 2) böbreklerin toplanması, 3) miRNA'lar dahil toplam RNA'nın böbreklerden saflaştırılması, 4) miRNA'nın ters transkripsiyonu ile cDNA sentezi ve 5) miRNA ekspresyonunu tespit etmek için qRT-PCR. Bu protokol kullanılarak, renal iskemi-reperfüzyon yaralanması modeli, hafif ila şiddetli ABH formları ile oluşturulabilir. Ek olarak, prosedür düzgün bir şekilde takip edilirse, minimum bireysel farklılıklara sahip tutarlı bir ABH modeli elde edilebilir. Bu qRT-PCR testi, çok geniş bir dinamik aralık gösterir ve yüksek özgüllük ile doğru bir şekilde ölçülebilen olgun miRNA'ların ayırt edilmesini sağlar. Bu protokol, ABH böbreklerinde miRNA ekspresyon profilini incelemek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böbreğin iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI), Akut böbrek hasarı (ABH) gelişimi için en önemli risk faktörlerinden birini temsil eder1. ABH hasta prognozunda önemli bir rol oynamaktadır, ancak spesifik tedaviler ve erken tanısal biyobelirteçler belirlenmemiştir.

MikroRNA'lar (miRNA'lar), yaklaşık 18-25 baz içeren kısa, kodlamayan RNA'lardır. miRNA'lar vücut sıvılarında stabildir ve dizileri hayvanlar arasında yüksek oranda korunur2. MiRNA'lar, binlerce hedef aracılığıyla çoklu proteinlerin ekspresyonunu düzenler, böylece çeşitli sinyal yollarını 2,3,4,5,6,7,8 etkiler. Son yıllarda, miRNA'ların çeşitli hastalık durumlarında yer aldığı ve birçok hastalığın erken tanısı için etkili biyobelirteçler olduğu bildirilmiştir.

Bu protokolün genel amacı, IRI tarafından indüklenen bir AKI fare modelinin böbreklerindeki miRNA'ları başarılı bir şekilde saflaştırmak ve tespit etmektir. Bu IRI modeli, ABH ve renal fibrozun yaygın olarak kullanılan bir modelidir. IRI modelinin avantajları arasında iskemi-reperfüzyonun başarılıp başarılmadığını görsel olarak doğrulayabilmek ve ABH başlangıcının tam zamanını belirleyebilmek yer alır. Bununla birlikte, geniş boru şeklinde hasara neden olacak kadar uzun bir kenet süresi, yüksek bir ölüm oranı ile ilişkilidir, oysa kısa bir kenet süresi tübüler hasara neden olmaz, bu da bu deneysel modelde tübüler hasar ilerlemesinde büyük bir varyasyona neden olur. Bilateral klempleme modeli ile karşılaştırıldığında, tek taraflı renal IRI modelinde alınan sağ nefrektomi dokusu kontrol görevi görür ve böbrek yetmezliğini sağlar.

Böbrek numunesi bir cam homojenizatör kullanılarak ezilir, burada proteinler ve nükleik asitler ayrılır ve DNA ve RNAayrılır 9. miRNA da dahil olmak üzere toplam RNA, silika zar bazlı bir spin sütunu9 kullanılarak böbrek örneğinden saflaştırılır. Daha sonra, poli(A) polimeraz ve oligo-dT primerleri10 kullanılarak toplam RNA'dan cDNA sentezi (ters transkripsiyon) gerçekleştirilir. Son olarak, miRNA ekspresyonu, enterkalasyon yapan bir boya10 kullanılarak qRT-PCR ile belirlenir. qRT-PCR, uç noktalardaki amplifikasyon hacimlerinin PCR'si ile karşılaştırıldığında gen ekspresyonunu daha doğru bir şekilde ölçebilir. qRT-PCR, yüksek konsantrasyonları ölçer ve döngü sayısına bağlı olarak doğru nicelemeye izin veren geniş bir dinamik aralık ile karakterize edilir. Önceki çalışmalar, dokulardaki miRNA'ları etkili bir şekilde saflaştırmak ve tespit etmek için basit işlemlerin kullanılabileceğini bildirmiştir 8,9,10. cDNA sentezi (ters transkripsiyon) ve miRNA ekspresyonunun bir interkalasyon boyası kullanılarak qRT-PCR ile saptanması için bu protokolde açıklanan yöntemlerin yüksek doğruluk ve hassasiyet gösterdiği bildirilmiştir10.

Ek olarak, bu protokol basittir ve laboratuvarlar arasında tutarlı sonuçlar elde edilmesini sağlar. Bu nedenle, bu protokol fare ABI böbreklerinde son derece hassas ve hassas miRNA tespiti gerektiren çalışmalarda faydalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deney protokolleri, Jichi Tıp Üniversitesi hayvan etik komitesi tarafından onaylandı ve Jichi Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Kılavuzu'ndaki Deney Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi.

1. IRI modeli

NOT: İşlem boyunca hipotermi, bağırsak nemlendirmesi ve anestezi derinliğini dikkatlice izleyin.

  1. Aşağıdaki öğeleri hazırlayın: izofluran ile ıslatılmış pamuk içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpü, ısıtılmış bir cerrahi ped, fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir Petri kabı, cerrahi makas ve forseps. PBS'yi 37 °C'de tutun.
    NOT: Bu IRI modeli, kontrollü sıcaklık, nem ve 12 saatlik aydınlık-karanlık döngüsüne sahip bir odada barındırılan erkek C57BL/6 fareler (9 hafta; 20-25 g) kullanılarak oluşturulmuştur.
  2. Hayvanı izofluran kullanarak uyuşturun: indüksiyon konsantrasyonu %3-5, bakım konsantrasyonu %2-%3 ve klempleme sırasındaki konsantrasyon %1-1.5. Anestezi derinliğini refleks kaybı ile onaylayın. İnhalasyon anestezisi, zamanın ayarlanabilmesi avantajına sahiptir. İşlem, böbreği çevreleyen dokunun pul pul dökülmesi nedeniyle önemli miktarda zaman alabilir. Bununla birlikte, inhalasyon anestezisinin dezavantajı, vücut sıcaklığının düşme eğiliminde olmasıdır. İşlem boyunca gereksiz anesteziden kaçının.
  3. Anestezi uygulanmış fareyi sırtına ısıtılmış bir cerrahi ped üzerine monte edin, kesi alanını çevreleyen tüyleri alın ve farenin karın derisine %70 etanol püskürtün.
  4. Makas ve forseps kullanarak karın derisi, kas ve periton zarında orta hat kesisi yapın.
  5. PBS ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanarak, bağırsağı nazikçe karın dışı boşluğun sol tarafına doğru itin ve sağ böbrek ve üreteri açığa çıkarın. İşlem süresinin uzun olması ameliyat sonrası bağırsak yaralanmasına neden olabilir. Bu nedenle, bir görme alanı elde edilebildiğinde bağırsakları karın boşluğundan çıkarmadan ameliyat etmek daha iyidir. Bağırsakları kurutmaktan kaçının. Kuru bezler veya gazlı bez bağırsak hasarına neden olabilir.
  6. Sağ üreteri açılı forseps ile kaldırın. Sağ üreteri 4/0 ipek örgülü sütürlerle iki kez bağlayın. Dikişler arasında kesin, böbreğe daha yakın olan dikişi daha uzun süre bırakın.
  7. Kalan dikişi çok fazla çekmeden dikkatlice tutun ve böbrek boyunca bağ dokusunu ve yağı kör bir şekilde inceleyin. Arkadan ameliyat yapmak karaciğer hasarı riskini azaltır.
    1. Sağ böbreğe kan sağlayan renal arterler ve damarlar dışında bir kan damarı tanımlayın ve ardından onu bağlayın veya klipsleyin. Sağ böbrek yeterince ayrıldığında, sağ renal arteri ve veni 4/0 ipek örgülü bir sütür kullanarak bağlayın. Dikiş atmak yerine hemostatik bir klips kullanın.
    2. PBS ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanarak, sol böbreği açığa çıkarmak için bağırsağı ekstra karın boşluğunun sağ tarafına doğru hafifçe itin ve ardından kurumasını önlemek için bağırsağı nemli bir örtü ile örtün. Sol böbreğin etrafındaki bağ dokusunu ve yağı inceleyin.
  8. Sol böbreğe kan sağlayan renal arterler ve damarlar dışında bir kan damarı tanımlayın ve ardından onu bağlayın veya klipsleyin. Sol böbrek iskemisini indüklemek için renal arteri ve renal veni klempleyin. Böbrek parankimine zarar vermemek için hemostatik klipsi böbrekten yaklaşık 1 cm uzağa yerleştirin. Başarılı iskemi, böbreğin kademeli olarak düzgün bir şekilde koyulaşması ile görsel olarak doğrulanabilir.
  9. Bağırsakların bükülmesini önlemeye dikkat ederek bağırsakları karın boşluğuna geri koyun; Nemli bir ortam sağlamak için karın derisini ve örtüyü geçici olarak kapatın. İnhalasyon anestezisi konsantrasyonunu mümkün olduğunca azaltın ve hayvanı sıcak tutmaya çalışın. Sıkıştırma süresi 25–45 dakikadır. Daha uzun bir klempleme süresi daha ciddi böbrek hasarına neden olur, ancak aynı zamanda uzun süreli mortaliteyi de artırır. Patoloji sonuçlarını analiz ederek ayarlayın.
  10. İskemi süresi sona erdikten sonra kelepçeyi çıkarın. Kan akışının, reperfüzyonun ve böbrek renginin iyileştiğinden emin olun. Karın derisini kapatmadan önce bağırsağın bükülmediğini onaylayın. Karın iki kat halinde kapatılmadan önce PBS'yi intraperitoneal olarak hacim takviyesi olarak damlatın. Karın derisini 4-0 naylon dikişlerle kapatın. Daha uzun böbrek çekilme sürelerinde, karın duvarı ve karın zarının ayrı ayrı kapatılmasıyla bağırsak yapışıklığı olasılığı azaltılabilir.
  11. Ameliyat sonrası enfeksiyon riskini en aza indirmek için cerrahi bölgeye antiseptik (örn. iyot/alkol solüsyonu) uygulayın.

2. Böbrek örneği toplama

NOT: Bu video, 24 saat sonra böbrekleri toplayan 45 dakikalık bir sıkıştırma süresine sahiptir.

  1. Hayvanı% 5 izofluran ile uyuşturun ve refleks kaybıyla anestezi derinliğini doğrulayın.
  2. Makas ve forseps kullanarak karın derisi, kas ve periton zarında orta hat kesisi yapın. 27 G'lik bir iğne ile delinmiş inferior vena kavadan kanı toplayın.
  3. Göğüs duvarında orta hat insizyonu yapın ve sol ventriküle 23 G'lik bir iğne yerleştirin. Geri akışı onaylayın. Karaciğerde bir kesi yapın ve 20 mL PBS enjekte edin. Kan boşaldıkça, karaciğerin rengi kırmızıdan pembeye değişir ve yeterli kanın boşaltıldığını doğrular.
  4. Forseps ve makas kullanarak sol böbreği çıkarın ve bir Petri kabında PBS ile yıkayın. Böbreği kurutmamaya dikkat ederek forseps kullanarak böbrek fasyasını çıkarın.
  5. Böbreği ikiye bölün ve bir yarısını histopatoloji için, diğer yarısını bir sonraki adım için kullanın. Renal pelvisten kaçının ve 30 mg böbreği toplayın. Kullanmadan önce bunu -80 °C'de saklayın.

3. Böbrek örneklerinden miRNA'ların saflaştırılması

NOT: Burada, 30 mg ağırlığındaki böbrek numuneleri, bir mikrosantrifüj spin kolonunda bir cam homojenizatör ve bir biyopolimer parçalama sistemi kullanılarak homojenize edilir. Daha sonra, böbrek örneğinden alınan miRNA, silika zar bazlı bir spin kolonu kullanılarak izole edilir.

  1. Aşağıdaki öğeleri hazırlayın: 1.5 veya 2.0 mL mikrosantrifüj tüpleri, %100 etanol, kloroform, bir cam homojenizatör, buz, mikrosantrifüj döndürme sütunu9'da bir biyopolimer parçalama sistemi, silika membran bazlı döndürme sütunları9, fenol/guanidin bazlı lizis reaktifi, guanidin ve etanol içeren yıkama tamponu (yıkama tamponu 1) ve etanol içeren yıkama tamponu (yıkama tamponu 2).
  2. 30 mg'lık bir böbrek örneğini bir cam homojenizatöre yerleştirin ve 700 μL fenol/guanidin bazlı lizis reaktifi ekleyin. Bu adımı buz üzerinde gerçekleştirin çünkü doku ısı ile denatüre olur.
  3. Böbrek örneğini, tokmağı çevirerek numunenin üzerine yavaşça bastırarak homojenize edin. Böbrek örneği fenol / guanidin bazlı lizis reaktifi içinde tamamen çözülene kadar bu işlemi buz üzerinde birkaç düzine kez tekrarlayın. Sonraki ölçümlerde miRNA elde edilmediğinde, bu muhtemelen yetersiz çözünmeden kaynaklanmaktadır.
  4. Daha fazla homojenizasyon için, homojenize lizatı 2.0 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirilmiş bir mikrosantrifüj spin kolonunda biyopolimer parçalama sistemine aktarın. Bunu oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 14.000 × g'da santrifüjleyin.
  5. Homojenize lizatı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  6. Homojenize lizata 140 μL kloroform ekleyin ve tüpü sıkıca kapatın. Tüpü 15 saniye ters çevirerek karıştırın.
  7. Numuneleri oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin. Daha sonra 12.000 × g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
  8. Süpernatanı (normalde 300 μL) çökeltiyi bozmadan yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 1.5 hacim (normalde 450 μL)% 100 etanol ekleyin. Numuneyi 5 saniye girdaplayarak karıştırın.
  9. 700 μL'ye kadar numuneyi 2,0 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirilmiş silika membran bazlı bir döndürme kolonuna pipetleyin. Kolon kapağını kapatın ve 15.000 × g'da 15 saniye boyunca santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, toplama tüpündeki akışı atın.
  10. Numuneyi iyice yıkamak için silika membran bazlı döndürme kolonuna 700 μL yıkama tamponu 1 ekleyin. Kolonun kapağını kapatın ve 15 saniye boyunca 15.000 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, toplama tüpündeki akışı atın.
  11. Tuz kalıntılarını gidermek için silika membran bazlı döndürme kolonuna 500 μL yıkama tamponu 2 ekleyin. Kolonun kapağını kapatın ve 15.000 × g'da 15 saniye santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, toplama tüpündeki akışı atın.
    1. Adım 3.11'i tekrarlayın.
  12. Silika membran bazlı spin kolonunu 15.000 × g'da 1 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, toplama tüpündeki akışı atın.
  13. Silika membran bazlı spin kolonunu 1,5 mL'lik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. Kolona 25 μL RNaz içermeyen su aktarın ve kolon kapağını kapatın. Numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika bekletin ve ardından 15.000 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
  14. MiRNA'ları içeren 25 μL'lik elüatı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. miRNA tekrarlanan çözünme ile bozunduğundan, numunenin 2 veya 3 tüpe dağıtılması önerilir. Bunları kullanmadan önce -80 °C'de saklayın.

4. miRNA'nın ters transkripsiyonu

NOT: Burada, 1.0 μg izole edilmiş RNA, ters transkriptaz, poli(A) polimeraz ve oligo-dT primerleri kullanılarak ters kopyalanır.

  1. Aşağıdaki öğeleri hazırlayın: 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri; 8 oyuklu şerit tüpler; RNaz içermeyen su; buz; deoksinükleotidler, ribonükleotid trifosfatlar ve oligo-dT primerleri içeren 10x Nükleik Asit Karışımı; bir poli(A) polimeraz ve ters transkriptaz karışımı; ve Mg2 +, deoksiribonükleotidler, oligo-dT primerleri ve rastgele primerler10 dahil olmak üzere aktive edici tampon.
  2. 2.0 μL 10x Nükleik Asit Karışımı, 2.0 μL poli(A) polimeraz ve ters transkriptaz karışımı ve Mg2+, deoksiribonükleotidler, oligo-dT primerleri ve rastgele primerler dahil olmak üzere 4.0 μL 5x aktive edici tampon içeren bir ana karışım çözeltisi hazırlayın, tüp başına toplam 8.0 μL.
  3. Her tüpe 8.0 μL ana karışım çözeltisi dağıtın.
  4. Her tüpe böbrek örneğinden saflaştırılmış 1.0 μg izole miRNA ekleyin.
  5. Her tüpe toplam 20 μL'ye kadar RNaz içermeyen su ekleyin. Pipetleyerek iyice karıştırın ve 15 saniye boyunca 1.500 x g'da santrifüjleyin.
  6. Numuneleri 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin, ardından hemen 95 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Bu adım bir termal döngüleyicide gerçekleştirilebilir.
  7. cDNA'yı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve RNaz içermeyen su ile 10 kez (1:10) seyreltin.
  8. Seyreltilmiş cDNA'yı kullanmadan önce kısa süreli buz üzerinde ve uzun süreli olarak -80 °C'de saklayın.

5. miRNA'nın qRT-PCR'si

NOT: miRNA'nın qRT-PCR'si, ara ayırıcı bir boya kullanılarak gerçekleştirilir. Burada, U6 küçük nükleer 2 (RNA-2), miRNA-17-5p, miRNA-18a-5p, miRNA-21a-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p ve miRNA-574-5p için primerler kullanıldı.

  1. Aşağıdaki öğeleri hazırlayın: 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri, qRT-PCR için 96 oyuklu reaksiyon plakaları, 96 oyuklu reaksiyon plakası için yapışkan film, miRNA'ya özgü primerler, Taq DNA polimeraz, PCR tamponu, deoksinükleotidler ve evrensel primerler10 içeren PCR Master Mix ve gerçek zamanlı bir PCR Cihazı.
  2. 12,5 μL 2x PCR Master Mix, nükleaz içermeyen suda çözülmüş her bir miRNA primerinden (5 μM) 2,5 μL ve her kuyucuk için 1,25 μL 10x evrensel primer içeren bir ana karışım hazırlayın.
  3. 22.5 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 96 μL ana karışım dağıtın.
  4. Her oyuğa 2,5 μL şablon cDNA ekleyin.
  5. Plakayı, 96 oyuklu reaksiyon plakası için yapışkan film ile kapatın. Ardından, plakayı 30 saniye boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin.
  6. Gerçek zamanlı PCR cihazını ve yazılımını kullanarak PCR döngü programını aşağıdaki gibi çalıştırın.
    1. Plakayı gerçek zamanlı PCR cihazına yerleştirin. Örneğe bir isim atayın ve Real-Time PCR yazılımını kullanarak her kuyucukta miRNA'yı hedefleyin.
    2. Talimatlara göre gerçek zamanlı PCR yazılımına aşağıdaki PCR döngü koşullarını girin: 95 ° C'de 15 dakika ön inkübasyon, ardından 15 saniye boyunca 94 ° C'de 40 döngü denatürasyon, 55 ° C'de 30 saniye tavlama ve 70 ° C'de 30 saniye uzatma.
  7. Gerçek zamanlı PCR cihazının yazılımını kullanarak qRT-PCR verilerini analiz edin. Spesifik olmayan reaksiyonları kontrol edin. Amaçlanan amplifikasyon dışında bir amplifikasyonun meydana gelmediğini doğrulamak için Ayrışma eğrisini veya Erime eğrisini analiz edin.
    1. Hedef miRNA'ların ekspresyon seviyesini endojen bir kontrol olarak RNU-6'ya normalleştirin. 2−ΔΔCT yöntemini11 kullanarak hedef miRNA'ların nispi ekspresyon seviyesini hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, ABI farelerinde miRNA ekspresyon profili araştırıldı. MiRNA ekspresyon profili, farelerde çeşitli organ ve dokularda araştırılmıştır. MiRNA'lar önemli transkripsiyon sonrası düzenleyicilerdir ve şu anda AKI dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların karakterizasyonunda kapsamlı bir şekilde incelenmektedir. MiRNA'lar, patolojik durumları aydınlatmaya yardımcı olma ve ABI12'nin tedavisine uygulanma potansiyeline sahiptir. ABH'nin başlıca nedenleri IRI, nefrotoksik hakaret ve sepsistir. Böbreğin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda sunulan protokol kullanılarak, IRI farelerinin böbreğinden alınan miRNA'lar başarılı bir şekilde saflaştırıldı ve qRT-PCR kullanılarak tespit edildi. Protokoldeki IRI indükleyici prosedürün kritik noktaları, ABI20'yi etkilediği bilinen vücut ısısının ve anestezi konsantrasyonlarının dikkatli bir şekilde izlenmesini içerir. Bu protokolün gücü, iskemi-reperfüzyonun başarılıp başarılamadığının görsel olarak doğrulanmasına izin vermesidir. Ancak, bu IRI mode...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazmasının taslağını düzenlediği için Dr. Nam Nguyen'e teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kancasız Bükülmüş Uçlu Konik CımbızNatsume SeisakushoMA-47
Tampon RLTQiagen79216yıkama tamponu 1
Tampon RWTQiagen1067933yıkama tamponu 2
C57B6 fareSLC
Natsume SeisakushoMA-49
Dişsiz forsepNatsume SeisakushoMA-48-1
Hemostatik klipslerNatsume SeisakushoKN & eksi;
MicroAmp Optik 96 kuyulu reaksiyon plakası96 kuyulu reaksiyon plakası
MicroAmp Optik Yapışkan FilmThermo Fisher Scientific431197196 kuyulu reaksiyon plakası için yapışkan film
miRNA-132-3p astarQiagenMS000034585'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p astarQiagenMS000292745'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p primerQiagenMS000315145'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
miRNA-212-3p primerQiagenMS000038155'UAACAGUCUCCACACGGCC
miRNA-21a-5p primerQiagenMS000090795'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miRNA-223-3p primerQiagenMS000038715'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCA
miRNA-574-5p astarQiagenMS000436175'UGAGUGUGUGUGUGUGUGUGU
miRNeasy Mini kitQiagen217004silika membran tabanlı döndürme sütunu
miScript II RT kitiQiagen218161
miScript SYBR Yeşil PCR kitiQiagen218073
QIA parçalayıcıQiagen79654santrifüj spin-kolon
QIAzol Lizis ReaktifindeQiagen79306fenol/guanidin bazlı lizis reaktifi
QuantStudio 12K Flex Flex Gerçek Zamanlı PCR sistemiThermo Fisher Scientific4472380gerçek zamanlı PCR cihazı
QuantStudio 12K Flex Yazılımı sürüm 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380gerçek zamanlı PCR cihaz yazılımı
RNU6-2 primerQiagenMS00033740açıklanmayan
cerrahi makasNatsume SeisakushoB-2
Vasküler klips uygulayıcısıVITALITEC1621420
Dişli forsep atamıyor qRT-PCR Thermo Fisher Scientific 4316813 için 353 mikro biyopolimer parçalama sistemi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, K. J. Acute renal failure: much more than a kidney disease. Seminas in Nephrology. 26 (2), 105-113 (2006).
  2. Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clinical Chemistry. 60 (9), 1158-1173 (2014).
  3. Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiological Reviews. 96 (4), 1297-1325 (2016).
  4. Yang, G., et al. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
  5. Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 463 (1-2), 60-63 (2015).
  6. Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
  7. Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. Journal of Surgical Oncology. 111 (8), 992-999 (2015).
  8. Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinial Medicine. 169, 47-66 (2016).
  9. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  10. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  11. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  12. Jonas, S., Izaurralde, E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nature Reviews. Genetics. 16 (7), 421-433 (2015).
  13. Ichii, O., Horino, T. MicroRNAs associated with the development of kidney diseases in humans and animals. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 23-34 (2018).
  14. Ma, L., et al. Changes of miRNA-17-5p, miRNA-21 and miRNA-106a level during rat kidney ischemia-reperfusion injury. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 95 (19), 1488-1492 (2015).
  15. Saikumar, J., et al. Expression, circulation, and excretion profile of microRNA-21, -155, and -18a following acute kidney injury. Toxicological Sciences: an Official Journal of the Society of Toxicology. 129 (2), 256-267 (2012).
  16. Li, Y. F., et al. MicroRNA-21 in the pathogenesis of acute kidney injury. Protein & Cell. 4 (11), 813-819 (2013).
  17. Zhou, J., Chen, H., Fan, Y. Systematic analysis of the expression profile of non-coding RNAs involved in ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury in mice using RNA sequencing. Oncotarget. 8 (59), 100196-100215 (2017).
  18. Liu, Y., et al. MicroRNA expression profile by next-generation sequencing in a novel rat model of contrast-induced acute kidney injury. Annals of Translational Medicine. 7 (8), 178(2019).
  19. Colbert, J. F., et al. A model-specific role of microRNA-223 as a mediator of kidney injury during experimental sepsis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (2), 553-559 (2017).
  20. Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation Proceedings. 39 (10), 2983-2985 (2007).
  21. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59(2005).
  22. Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

MikroRNA Safla t rmaqRT PCR TespitiAkut B brek HasarRNA zolasyonucDNA SenteziKantitatif PCRB brek skemi ModeliBiyobelirte TespitiMikroRNA Kantifikasyonu

İlgili makaleler