Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Gümüş Sazan, Hipoftalmichthys molitrix Gill Raker Mucus Makro-Reoloji Karakterizasyonu

2.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61379

⸱

10 Temmuz 2020

 ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, The George Washington University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, gümüş sazan solungaç rakers (GR) üzerinde bulunan mukus reoloji karakterizasyonunu gerçekleştirmek için bir yöntem sunar. Viskozite, depolama ve kayıp modülü ölçülerek elde edilen GR-mukusun viskoelastik özellikleri, GR'lerdeki filtre besleme mekanizmasını anlamak için belirgin verim stresi açısından değerlendirilir.

Özet

Gümüş sazan, Hypophthalmichthys molitrix, yüksek verimli filtre besleme mekanizması nedeniyle yukarı Mississippi Nehri havzasının doğal su yollarını istilacı bir planktivor filtre besleyici balıktır. Bu tür birçok filtre besleyicide bulunan solungaç tırmıkları (GR) adı verilen karakteristik organlar, birkaç mikron büyüklüğündeki fitoplanktonlar gibi gıda parçacıklarının verimli filtrasyonunu kolaylaştırır.

GR mukusun reolojisini araştırma motivasyonu, gümüş sazandaki filtre besleme sürecine yardımcı olmadaki rolünü anlama isteğimizden kaynaklanmaktadır. Mukus bakımından zengin sıvı, 'kalın ve yapışkan' bir durumda gıda partiküllerinin yapışmalarını kolaylaştırabilir. GR membranındaki geçirgenlik ve taşıma, değişen kesme gerilme hızlarını indükleyen dış kesme kuvvetlerinin etkisiyle kolaylaşır. Bu nedenle, mukus reolojisi, filtre besleme balığı havuzu içindeki gümüş sazanın muazzam rekabet edici doğasına dair hayati bir ipucu sağlayabilir. Buna dayanarak, GR mukus'un gıda parçacıklarına yapışkan bir işlev sağlayabileceği ve filtre besleme işlemine yardımcı olmak için bir taşıma aracı olarak hareket edebileceği ortaya atmıştır.

Protokolün temel amacı, yapılandırılmış viskoelastik bir malzemede geri dönüşü olmayan plastik deformasyonun ilk kez gözlendiği akışı başlatmak için gereken minimum kesme stresine atfedilen mukus verim stresini belirlemektir. Buna göre, GR mukusunun reolojik özellikleri, yani viskozite, depolama ve kayıp modülü, dönme reometresi kullanılarak Newton olmayan, kesme inceltici doğası açısından araştırılmıştır.

Burada sunulan bir protokol, Missouri Nehri'nin Hart Creek mevkiinde avlanan gümüş bir sazan balığının solungaç tırmıklarından çıkarılan mukusun reolojik özelliklerini analiz etmek için kullanılır. Protokol, yapılandırılmış viskoelastik bir malzeme olduğu varsayılan mukusların reolojik test ve malzeme karakterizasyonu için etkili bir strateji geliştirmeyi amaçlamaktadır.

Giriş

Gümüş sazan, Hypophthalmichthys molitrix, planktivor bir filtre besleyici ve Amerika Birleşik Devletleri'nde birkaç doğal su yoluna sızmış istilacı bir türdür. Bu tür başlangıçta alg çiçeklenmelerini kontrol etmek için yukarı Mississippi Nehri havzasında tanıtıldı1,2,3. Gümüş sazanı son derece verimli bir besleyicidir. Tipik olarak, tüketilebilir gıda partikül boyutları 4 ila 20 μm arasında değişmektedir ve yaklaşık 80 μm3,4,5olan daha büyük zooplanktonlardır. Bu tür diğer yerli balıkları geride sağlamıştır ve mevcut kaynakları1,2,6sınırlayarak yerel su yollarına büyük zarar verebilir. Bu nedenle, gümüş sazanı ve kocabaş sazanı gibi filtre besleme balıkları Büyük Göller 1 , 2,6,7,8için büyük bir tehdit oluşturur.

Filtre besleme balıkları, yüzeylerinde bulunan ince bir mukus tabakası ile solungaç tırmıkları (GR) adı verilen özel organlara sahiptir. Bu organlar, gelen sıvıdan gelen küçük parçacıkların filtrasyon ve toplanmasının verimliliğini artırır. Burada sunulan protokolün amacı, newton olmayan, kesme inceltici malzeme özelliğini karakterize etmek ve gümüş sazandaki solungaç rakerlerinin iç yüzeyinden elde edilen GR mukusun verim stresini karakterize etmektir. Rotasyonel bir reometre kullanılarak tespit edilen GR-mukus verim stresinin değeri bu çalışmada ilgi çekicidir. "Belirgin verim stresi" olarak da adlandırılan ölçülen verim stresi, sabit kesme hızı veya dinamik salınımlı gerinim tipi9,10gibi testyöntemlerinebağlıdır. Kesme inceltme, 'verim-stres sıvısı', kritik bir uygulamalı stres9,11'dekatı benzeri davranıştan sıvı benzeri davranışa geçişten geçer. Belirgin verim stresi, akışı başlatmak için gereken minimum kesme stresidir veya mukus jel benzeri bir malzemeden sıvı benzeri bir malzemeye geçtiğinde geri dönüşü olmayan plastik deformasyonun ilk gözlendiği şeydir. Bu davranış yapılandırılmış viskoelastik malzemelerde gözlenebilir. GR mukusunun jel benzeri davranışından sıvı benzeri davranışına geçiş, iki işlev gerektirir, yani gıda partiküllerini toplamak için yapışkan bir rol ve partikül teslimatı ve filtrasyon sürecine yardımcı olmak için bir nakliye aracı rolü. Mukusun genişletilmiş işlevi, hastalık direnci ve solunumunda difüzyon bariyerleri oluşturmayı, beslenme faktörlerinin, toksik bileşenlerin ve atılımın kontrollü salınımını sağlamayı, beslenme ve yuvalama için metabolik yollar oluşturmayı, avcı korumasına yardımcı çalışmayı ve hareket ve itici verimliliği artıran sınır katmanı modifikasyonları üretmeyi içerir12,13,14.

Basit sıvıların aksine, mukus gibi karmaşık sıvılar akış koşullarına göre değişen özelliklere sahiptir ve toplu ölçek fiziksel davranışlarını tanımlamak için ek ölçüm parametreleri gerektirir. GR mukus viskozitesini ve verim stresini izlemek için reolojik ölçümler rotasyonel bir reometre kullanılarak gerçekleştirilir. Rotasyonel reometre, sıvı örneğiyle temas eden dönen bir disk vasıtasıyla sabit veya salınımlı bir kesme gerilimi veya gerinim uygular ve yanıtını ölçer. Bu enstrümanı ve tekniği kullanmanın arkasındaki mantık, reometrenin gümüş sazanının GR mukusunun malzeme özelliklerini tanımlamak için bir dizi ölçüm sağlayabilmesidir, bu da tek başına viskozite ile tanımlanamaz.

Mukus viskoelastik bir malzemedir ve dayatılmış bir deformasyona karşı mekanik tepkisi saf bir katının (Hooke'un esneklik yasasına tabidir) ve saf bir sıvının (Newton'un viskozite yasasına tabidir)arasında 15,16. Mukusun içinde bulunan karmaşık makromoleküler ağ, dış güçlere veya deformasyona yanıt olarak uzayabilir ve yeniden yönlendirilebilir. Dönme reometresi, Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterildiği gibi bir koni geometrisi ve bir Peltier plakasından oluşur (enstrümantasyon özellikleri için bkz. Tablo 1). Bu çalışmanın amacı GR mukusunun reolojik özelliklerini belirlemek için bir protokol geliştirmekti. Rotasyonel reometrenin bir viskometreye göre bir avantajı, küçük numune hacimlerini kullanarak dinamik ölçümler yapabilmesidir. Bu çalışmada GR mukus örneklemi yaklaşık 1.4 mL idi. Öte yandan, viskometre sabit kesme hızları ile sınırlıdır ve büyük numune hacimleri gerektirir.

Mukusun reolojik özelliklerinin gümüş saza anatomisi içinde büyük ölçüde değişmesi beklenir. Örneğin, GR yüzeylerinde bulunan mukus özellikleri epibranchial organdan farklı olabilir. Balığın farklı bölgelerindeki mukus özelliklerinin potansiyel değişkenliğini hesaba katmak için, elde edilen GR mukus örneği seyreltildi ve rotasyonel reometre kullanılarak üç konsantrasyonda çözeltiler oluşturuldu ve test edildi.. Protokolün yürütülmesinden sonra bildirilen mukus reolojisi ile ilgili veriler ve sonuçlar ölçüm tekniğinin etkinliğini göstermiştir. Bu makalede sunulan açıklayıcı veriler tüm gümüş saza popülasyonu genelinde genelleştirilmemiştir. Burada sunulan protokol, diğer hipotezleri test etmek için daha büyük örnek kümelerinde mukus reolojisini araştırmak için genişletilebilir.

Bu çalışmanın amacı GR mukus reolojisinin reolojik özelliklerinin üç farklı mukus konsantrasyonu (400 mg/mL, 200 mg/mL ve 100 mg/mL) ile varyasyonunun ortaya koymaktır. 400 mg/mL konsantrasyonu, balık GR'lerinden hasat edilen ham mukus örneğini temsil eder. Mukus örneklerinin seyreltilmesi, kesme inceltme derecesinin ve belirgin verim stresinin konsantrasyonun bir işlevi olarak değerlendirilmesine ve GR mukusunun Newton olmayan davranışlara geçiş konsantrasyonunun belirlenmesine izin verdi. Bir çalkalayıcı, romatolojik verilerdeki hataları azaltmak için örneklerdeki büyük mukus kümelerini parçalamak için kullanıldı.

Balıklar da dahil olmak üzere çoğu omurgalıda, baskın mukus oluşturan makromoleküller, dolanıklıklar veya kimyasal çapraz bağlama ile suda şişme eğiliminde olan ve jel benzeri bir malzeme oluşturan glikoproteinlerdir (mucinler)12,13,17 ,18,19,20. Yüksek moleküler ağırlıklı, jel oluşturan makromoleküller ve yüksek su içeriği mukustaki kayganlığı yansıtır13. Makromoleküler etkileşimlerin yüksek derecede jel oluşumuna yol haline, düşük makromoleküler etkileşim seviyeleri veya kırık bağlar yüksek viskoziteli sıvılarla sonuçlanır21.

Filtre besleme balıklarında gıda partikül filtrasyonu süreçleri, yapıştırma potansiyelini belirleyen uyum ve viskozite gibi GR mukusla ilgili özellikler tarafından desteklenir ve22. Mukus bazlı yapışma kuvveti spesifik intermoleküler, elektrostatik veya hidrofobik etkileşimlere bağlıdır23. Sanderson ve ark.24, karabalıkta mukus bazlı yapışıklık için kanıt buldukları bir süspansiyon besleme çalışması yaptı. Askıya alınmış gıda partiküllerinin mukozal bir yüzeye yapışmasının, mukusla birbirine bağlanmış partiküllerin birleştirilmiş kümelerinin yönlendirilmiş su akışı ile taşınması ile takip edildiğini belirttiler24. Su akışından kaynaklanan kesme gerinim oranlarına maruz kalan mukus, gıda partiküllerinin sindirim organlarına teslimini kolaylaştırır. Filtrelenmiş parçacıkları gözlemlemek için endoskopik teknikler kullanılmıştır24.

GR mukus reolojik testinde kesme oranları ve pratik sınırlar aralığına ilişkin literatür azdır. Bu nedenle, mide, burun, servikal ve akciğer mukusu, somon derisi mukus, hagfish slime ve kemik-eklem yüzey yağı üzerinde yapılan reolojik çalışmalardan rehberlik arandı ve burada reolojik karakterizasyon ve Newton olmayan özelliklerincelendi 11,12,25 , 26,27,28,29,30,31. Daha yakın zamanda, balık derisi mukusunun hareket ve itici verimlilik üzerindeki etkisi sabit kesme hızı viskometrisi kullanılarak incelenmiştir. Deniz levreği, levrek ve yetersiz ile ilgili cilt mukus reolojisi çalışmaları (herhangi bir seyreltme veya homojenizasyon olmadan) tipik olarak düşük kesme oranlarında Newton dışı davranışlar göstermiştir14.  İlgili başka bir çalışmada, Senegal tabanının dorsal ve ventral taraflarından alınan ham deri mukus örneklerinin Newton olmayan davranışlar sergilediği ve32olarak kabul edilen tüm kesme oranlarında ventral mukusun daha yüksek viskozitesini gösterdiği bulunmuştur. Hidrojel iskele gelişimi ve sabit bir kesme hızı viskometresi kullanılarak yüksek konsantre süspansiyonlar için diğer reolojik protokoller de literatürdebildirilmiştir 33,34.

Bu çalışmada, GR mukus özellikleri, karmaşık biyolojik sıvılar üzerinde yapılan reoloji deneylerinde yaygın olarak kullanılan gerinim hızı kontrollü, rotasyonel reometre kullanılarak araştırılmıştır25. Newton sıvıları için, görünür viskozite sabit kalır, kesme hızından bağımsızdır ve kesme gerilmeleri kesme gerilme oranlarına göre doğrusal olarak değişir (Şekil 3A, B). Newton dışı sıvılar için (kesme inceltme sıvıları gibi) viskozite kesme hızına veya deformasyon geçmişine bağlıdır (Şekil 3A, B). Kayıp modülü (G"), malzemenin akış eğilimine ne ölçüde direndiği ve akışkan viskozitesini temsil ettiği dereceyi temsil eder (Şekil 4). Depolama modülü (G'), malzemenin stres kaynaklı deformasyonu takiben orijinal şeklini geri kazanma eğilimini temsil eder ve elastikiyete eşdeğerdir (Şekil 4). Faz açısı (δ) veya kayıp teğet değeri, G"/G'nin ters tanjantından hesaplanır. Enerji kaybı ve depolama arasındaki dengeyi temsil eder ve ayrıca viskoelastik malzemeleri karakterize etmek için ortak bir parametredir (Bir Hookean katısı için δ = 0° ; viskoz bir sıvı için δ = 90 ° ; viskoelastik bir katı için 45 ° δ < ve viskoelastik bir sıvı için 45 ° δ >) (Şekil 4)25. Yapılandırılmış sıvılardaki belirgin verim stresi (σy),sabit durum süpürme ve dinamik gerilme-gerinim süpürmelerinden reolojik verilerde gözlemlenebilen bir durum değişikliğini temsil eder10. Harici uygulanan stres belirgin verim stresinden daha azsa, malzeme elastik olarak deforme olur. Stres görünür verim stresini aştığında (Şekil 3B'de"ortalama stres" olarak işaretlenmiştir), malzeme elastikten plastik deformasyona geçiş yapacak ve sıvı durumunda akmaya başlayacaktır35. Salınımlı gerilme (veya gerinim) koşulları altında mukus numuneslerindeki depolama modülünün (G') ve kayıp modüllerinin (G") ölçülmesi, jel benzeri sıvı benzeri davranıştan malzeme durumundaki değişimi ölçer.

Depolama modülü (G'), kayıp modülü (G") ve görünür viskozite (η) ile ilgili verileri izlemek için gerçekleştirilen reometre testlerinin türleri burada açıklanmıştır. Dinamik salınım testleri (gerinim süpürme ve frekans taramaları) koni geometrisinin kontrollü salınımı altında G' ve G" izledi. Dinamik gerinim süpürme testleri, içsel malzeme yanıtını izleyerek mukusun doğrusal viskoelastik bölgesini (LVR) belirledi (Şekil 4). Sabit salınım frekansı ve sıcaklığında verim davranışını belirlemek için gerinim süpürmeleri kullanıldı. Dinamik frekans süpürme testleri, sabit bir genlikte (gerinim veya stres) ve sıcaklıkta artan frekansa (deformasyon oranı) malzeme tepkisini izledi. Dinamik frekans süpürme testleri için doğrusal viskoelastik bölgede (LVR) gerinim korundu. Sabit hal kesme hızı testleri, koni geometrisinin sabit dönüşü altında görünür viskoziteyi (η) izledi. GR mukus artımlı stres adımlarına maruz kaldı ve belirgin viskozite (η, Pa.s) değişen kesme hızı (ý, 1/s) için izlendi.

Bu makalede sunulan protokol, GR mukusunu belirli bir lineer viskoelastik tepki aralığına sahip, viskoelastisitesi bilinmeyen karmaşık yapılandırılmış bir malzeme olarak ele almaktadır. Balık mukusu, Missouri Nehri'ndeki Hart creek mevkiinde bir balık avı sırasında gümüş sazan GR'lerinden Profesör L. Patricia Hernandez (Biyolojik Bilimler Bölümü, George Washington Üniversitesi) 1, 2,36tarafından çıkarıldı.  Şekil 5A'da Gümüş sazanın ağzının içindeki bir dizi GR gösterilir ve Şekil 5B'deşematik bir çizim sunulmuştur. Ekscised GR Şekil 5C'degösterilmiştir.  Gümüş sazan GR'lerden mukus çıkarılması şematik çizimlerde örnek olarak sunulmuştur, Şekil 5D, E. Tüm reometre testleri, 22 ± 0.002 ° C sabit, kontrollü bir sıcaklık altında yapıldı, balıkçılık alanında kaydedilen sıcaklık1,2,36.  Her mukus örneği reometre ile üç kez test edildi ve ortalama sonuçlar istatistiksel hata çubuklarıyla birlikte sunuldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Çeşitli konsantrasyonlardaki mukus çözeltilerinin hazırlanması

NOT: Bu deney için üç konsantrasyon mukus çözeltisi (sırasıyla 400 mg/mL, 200 mg/mL ve yaklaşık hacimli 100 mg/mL, 1 mL, 1 mL ve 2 mL) hazırlanır.

  1. Mukus kütlesini hesaplamak için, şişelerin ortalama kütlesini (Mile mukus ile ) ölçün; mg) ve mukusssuz (Mşişeleri ; mg). Daha sonra mukus olmadan mukuslu şişelerin kütlesini çıkarın (Mmukus = Mwith-mucus - Mşişeleri ; mg).
  2. Mukusu deiyonize (DI) su ile üç konsantrasyonda (400, 200, 100, mg/mL) seyreltin.
    1. Bir mikropipette kullanarak mukusa 0,6 mL DI su ekleyerek mukus çözeltisinin ilk konsantrasyonu olan 400 mg/mL'yi hazırlayın.
      NOT: Çıkarılan mukusun yaklaşık hacmi 1,4 mL olduğundan, 400 mg/mL çözelti toplam ~ 2 mL hacme sahip olacaktır.
    2. Mukus çözeltisinin yeterince homojenleştirildiğinden ve herhangi bir mukus partikül aglomerasyonunun hafifletildiklerden emin olmak için 400 mg/mL mukus çözeltisi şişesini bir çalkalayıcıya yerleştirin.
    3. İlk konsantrasyon mukus çözeltisinin hacminin yarısını bir mikropipette kullanarak yeni bir şişeye çekerek ve yeni şişeye 1 mL DI su ekleyerek mukus çözeltisinin ikinci konsantrasyonu olan 200 mg/mL'yi hazırlayın.
    4. Mukus çözeltili birinci ve ikinci şişeler için 1.2.2 adımını yineleyin.
    5. 200 mg/mL çözeltisinin hacminin yarısını (1 mL) bir mikropipette kullanarak yeni bir şişeye çekerek mukus çözeltisinin üçüncü konsantrasyonu olan 100 mg/mL'yi hazırlayın ve yeni şişeye DI suyu ekleyin.
    6. Kendi şişelerindeki üç mukus çözeltisi konsantrasyonu için 1.2.2 adımını tekrarlayın (bkz. Ek Şekil 1).
    7. Mukus çözeltisi şişelerini, reometre kalibrasyonu ve testi yapılana kadar buzdolabında saklayın.

2. Bir reometre kullanarak ölçümler ve veri toplama

NOT: Bu protokolde enstrüman kontrolü ve reometre ile veri toplama için kullanılan yazılımlar Malzeme Tablosunda yer almaktadır. Bu yazılım 'reometre enstrüman kontrol yazılımı' olarak adlandırılacaktır.

  1. Reometre aletini ayarlayın ve kalibre edin.
    1. Basınçlı hava beslemesini reometreye açın ve pnömatik tablanın ve reometrenin bir kabarcık göstergesi kullanılarak seviyelendirildiklerine emin olun. Reometre şaftındaki koruyucu kapağı bükün ve sökme yaparken şaftı hareketsiz tutun.
    2. Reometredeki manyetik rulmanları etkinleştirmek için reometre ana anahtarlarını açın.
    3. Reometre kontrol bilgisayarını, içinde bulunan reometre cihazı kontrol yazılımı ile açın ve reometre cihazı kontrol yazılımını başlatın (bkz. Ek Şekil 2).
    4. Sekmeleri seçerek cihaz kalibrasyonu gerçekleştirin, 'Kalibrasyon | Yazılımpenceresinden Enstrüman ' 'Enstrüman' seçeneğini belirleyin. 'Atalet' altında 'Kalibre 'ye tıklayın. Cihaz atalet kalibrasyon değerini μN.m.s2'ye kaydedin ve kalibrasyon değerlerinin birbirinin% 10'unda olduğundan emin olmak için kalibrasyonu en az 3x tekrarlayın (bkz. Tamamlayıcı Şekil 3).
  2. Reometre geometrisini reometrenin şaftına takın.
    1. Reometre cihazı kontrol yazılımındaki 'Geometriler' sekmesini tıklatın.
    2. Koniyi istediğiniz geometriyle (40 mm çapında, 1⭐ 0' 11'' koni) ve Peltier plakasını izopropanol ile temizleyin (bkz. Tablo 1, Malzeme Tablosu, Şekil 1ve Şekil 2).
      NOT: Peltier Plakası reometreye monte edilir; doğrudan reometreye sabitlenirken izopropanol ile temizlenebilir.
    3. Peltier plaka fikstürünün görünür toz içermemesini ve gerekirse izopropanol ile temiz olmasını sağlayın. Peltier plakasını reometreye önceden takılmamışsa takın ve ısı emici bağlantılarını bağlayın.
    4. Koni geometrisine bağlı kilit şaftına reometredeki'Kilit düğmesine'basın. Bu, şaftın konumunu tutuklar, ancak pozisyonda serbestçe dönebilir.
    5. 'AkıllıTakas |'ne tıklayın Geometrinin otomatik olarak algılanmasını sağlamak için reometre cihazı kontrol yazılımı sekmesinde etkindir (bkz. Ek Şekil 4).
    6. Geometriyi vidalamak için mili reometrenin üzerine çevirin. Yazılım bu aşamada 40 mm çapında, 1⭐ 0' 11'' koni açısı geometrisini algılayacaktır (bkz. Tablo 1 ve Malzeme Tablosu).
    7. Geometrinin algılanmasını sağlamak için 2.2.5 – 2.2.6 adımlarını yineleyin.
    8. Reometre cihazı kontrol yazılımının 'Kontrol Paneli' nin altında 'Boşluk' u seçin, 'Seçenekler' simgesine tıklayın ve 'Eksenel Kuvvet' seçeneğini seçin. Eksenel kuvveti '1 Newton' olarak ayarlayın; bu, koni geometrisinin sıfır boşluk başlatma için Peltier plakasına dokunduğundan emin olmaktır (bkz. Tamamlayıcı Şekil 5).
  3. Reometre geometri kalibrasyonunu gerçekleştirin.
    1. Yazılım penceresinden 'Geometri' sekmesini seçin. 'Atalet' altında 'Kalibre 'ye tıklayın. Geometri atalet kalibrasyon değerini μN.m.s2 olarak kaydedin ve kalibrasyon değerlerinin birbirine oranında olduğundan emin olmak için bunu 2-3 kez tekrarlayın.
    2. Yazılım penceresinde 'Sürtünme' altında 'Kalibre 'ye tıklayın. Geometri sürtünme kalibrasyon değerini μN.m/(rad/s) olarak kaydedin ve kalibrasyon değerlerinin birbirinin 'u içinde olduğundan emin olmak için bunu 2-3 kez tekrarlayın (bkz. Ek Şekil 6).
  4. Sıfır boşluk başlatmayı gerçekleştirme
    NOT: Geometri, referans "sıfır" konumu olmadan ölçüm yapmak için Peltier Plakasının üzerine doğru bir şekilde yükseltilemediğinden, sıfır boşluk başlatma gerçekleştirilir. Ölçüm amacıyla, geometri 24 μm'lik yerleşik geometri boşluğuna ve 28 μm trim boşluğuna sahiptir. Trim boşluğu, geometrinin yüzey alanının dışına dökülebilecek fazla sıvıyı etkili bir şekilde temizlemek için ayarlanır. Bu boşluklar, numune ve reometre kullanılarak verilerin doğru bir şekilde ölçülmesi için zorunludur. 2.4.1 adımı, geometrinin sırasıyla 24 μm ve 28 μm geometri ve trim boşluklarına ulaşmak için sıfır boşluğa ayarlı olduğundan emin olmak için kesinlikle gereklidir.
    1. Yazılım penceresindeki 'Denetim Masası'ndaki ' Boşluk ' sekmesinin altındaki 'Sıfırboşluk' simgesine tıklayın. Geometrinin yaşadığı eksenel kuvvet, Peltier plakasına dokunduğu için 1 N'den büyük veya buna eşit olduğunda başlatma tamamlanır. Referans konumunun doğru olması için reometre boşluğunun sıfırlanıp sıfırlanıp sıfırlandırılmasından emin olun (bkz. Tamamlayıcı Şekil 7 ve Tamamlayıcı Şekil 8).
    2. Reometreyi herhangi bir rasgele yüksekliğe yükseltmek için reometre cihazındaki 'Boşluk' sekmesinin altındaki reometre aletindeki ' geometriyükseltme ve al' simgelerindeki ' yukarıve aşağı ok' kontrollerine basın. Reometre cihazındaki kontrol ekranı ve reometre cihazı kontrol yazılımının kontrol paneli (aynı) boşluk yüksekliğini gösterecektir.
  5. Deneysel prosedürü reometre cihazı kontrol yazılımında ayarlayın. 22 °C'de koni-on-Peltier plaka geometrisi kullanarak reolojik özelliklerin karakterizasyonunu gerçekleştirin.
    NOT: ABD Jeolojik Araştırma web sitesi, 20 Eylül 2018'de, GR mukus deneyleri için kullanılan gümüş sazanın Hart Creek mevkiinde36. Mukus sıcaklığı reolojik özellikleri etkileyebilir. Değerleri nehir sıcaklığına ayarlamanın önemi, mukus özelliklerinin gerçekçi bir şekilde tahmin edilebileceği sıcaklıkla yaklaşık olarak eşleşmektir.
    1. Reometre cihazı kontrol yazılımında 'Deneyler' sekmesini seçin ve 'Ad', 'Operatör', 'Proje' vb.  (bkz. Ek Şekil 9)
    2. 'Geometri' sekmesini seçin ve bilgilerin 2.2.5 adımlarına uygun olduğundan emin olun. - 2.2.7. (bkz. Ek Şekil 10).
    3. 'Yordam' sekmesini seçin ve '1: Salınım Genliği' yordamını ayarlamış ok tuşlarını kullanın. (bkz. Ek Şekil 11).
    4. 'Çevre Kontrolü' ayarlarını aşağıdaki gibi başlatın: 'Sıcaklık = 22 °C'; 'Soak Time = 120 s' ve 'Wait for Temperature' (bkz. Ek Şekil 11)kutusunu işaretleyin.
    5. 'Test Parametreleri' ayarlarını aşağıdaki gibi başlatın: 'Frekans = 1 Hz'; 'Logaritmik süpürme' ayarlayın; 'Tork = 10 ila 10000 μN.m'; 'On yılda puan = 5' (bkz. Ek Şekil 11).
  6. Bilinen konsantrasyonun mukusunun Doğrusal Viskoelastik Aralığını (LVR) belirlemek için deneyi ayarlayın (100 mg/mL)
    1. Uygun bir mikropipette ve pipet ucu kullanarak yaklaşık 0,3 mL konsantrasyon mukus çözeltisi 100 mg/mL çekin (bkz. Adım 1.2, Malzeme Tablosu).
    2. Mukus çözeltisini mikropipette kullanarak Peltier plakasına tanıtın (bkz. Şekil 2).
    3. Geometriyi Peltier plakasına indirmek için reometredeki'Trim Gap'düğmesine basın. Alternatif olarak, reometre cihazı kontrol yazılımındaki 'Kontrol Paneli' seçeneğindeki ' Boşluk ' sekmesinin altındaki 'BoşluğuKırp' simgesine tıklayın (bkz. Ek Şekil 12).
    4. Fazla mukus çözeltisini çıkarmak ve geometrinin çevresine herhangi bir dökülmeden sıvının geometrinin altında olduğundan emin olmak için pipet ucu ile mikropipette kullanın.
      NOT: Sıvının yanlış yüklenmesi ölçümlerde hatalara yol açacaktır. Dolgulu numune altında tork dağılımını düşürür ve aşırı dolu numune kenarlar boyunca dökülmesi nedeniyle hatalı stres dağılımlarına yol açacaktır.
    5. Geometrinin altındaki numunede minimumataletve hız olana kadar 'Motor' ve ' Hız ' sekmelerini dönüşümlü olarak 5 rad/s ve 0 rad/s'ye seçin. Reometre cihazındaki kontrol ekranı ve reometre cihazı kontrol yazılımının kontrol paneli hızı gösterecektir (bkz. Ek Şekil 13).
    6. Geometriyi belirli geometri başına önceden ayarlanmış uygunboşluğadüşürmek için reometredeki 'Geometri Boşluğu ' düğmesine basın. Alternatif olarak, reometre cihazı kontrol yazılımındaki 'Kontrol Paneli' seçeneğindeki ' Boşluk ' sekmesinin altındaki 'GeometriBoşluğu' simgesine tıklayın (bkz. Ek Şekil 14).
  7. Bilinen konsantrasyonun mukusunun Doğrusal Viskoelastik Aralığını (LVR) belirlemek için deneyi çalıştırın (100 mg/mL).
    1. Reometre cihazı kontrol yazılımındaki 'Başlat' simgesini tıklatın (bkz. Ek Şekil 15).
      NOT: Reometre otomatik ölçümler gerçekleştirir; 'Başlat' düğmesine basıldığında, reometrenin testi tamamlaması yaklaşık 20 dakika sürer. Adım 2.5.5'teki 'On yılda bir puan' ayarı, reometrenin ölçümleri tamamlamak için ne kadar zamana ihtiyaç duyacağını belirler.
    2. Görünen açılır kutuda 'Evet' i tıklatarak denemeyi çalıştırın ve geometri boşluğunun denemeyi başlatmak için doğru mesafeye indirilmesini önerir, zaten indirilmemişse.
    3. Depolama (G') ve kayıp (G'') modülünü bildiren reometre tarafından oluşturulan gerçek zamanlı çizimi gözlemleyin.
      NOT: G' ve G" sırasıyla depolama ve kayıp modülüne göredir. Depolama modülü, malzemenin stres kaynaklı deformasyondan sonra orijinal şeklini geri kazanma eğilimini temsil eder ve elastikiyete eşdeğerdir. Kayıp modülü, malzemenin akış eğilimine ne ölçüde direndiğini ve akışkan viskozitesini temsil eder (bkz. Şekil 4).
    4. Çizimin X eksenini 'Salınım gerinim yüzdesi' olarakayarlayın. Bunu yapmak için, sunulan grafiğe sağ tıklayın ve 'Grafik Değişkenleri' sekmesini seçin (bkz. Ek Şekil 16).
    5. Test tamamlandıktan sonra, malzeme Doğrusal Olmayan Viskoelastik aralığa girmeden önce, salınım gerinim yüzde aralığını çizimden kaydedin.
    6. Peltier plakasının üzerindeki herhangi bir rasgele yüksekliğe yükseltmek için reometre cihazındaki 'Boşluk' sekmesinin altındaki reometre aletindeki ' yukarıve aşağı ok' kontrollerine veya ' geometri yükseltme veal' simgelerine basın.
    7. Mukus örneğinin doğrusal viskoelastik bölgesini (LVR) belirlemek için hem deneysel prosedürü hem de rheometre cihazı kontrol yazılımının yerel dosya biçimini içeren dosyayı kaydedin.
      NOT: Bu, Statik denge denklemi, gerilme sembolü (σ̄), diyagram; mekanikte anahtar. veri doğrusal olmayan viskoelastik bölgeye (NLVR) girmeden önce çizimin X eksenini genlik (%) ve/veya salınım gerilimini zorlamak için ayarlayarak yapılabilir (bkz. Ek Şekil 16).
  8. Bilinen konsantrasyon 100, mg/mL'nin mukusu için Lineer Viskoelastik Aralık'ta (LVR) dinamik süpürme ve sabit durum kesme hızı akış testi deneylerini çalıştırın ve 100 mg/mL'lik üç bağımsız mukus örneğinden sonuç elde edin. Mevcut mukus konsantrasyon örneklerinde bu adımları ayrı ayrı gerçekleştirin.
    1. 2.5.1 – 2.5.4 adımlarını yineleyin.
    2. 'Test Parametreleri' ayarlarını aşağıdaki gibi başlatın: 'Frekans = 1 Hz'; 'Logaritmik süpürme' ayarlayın; 'Suş % = 100 ila 10000 % ; 'On yılda puan = 10'.
    3. 'Yordam' sekmesini seçin ve '2: Salınım Sıklığı' yordamını ayarlamış ok tuşlarını kullanın.
    4. 'Çevre Kontrolü' ayarlarını aşağıdaki gibi başlatın: 'Sıcaklık = 22 °C'; 'Soak Time = 0.0 s'.
    5. 'Test Parametreleri' ayarlarını aşağıdaki gibi başlatın: 'Gerinim % = 1 %'; 'Logaritmik süpürme' ayarlayın; 'Frekans = 20 ila 1 Hz'; 'On yılda puan = 10'.
    6. 'Yordam' sekmesini seçin ve '3: Akış Süpürme' yordamını ayarlayın ok tuşlarını kullanın.
    7. 'Çevre Kontrolü' ayarlarını aşağıdaki gibi başlatın: 'Sıcaklık = 22 °C'; 'Soak Time = 0.0 s'.
    8. 'Test Parametreleri' ayarlarını aşağıdaki gibi başlatın: 'Kesme hızı = 1 ila 10000 1/s'; 'On yılda puan = 10'; onay kutusunu işaretleyin.
    9. 2.7.1 – 2.7.2 adımlarını yineleyin ve deneme tamamlanana kadar yaklaşık 45 dakika bekleyin.
    10. Geometriyi herhangi bir rasgele yüksekliğe yükseltmek için reometre cihazındaki 'Boşluk' sekmesinin altındaki reometre aletindeki'yukarı ve aşağı ok' kontrollerine veya 'geometri yükseltme ve alçaltma' simgelerine basın.
    11. Peltier plakasındaki mukusu izopropanol çözeltisi ile çıkarmak ve temizlemek için tek kullanımlık mendil ve eldiven kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
    12. Hem deneysel prosedürü hem de rheometre enstrüman kontrol yazılımının yerel dosya formatını içeren dosyayı kaydedin.

3. 200 mg/mL ve 400 mg/mL'lik diğer mukus çözelti konsantrasyonları için protokolü tekrarlayın.

  1. Kalan iki mukus çözeltisi konsantrasyonu, 200 mg/mL ve 400 mg/mL için listelenen tüm alt adımlar dahil olmak üzere 2,5 – 2,8 adımlarını gerçekleştirin.

4. Grafiksel gösterim ve veri analizi

NOT: Ek kod dosyasında sağlanan kod, veri ortalaması gerçekleştirir ve tekrarlanabilirlik hataları oluşturur, tüm denemelerdeki verileri kaplar. Standart sapma hesaplama özellikleri reometre cihazı kontrol yazılımında mevcut değildir. Kod, veri analizi, işlem sonrası ve grafiksel gösterim için bir programlama dilinde yazılmıştır (ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın).

  1. 100 mg/mL GR mukus konsantrasyonu ile ilgili 2.8 ve 200mg/mL ve 400 mg/mL GR muku |s konsantrasyonlarıyla ilgili 3.1. | Dışa Aktar Reometreenstrüman kontrol yazılımında Excel ' (bkz. Ek Şekil 17).
  2. Değişen kesme gerinim hızları ( ## ρ̇ Dinamik Analizinde Denklem Sembolü ) ve kayıp modülleri (G"), depolama modülü (G') ve farklı salınım stresi ( ) için faz açısı (δ) için görünür viskozite (η) çizimleri oluşturmak ve temsili sonuçlar oluşturmak için ek kodlar çalıştırın. Statik denge denklemi, gerilme sembolü (σ̄), diyagram; mekanikte anahtar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu bölümde, koni geometrisi (40 mm çapında, 1° 0' 11'' ) ve Peltier plakası ile rotasyonel bir reometre kullanarak GR mukus üzerinde yapılan deneylerin sonuçlarını sunuyoruz. Deneyler, GR mukusunun Newton olmayan, kesme inceltici davranışını ve mukusun jel benzeri bir malzemeden sıvı benzeri bir malzemeye geçişini gösteren belirgin verim stresini karakterize etmeye yardımcı oldu. Temsili sonuçlar, düşük tork sınırlarının nicel açıklamalarını ve rotasyonel reometre enstrümantasyonunun ikincil akış etkilerini gerektirir. E...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolü geliştirmenin temel amaçlarından biri, çok küçük örnek hacimler mevcut olduğunda GR mukusun reolojik karakterizasyonu için uygun olduğunu belirlemektir. GR mukusun reolojik özelliklerini tam olarak karakterize etmek için gümüş sazan okulundan daha fazla örneğe ihtiyaç duyulduğunu ve burada sunulan verilerin tüm gümüş sazan popülasyonu genelinde bir genelleme olmadığını kabul ediyoruz. Tekniğimiz, küçük numune hacimlerinin reolojik karakterizasyonu ve daha büyük mukus örnekleri topluluklarını içeren genişleti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması bildirilmedi.

Teşekkürler

Yazarlar GW Biyomimetik ve Biyoinspired Mühendislik Merkezi'nden destek ve finansman kabul ediyorlar. George Washington Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden Profesör L. Patricia Hernandez'e soruşturmaya ve devam eden işbirliğine ilham verdiği, gümüş sazanın fizyolojisi konusunda biyolojik uzmanlık sağladığı ve mukus örneklerini sağladığı için teşekkür ediyoruz. Öğrencilere, Bay David Palumbo, Bayan Carly Cohen, Bay Isaac Finberg, Bay Dominick Petrosino, Bay Alexis Renderos, Bayan Priscilla Varghese, Bay Carter Tegen ve Bay Raghav Pajjur'a laboratuvardaki yardımları için ve Ta Instruments, New Castle, DE'den Bay Thomas Thomas'a reometrenin eğitimi ve bakımı konusunda destek için teşekkür ederiz. Şekil 5A,C için görüntüler, George Washington Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden Profesör L. Patricia Hernandez tarafından gerçekleştirilen bir diseksiyon sırasında çekildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Materials
Kim MendilVWR470224-038Plakadan Numuneyi temizlemek için
EldivenlerVWR89428-750Numunenin kontaminasyonunu önlemek için
PipetVWR89079-974Numuneyi flakondan reometreye taşımak için
PipetUçları Thermo Scientific72830-042Numuneyi flakondan reometreye taşımak için
ÇalkalayıcıVWR89032-094Mukus numunesini homojen bir şekilde karıştırmak için
Şişeleri VWR66008-710Ölçülen numune hacimlerini içerir
Tartı KantarıOhausScout – SPX TerazileriMukus numunelerinin kütlesini tartmak için
Kimyasal Reaktifler
Deiyonize Su (H20)-Sıvı
Steril %70 İzopropanol (C3H8O)VWR89108-162Sıvı
GR Mukus
100 mg/mL konsantrasyon, 2mL--Viskoelastik Malzeme
400 mg / mL konsantrasyon, 1 mL-Viskoelastik Malzeme
200 mg / mL konsantrasyon, 1 mL-Viskoelastik Malzeme
< güçlü > Yazılım < / güçlü >
MATLABMathworksR2017aVeri analizi, işlem sonrası ve grafiksel gösterim
TriosTA Instrumentsv4.5.042498Reometre cihazı kontrol ve analiz yazılımı

Kaynaklar

  1. Cohen, K. E., Hernandez, L. P. The complex trophic anatomy of silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, highlighting a novel type of epibranchial organ. Journal of Morphology. 279, 1615-1628 (2018).
  2. Cohen, K. E., Hernandez, L. P. Making a master filterer: Ontogeny of specialized filtering plates in silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). Journal of Morphology. 279, 925-935 (2018).
  3. Cremer, M., Smitherman, R. Food habits and growth of silver and bighead carp in cages and ponds. Aquaculture. 20 (1), 57-64 (1980).
  4. Battonyai, I., et al. Relationship between gill raker morphology and feeding habits of hybrid bigheaded carps (Hypophthalmichthys spp.). Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 416, 36(2015).
  5. Zhou, Q., Xie, P., Xu, J., Ke, Z., Guo, L. Growth and food availability of silver and bighead carps: Evidence from stable isotope and gut content analysis. Aquaculture Research. 40 (14), 1616-1625 (2009).
  6. Freedman, J. A., Butler, S. E., Wahl, D. H. Impacts of invasive Asian carps on native food webs (Final Report). , University of Illinois, Kaskaskia Biological Station. Urbana-Champaign, IL. (2012).
  7. Nico, L., Fuller, P., Li, J. Silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)-FactSheet. , (2017).
  8. Walleser, L., Howard, D., Sandheinrich, M., Gaikowski, M., Amberg, J. Confocal microscopy as a useful approach to describe gill rakers of Asian species of carp and native filter-feeding fishes of the upper Mississippi River system. Journal of Fish Biology. 85 (5), 1777-1784 (2014).
  9. Nelson, A. Z., Ewoldt, R. H. Design of yield-stress fluids: a rheology-to-structure inverse problem. Soft Matter. 13, 7578-7594 (2017).
  10. Chen, T. Rheological Techniques for Yield Stress Analysis. TA Instruments Applications Note, RH025. , (2020).
  11. Ewoldt, R. H., Johnston, M. T., Caretta, L. M. Experimental challenges of shear rheology: how to avoid bad data. Complex Fluids in Biological Systems. Spagnolie, S. , Springer. (2015).
  12. Thornton, D. J., Sheehan, J. K. From Mucins to Mucus: Toward a more coherent understanding of this essential barrier. Proceedings of the American Thoracic Society. 1, 54-61 (2004).
  13. Shepard, K. L. Functions for fish mucus. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 4, 401-429 (1994).
  14. Fernández-Alacid, L., et al. Skin mucus metabolites in response to physiological challenges: A valuable non-invasive method to study teleost marine species. Science of the Total Environment. 644, 1323-1335 (2018).
  15. Wagner, C. E., Wheeler, K. M., Ribbeck, K. Mucins and Their Role in Shaping the Functions of Mucus Barriers. Annual Reviews in Cell and Developmental Biology. 34, 189-215 (2018).
  16. Bird, R. B., Armstrong, R. C., Hassager, O. Dynamics of Polymeric Liquids, Volume 1: Fluid Mechanics. , Wiley. New York. 1255-1284 (1987).
  17. Mantle, M., Allen, A. Isolation and characterisation of the native glycoprotein from pig small intestinal mucus. Biochemical Journal. 195, 267-275 (1981).
  18. Allen, A., Hutton, D. A., Pearson, J. P., Sellers, L. A. Mucus glycoprotein structure, gel formation and gastrointestinal mucus function. Mucus and Mucosa (Ciba Foundation Symposium). Nugent, J., O'Conner, M. , Pitman. London. 137-156 (1984).
  19. Asakawa, M. Histochemical studies of the mucus on the epidermis of eel, Anguillajaponica. Bulletin of Japanese Society of Scientific Fisheries. 36, 83-87 (1970).
  20. Fletcher, T. C., Jones, R., Reid, L. Identification of glycoproteins in goblet cells of epidermis and gill of plaice (Pleuroneces platessa L.), flounder (Platichthys flesus (L.)) and rainbow trout (Salmo gairdneri Richardson). Histochemical Journal. 8, 597-608 (1976).
  21. Silberberg, A. Mucus glycoprotein, its biophysical and gel forming properties. Symposia of the Society for Experimental Biology. 43, 43-64 (1989).
  22. Hills, B. The Biology of Surfactants. , Cambridge Univ. Press. Cambridge. 408(1988).
  23. Aubert, H., Brook, A. J., Shephard, K. L. Measurement of the adhesion of a desmid to a substrate. British Phycology Journal. 24, 293-295 (1989).
  24. Sanderson, S. L., Cech, J. J., Patterson, M. R. Fluid dynamics in suspension feeding black fish. Science. 251, 1346-1348 (1991).
  25. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (2), 86-100 (2009).
  26. Chaudhary, G., Ewoldt, R. H., Thiffeault, J. L. Unravelling hagfish slime. Journal of Royal Society Interface. 16 (150), 20180710(2019).
  27. Downing, S., Salo, W., Spitzer, R., Koch, E. The hagfish slime gland: a model system for studying the biology of mucus. Science. 214, 1143-1145 (1981).
  28. Hwang, S. H., Litt, M., Forsman, W. C. Rheological properties of mucus. Rheologica Acta. 8, 438-448 (1969).
  29. Litt, M. Mucus rheology. Archives of Internal Medicine. 126, 417-423 (1970).
  30. Quarishi, M. S., Jones, N. S., Mason, J. The rheology of nasal mucus: a review. Clinical Otolaryngology. 23, 403-413 (1998).
  31. Nordgård, C. T., Draget, K. I., Seternes, T. Rheology of salmon skin mucus. Annual Transactions - The Nordic Rheology Society. 23, 175-179 (2015).
  32. Fernández-Alacid, L., et al. Comparison between properties of dorsal and ventral skin mucus in Senegalese sole: Response to an acute stress. Aquaculture. 513, 734410(2019).
  33. Yüce, C., Willenbacher, N. Challenges in Rheological Characterization of Highly Concentrated Suspensions - Case Study for Screen-printing Silver Pastes. Journal of Visualized Experiments. (122), e55377(2017).
  34. Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds. J. Vis. Exp. (146), (2019).
  35. Barnes, H. A., Hutton, J. F., Walters, K. An Introduction to Rheology. , Elsevier. Amsterdam. (1989).
  36. National Water Information System. USGS Current Conditions for USGS 06910450 Missouri River at Jefferson City, MO. U.S. Geological Survey. , Available from: https://nwis.waterdata.usgs.gov/usa/nwis/uv/?cb_00010=on&cb_00060=on&cb_00065=on&format=gif_default&site_no=0691045&p09-19&end_date=2018-09-21 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Reolojik KarakterizasyonNewtonyen Olmayan Ak kanlarAkma Gerilmesi TahminiRotasyonel ReometreViskoelastik zelliklerKayma nceltme DavranOsilasyon Genli iAk Tarama Prosed rG r n r Vizkozite
Gümüş Sazan, Hipoftalmichthys molitrix Gill Raker Mucus Makro-Reoloji Karakterizasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.