Yöntem makalesi

L-form Bakterilerin İdrardan Filtrasyon Yöntemi ile İzole Edilmesi

3.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61380

⸱

13 Haziran 2020

 ,  , 
1Centre for Bacterial Cell Biology, Biosciences Institute, Medical School, Newcastle University

Bu makalede

Özet

Burada, bir filtrasyon yöntemi kullanarak L-form bakterilerin idrardan izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. L-form ortamının hazırlanması, L-formlarının faz kontrast mikroskobu ile gözlemlenmesi ve laboratuvar koşullarında L-formlarının indüksiyonu için tamamlayıcı yöntemler de açıklanmaktadır.

Özet

Bakterilerin L-form durumuna geçişinin, hücre duvarını hedefleyen antibiyotiklerle tedavi sırasında bağışıklık kaçışında ve bakteri kalıcılığında olası bir rol oynadığı düşünülmektedir. Bununla birlikte, L-form bakterilerin izolasyonu ve işlenmesi, esas olarak ozmolaritedeki değişikliklere karşı yüksek hassasiyetleri nedeniyle zordur. Burada, L-form ortamının hazırlanması, L-formlarının bir filtrasyon yöntemi kullanılarak idrardan izolasyonu, idrar örneklerinde L-formlarının faz kontrast mikroskobu ile saptanması ve L-formlarının in vitro indüksiyonu için ayrıntılı protokolleri açıklıyoruz. L-formlarının hayatta kalması ve büyümesi için kesin gereksinimler, suştan suşa değişebilir. Bu nedenle, burada sunulan yöntemlerin, kesin talimatlar olarak değil, bireysel laboratuvarlarda L-form protokolleri oluşturmak için temel yönergeler olarak hareket etmesi amaçlanmıştır. Filtrasyon yöntemi, bir numunedeki L-formlarının sayısında bir azalmaya yol açabilir ve miktar tayini için kullanılmamalıdır. Bununla birlikte, hücre duvarı eksikliği olan varyantların duvarlı muadillerinden etkili bir şekilde ayrılması ve idrar yolu enfeksiyonu olan hastalarda L-form geçişi yapabilen bakteri suşlarının tanımlanması için şimdiye kadar kullanılan tek yöntemdir. Filtrasyon yöntemi, diğer bakteriyel enfeksiyon kategorilerine sahip hastalardan ve çevresel örneklerden L-formlarının izolasyonu için uyarlanma potansiyeline sahiptir.

Giriş

Hemen hemen tüm bakteriler hücre duvarı adı verilen bir yapı ile çevrilidir. Duvar, çevresel streslere karşı koruma için önemlidir, düzenli bölünmeye yardımcı olur ve bakterilere şeklini verir1. Bununla birlikte, duvar aynı zamanda bağışıklık sisteminin bazı kısımları ve penisilin 2,3 dahil olmak üzere en iyi ve en çok kullanılan antibiyotiklerden bazıları için bir hedeftir. Önemine rağmen, hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakteriler bazen duvar olmadan da hayatta kalabilir 4,5,6,7,8. Çevredeki koşullar, patlamalarını önlemek için yeterli ozmoproteksiyon sağlıyorsa ve hücre duvarı hedefleme ajanları da mevcutsa, bakteriler L formu 4,5,6,7,8 olarak adlandırılan duvarsız bir duruma geçebilir.

Çok sayıda rapor, L formlu bir duruma geçmenin ve duvarlı bir duruma geri dönmenin, bakterilerin hem konakçı bağışıklık sisteminden gelen saldırıdan hem de hücre duvarını hedefleyen antibiyotiklerle tedaviden kurtulması için bir mekanizma olarak in vivo önemli olabileceğini göstermektedir 9,10,11,12,13,14,15. Böyle bir geçiş, bakteriyel enfeksiyonun nüksetmesi için potansiyel olarak güçlü bir strateji sağlar 9,10,11,12,13,14,15. L-form bakterilerin temel biyolojisini ve konakçı ile etkileşimlerini anlamak, patogenezdeki rollerini deşifre etmek için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, L formundaki bakterilerin işlenmesi zordur.

İlk olarak, hücre duvarının olmaması nedeniyle, L-form bakteriler ozmolaritedeki değişikliklere tepki olarak patlamaya eğilimlidir. Ek olarak, L-formları oldukça düzensiz bir şekilde bölünür, öngörülemeyen büyüme modellerine sahiptir (genellikle duvarlı muadillerinden çok daha yavaştır) ve suşa bağlı olarak, katı veya sıvı ortamlardan ziyade yarı sıvı üzerinde daha iyi yayılabilir. Yukarıdaki tüm hususlar, büyüme oranlarının ölçülmesini ve karşılaştırılmasını zorlaştırır. Farklı bakteri türleri (hatta suşlar), L-form geçişi ve büyümesi için çeşitli metabolik gereksinimlere sahiptir. Örneğin, aerobik solunuma dayanan bazı Gram-pozitif bakterilerin L-formları, reaktif oksijen türlerine duvarlı muadillerine göre daha hassastır16.

Laboratuvar koşullarında ve konakta L-formlarının indüksiyonu genellikle antibiyotikler ve lizozim9 gibi hücre duvarı hedefleme ajanları tarafından yönlendirilir. Böyle bir tedavi sadece kısmi bir hücre duvarı kaybına neden olabilir ve bu nedenle numunelerde bazı duvarlı (veya kısmen duvarlı) bakteriler bulunabilir, bu da gözlemlenen herhangi bir deneysel sonucun L-formlarının varlığından mı yoksa duvarlı bakteri formlarının varlığından mı kaynaklandığını ayırt etmeyi zorlaştırır. İndüklenen L formlarının sıklığı in vivo düşük olma eğilimindedir, bu da bulunmaları ve izole edilmeleri zor olabileceği anlamına gelir. Son olarak, polimorfik morfolojileri nedeniyle, L-formları, apoptotik cisimler veya çeşitli granüller gibi ökaryotik kökenli yapılarla yerinde kolayca karıştırılabilir.

1935'tekikeşiflerinden bu yana17, laboratuvarda L-formlarını işlemek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bunların çoğu, büyüme ortamına bir ozmoprotektif ajanın eklenmesine dayanır; genellikle bir şeker veya tuz 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Yukarıda bahsedildiği gibi, L-formları genellikle hasta örneklerinde duvarlı bakterilerle yan yana bulunur ve iki popülasyonu ayırmak zor olabilir. Bununla birlikte, duvarlı bakterilerin aksine, L-formlarının esneklikleri ve değişken boyutları nedeniyle 0.45 μm'lik bir filtreden geçebileceği gösterilmiştir. L-formlarını idrardan izole etmek için böyle bir filtre kullanan bir yöntem kullanılmıştır 10,19,20,21.

Burada, L-form bakterilerin idrardan bir filtrasyon yöntemi kullanılarak izolasyonu için bir protokol sunuyoruz (Şekil 1). L-form ortamının hazırlanması, L-formlarının mikroskobik gözlemi ve L-formlarının in vitro indüksiyonu için tamamlayıcı protokoller de açıklanmaktadır.

Protokol

1. L-form ortamının (LM) hazırlanması

  1. Sükrozu (0,58 M'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için ayarlanan miktar), MgS04'ü (nihai konsantrasyon 8 mM) ve Beyin Kalp İnfüzyonunu (BHI) (tedarikçi tarafından önerilen miktar) istenen ortam hacminin iki katı büyüklüğünde bir cam şişede tartın. 0,5 L ortam hazırlamak için 100 g sakaroz, 1 g MgS04 ve 18,5 g BHI'yi tartın ve 1 L'lik bir cam şişeye koyun. Bu, otoklavlamadan önce bileşenlerin daha kolay yeniden süspansiyona dayanmasını sağlayacaktır.
  2. Katı veya yarı katı ortam gerekiyorsa, istediğiniz miktarda agar ekleyin. Katı ortam için, 0,5 L ortamda% 1'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 5 g agar ekleyin. Yarı katı ortamlar için, 0,5 L ortamda %0,2'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1 g agar ekleyin.
  3. İstenilen son hacme kadar deiyonize (DI) su ile doldurun.
  4. Şişeyi kapatın ve çalkalayarak iyice karıştırın. Malzemeleri tamamen yeniden askıya almaya gerek yoktur, sadece şişenin dibinde topaklanmadıklarından emin olun. Kapağı gevşetin ve hassas bir ortam döngüsünde (15 dakika boyunca 115 °C) otoklavlayın. Bileşenlerin topaklanmasını ve sakaroz karamelizasyonunu önlemek için bileşenlerin otoklavlamadan önce karıştırılması ve hassas bir ortam döngüsü kullanılması önerilir.
  5. Otoklavlamayı takiben ortamı görsel olarak inceleyin. Topak olmamalı ve ortam kehribar renginde olmalıdır (Şekil 2A).
  6. Otoklavlamanın ardından, ortamın şişenin elle rahatça tutulmasını sağlayan bir sıcaklığa soğumasını bekleyin.
  7. L-formlarının indüksiyonu için ortam gerekliyse, bu noktada bir antibiyotik ve / veya bir litik ajan ekleyin (örneğin, 400 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda fosfomisin, 200 μg / mL'de penisilin G, 400 μg / mL'de D-sikloserin, 100 μg / mL'de ampisilin, 50 μg / mL'de moenomisin, 100 μg / mL'de lizozim veya 5 μg / mL'de lizosofin). Test edilen bakteri türlerinin her biri için L-form indükleyici ajanın tipini (veya birden fazla gerekiyorsa ajanları) ve konsantrasyonunu ampirik olarak belirleyin.
  8. Bireysel alikotlar hazırlamak için eldiven giyin ve bir mikrobiyolojik güvenlik kabininde çalışın veya bir Bunsen brülörü kullanın. Besiyerinin uzun süre inkübasyon gerektirmesi gerekebilir ve sterilite çok önemlidir.
    1. Katı ortamın alikotlarını hazırlamak için, 25 mL'yi ayrı ayrı 92/16 mm Petri kaplarına aktarın ve sertleşmelerine izin verin. Kontaminasyon riskini azaltmak için plakaları doğrudan dökmek yerine pipetleyici kullanılması önerilir. Plakaları fazla kurutmayın.
    2. Yarı sıvı alikotlar hazırlamak için, 5 mL ortamı bir pipetleyici kullanarak birden fazla 30 mL polistiren üniversal kaba aktarın ve sertleşmelerine izin verin.
  9. Medyayı hemen kullanın veya kullanmadan önce bir haftaya kadar 4 °C'de saklayın. Bileşiğin zamanla bozulması nedeniyle konsantrasyon azalabileceğinden, antibiyotik içeren ortamı saklamadan önce üreticinin tavsiyelerini kontrol edin.

2. L-formlarının idrardan izolasyonu

NOT: Laboratuvar prosedürleri sırasında eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Mikrobiyolojik güvenlik kabininde çalışın veya bir Bunsen brülörü kullanın. Filtreleme sırasında güvenlik çubukları takın.

  1. İdrar örneklerinin tahmini gelmesinden en az 1 saat önce, çalışma alanını% 70 etanol ile silin ve gerekli sayıda yarı sıvı LM ortam alikotunu belirleyin.
    NOT: Protokolü göstermek için insan idrar örnekleri yerine laboratuvarda sıvı LM ortamında indüklenen E. coli ST144 10 L-formlarının bir süspansiyonu kullanılacaktır.
  2. Numuneleri işlemeden önce çalışma alanını tekrar %70 etanol ile silin. Tezgahın bir tarafına, istenen sayıda 0,45 μL'lik kesilmiş filtre, 20 mL'lik şırınga ve numune sayısına eşit birkaç boş steril 30 mL polistiren üniversal kap yerleştirin. Bazı numuneleri işlemek için birden fazla filtreye ihtiyaç duyulması durumunda, beklenen idrar numunelerinin sayısına ek olarak birkaç yedek filtre ekleyin. LM orta alikotlarını ve boş steril 30 mL polistiren üniversal kapları tezgahın ortasındaki sabit bir rafa yerleştirin. Mikroskobik inceleme paralel olarak yapılacaksa, ayrıca cam mikroskop lamları, 22 x 22 mm lameller, 2 μL ve 1 mL pipetler, steril 10 μL ve 1 mL uçlar, steril 1,5 mL tüpler hazırlayın ve bir tezgah mikrosantrifüjünün mevcut olduğundan emin olun.
  3. Numunedeki L-form bakterilerin olası bozulmasını önlemek için, bağışı takiben mümkün olan en kısa sürede idrar örneklerini donörden laboratuvara taşıyın.
  4. Eldiven ve gözlük takın, idrar örneklerini güvenlik çantasından çıkarın, üzerlerine etanol püskürtün, silin ve LM ortam alikotlarının ve steril yedek 30 mL polistiren kapların yanındaki rafa yerleştirin. Bu noktadan sonra, her seferinde bir numuneyi işleyin.
  5. LM ortamı içeren bir tüp, yedek polistiren üniversal kap ve idrar içeren tüp üzerindeki kapakları gevşetin.
  6. Şırıngayı paketinden çıkarın, pistonu çıkarın ve sağınıza yerleştirin.
  7. Güvenlik kağıdını filtre paketinin arkasından çekin ve şırıngayı filtreye sıkıca takın (steril kaldığından emin olmak için filtreyi yüzü aşağı bakacak şekilde üreticinin plastik tutucusunda tutun).
  8. Hızlı ama dikkatli bir şekilde çalışarak, kapağı LM ortamının tüpünden çıkarın ve atın ve filtreyi şırınga ile tüpün üzerine yerleştirin.
  9. Kapağı idrar örneğinden çıkarın ve şırıngaya yavaşça ~ 10 mL dökün (sadece 2 mL filtrelenir, ancak fazla hacim sıçramayı önler), mikroskobik inceleme için 1 mL'den fazla kaldığından emin olun. Sadece 0,5 mL kullanılacaktır, ancak filtrasyonu önceden oluştururken böyle bir hacmi hassas bir şekilde ölçmek pratik değildir, bu nedenle yaklaşık bir fazla hacim korunur.
  10. Pistonu çok dikkatli bir şekilde şırınganın arkasına yerleştirin. Piston tam olarak çalışır duruma getirilmeden önce küçük bir miktar direnç hissedilebilir ve numunenin bu noktadan sonra dökülmesi kolaydır. İdrar örneklerini işlemeden önce su kullanarak birkaç kez pratik yapın.
  11. Pistona hafifçe bastırın ve artan bir direnç hissedilene kadar 2 mL idrarı filtreden geçirin. Numunenin dökülmesini ve filtrenin kırılmasını önlemek için çok fazla basınç uygulamamaya dikkat edin. Numune özellikle yoğunsa ve çok fazla direnç oluşturuyorsa, numuneyi bir filtreden geçirmek yerine birden fazla filtreden geçirin.
  12. Kalan filtrelenmiş numuneyi çıkarmak için filtreyi LM ortamı içeren tüpe hafifçe vurun, filtreyi ve şırıngayı kaldırın ve kapağı yedek 30 mL polistiren üniversal kaptan LM ortamı ve filtrelenmiş idrar içeren tüpün üzerine hızlı bir şekilde yerleştirin, tüpün iç kısmına kapağın kenarı ile temas etmemeye dikkat edin. Filtreyi, şırıngayı ve yedek polistiren kabını güvenli bir şekilde atın.
  13. Numuneleri 30 °C'de sabit bir konumda 1 aya kadar inkübe edin. Bu, filtreden geçen L formlarının duvarlarını yenilemesine ve duvarlı bakteriler olarak büyümeye başlamasına izin verecektir.
  14. Filtrelenmiş numuneler içeren tüpleri bir ışık kaynağına karşı tutarak büyüme kanıtı için numuneleri her gün gözlemleyin. Pozitif numuneler için, büyüme genellikle 3 ila 7 gün içinde ortaya çıkar.
  15. Büyüme tespit edildikten sonra, numuneyi bir mikrobiyolojik güvenlik kabinine veya bir Bunsen brülörünün yakınına aktarın. Numuneyi açın ve büyüme alanını hedefleyerek 5 μL'lik bir plastik halkaya dikkatlice daldırın ve ardından numuneleri tek koloniler22 elde etmeyi hedefleyerek ozmoproteksiyon olmadan standart katı BHI ortamı üzerinde çizgileyin.
  16. Aynı zamanda, numunenin küçük bir miktarını, yarı sıvı ortamın bir kısmı (~ 5 μL) ile birlikte, adım 3'te açıklandığı gibi mikroskobik olarak inceleyin. Numunenin ortamla birlikte mikroskobik bir slayt üzerine aktarılması, numunede hala mevcut olabilecek herhangi bir L-formunun patlamamasını ve tespit edilebilmesini sağlayacaktır. Bununla birlikte, bu noktadaki bakterilerin çoğunluğunun duvarlı formlara geri dönmesi ve normal çubuklar veya koklar olarak görünmesi beklenmektedir.
  17. BHI plakaları üzerine çizilen numuneleri gece boyunca 37 °C'de sabit bir konumda inkübe edin.
  18. Büyüme kanıtlarını inceleyin, 5 μL'lik bir halka kullanarak her plakadan tek bir koloni seçin ve 5 mL sıvı BHI'ye aşılayın. Gece boyunca 37 °C'de çalkalanarak inkübe edin.
  19. Gliserol stoklarını hazırlamak veya tercih edilen bir yöntem (örneğin, Qiagen DNeasy Kan ve Doku Kiti) kullanarak tür tanımlaması için DNA'yı izole etmek için gece boyunca kültürleri kullanın.

3. İdrar örneklerinin faz kontrast mikroskobu ile L-formlarının varlığı açısından incelenmesi

  1. Kalan 0.5 mL idrar örneğini bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve bir tezgah mikrosantrifüjünde 1 dakika boyunca 8.000 x g'da döndürün.
  2. Süpernatanı yaklaşık 20 μL'yi geride bırakarak nazikçe çıkarın ve peleti 3 kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek yeniden süspanse edin.
  3. 1 μL'yi bir cam mikroskop lamına yerleştirin ve 22 x 22 mm'lik bir lamel ile örtün (5 μL'lik bir numuneyi incelemek için (bkz. adım 2.16), lamellerin lamla iyi yapışacağından emin olmak için 22 x 50 mm'lik bir lamel kullanın). Bir sızdırmazlık oluşturmak ve lamellerin hareket edemediğini kontrol etmek için steril bir pamuklu yün ped kullanarak lamel üzerine hafifçe bastırın. Pamuk yünü pedi atın.
  4. L formu benzeri yapıların varlığı için 100x faz kontrast objektifi ile donatılmış bir mikroskop kullanarak slaydı inceleyin (Şekil 3).
    NOT: Hasta numunelerindeki L formu benzeri yapıların bakteriyel kökenini doğrulamak için, numunelerin bakteri dizilerine özgü oligonükleotid probları kullanılarak floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile incelenmesi önerilir10,23.

4. L-formlarının in vitro indüksiyonu

  1. Osprotektif olmayan ortam (örneğin BHI) içeren bir plaka üzerinde tek kolonilere22 tercih edilen duvarlı bakterileri çizgi haline getirin ve gece boyunca 37 ° C'de sabit olarak inkübe edin.
  2. Ertesi gün, adım 1'de açıklandığı gibi tercih edilen L-form indükleyici ajan/ajanları içeren ozmoprotektif LM ortamını hazırlayın. İstenilen sayıda plakayı katı ortamla hazırlayın.
  3. Steril 5 μL'lik bir plastik halka veya bir kürdan kullanarak, bir gece önce inkübe edilen ozmoprotektif olmayan BHI plakasından cömert bir miktar (~ 4-5 koloni değerinde) seçin.
  4. İlmeğin düz yüzeyini (kenar yerine) kullanarak LM plakası üzerinde bakteri çizgisi. Bakterileri plakanın kenarında sürekli bir hareketle çizin, ardından plakayı 90° çevirin. İlmeği ilk çizginin kenarına dokundurun ve sürekli bir hareketle, çizgiyi plakanın bir çeyreğine yayın, bakterileri birden fazla örtüşen çizgiyle kademeli olarak seyreltin (istenirse tüm plaka kullanılabilir. Plakanın sadece bir çeyreği kullanılıyorsa, diğer kadranlar çoklu indüksiyonlar için kullanılabilir).
    NOT: Şekil 4A , çizginin yönünü şematik olarak göstermektedir. Buradaki amaç, tek koloniler yerine mümkün olduğunca çok sayıda saf L-formu içeren bir büyüme alanı elde etmektir. Bu nedenle, çizgiler arasındaki döngüleri değiştirmeye gerek yoktur. Tek L-form kolonilerinin elde edilmesi çok zor olabilir ve çok az sayıda bakteri kullanmak hiç L-form büyümesine neden olmayabilir. Öte yandan, indüksiyon için çok fazla duvarlı bakteri kullanılmışsa, tüm bakteriler anahtardan geçmez ve bazıları hala duvarı tutabilir. En iyi L formlu büyüme alanı genellikle çizginin ortasında tespit edilebilir.
  5. Kurumasını önlemek için plakayı plastik bir torbaya veya başka bir kaba koyun ve 30 ° C'de inkübe edin (bazı bakteri türlerinin L formları anaerobik koşullarda daha iyi büyüyebilir, bu nedenle anaerobik bir oda daha verimli L formu büyümesi için test edilebilir). Plakayı her gün büyüme kanıtı için inceleyin. Bu genellikle 3 ila 7 gün içinde ortaya çıkar. Büyüme miktarı suşa özgüdür. L-form büyümesinin bir örneği Şekil 4B'de gösterilmiştir.
  6. Bir mikroskop kullanarak L-formlarının varlığını onaylayın. Mikroskobik bir slayt üzerine 2 μL'lik bir LM ortamı damlası yerleştirin ve bir pipet ucu kullanarak, çizginin ortasından az miktarda hücre toplayın ve damlacık içinde yeniden süspanse edin.
    1. 22 x 22 mm'lik bir lamel ile örtün ve 100x faz kontrast objektifine sahip bir mikroskop kullanarak L-formlarının varlığını inceleyin. Temsili bir örnek Şekil 4C'de bulunabilir.

Sonuçlar

Sükroz içeren L formundaki ortam, otoklavlamayı takiben değişen derecelerde karamelizasyona maruz kalabilir ve bu da renk değişikliği ile ilişkilidir. Şekil 2 , sakaroz içeren otoklavlama ortamının temsili sonuçlarını göstermektedir. Şekil 2A , otoklavlamanın ardından kehribar rengine dönüşen LM ortamının tipik bir örneğini göstermektedir. Şekil 2B , otoklavlamayı takiben 1.16 M sükroz çözeltisinin (LM ortamı yapmak için gereken 2 x konsantrasyon) tipik bir örneğini göstermektedir. Bazen, LM ortamı veya sükroz, otoklavlama sırasında yoğun karamelizasyona maruz kalabilir ve bu meydana gelirse ortamın kullanılması önerilmez. Şekil 2C , aşırı karamelize sükroz ortamının bir örneğini göstermektedir.

L-form bakteriler oldukça heterojen olabilir ve Şekil 3, hasta idrar örneklerinde gözlemlenebilen L-form benzeri yapıların örneklerini göstermektedir. İdrar örneklerinde bulunan L formu benzeri yapıların bakteriyel kökenini doğrulamak için, bakteri dizilerini hedefleyen floresan problu FISH önerilir10,23.

Laboratuvar koşullarında indüklenen L-formlarının büyüme seviyeleri suşa özgüdür. Şekil 4B , Bacillus subtilis L-form büyümesinin bir örneğini göstermektedir ve Şekil 4C , Şekil 4B'de indüklenen L-formlarının mikroskobik görünümünü göstermektedir.

İdrar örneği süreci: suş tanımlama, DNA izolasyonu; Diyagram inkübasyon, kültür aşamalarını göstermektedir.
Şekil 1: Filtrasyon yöntemi kullanılarak L-formlarının izolasyonu – şematik gösterim. İdrar örneği, 0.45 μm'lik bir filtreden% 0.2 agar ile desteklenmiş ozmoprotektif LM ortamı içeren polistiren evrensel bir kaba geçirilir. Numune daha sonra 30 °C'de bir aya kadar sabit bir pozisyonda inkübe edilir ve büyüme kanıtı için günlük olarak görsel olarak kontrol edilir. Bu inkübasyon süresi, numunede bulunan herhangi bir L-formunun hücre duvarlarını yenilemesine izin verir. Büyüme tespit edildikten sonra, bakteriler, tek kolonileri izole etmek için düzenli, katı, ozmoprotektif olmayan ortam (besleyici agar veya beyin-kalp infüzyonu gibi) içeren bir plaka üzerinde yeniden çizilebilir, bu daha sonra DNA ekstraksiyonuna tabi tutulabilir ve izole edilen bakteri türlerini tanımlamak için dizileme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sıvı kromatografisi deney sonuçları; A, B, C numunelerindeki renk değişimleri
Şekil 2: L-form ortam. (A) Otoklavlamayı takiben LM ortamı. (B) Otoklavlamayı takiben 1.16 M sükroz (2 x konsantrasyon). (C) Yoğun karamelize LM ortamı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

A-H mikroskop görüntüleri ile hücre morfolojisi analizi; Çeşitli hücre yapıları, kırmızı oklar özellikleri vurgular.
Şekil 3: Faz kontrast mikroskobu ile tekrarlayan İYE'li hastaların idrarında gözlenebilen L-form benzeri yapı örnekleri. (A,B) İdrarda asılı kalan bakteriyel L formlarını bölmek için tipik yapılar. (C,D) Ökaryotik hücrelerle ilişkili bakteriyel L formlarını bölmek için tipik yapılar. (E,F) Gram negatif L formları için hilal şeklindeki yapı karakteristiği (kırmızı ok). (F,G) Duvarlı hücreler ve L formları arasındaki geçişin ara aşamaları için tipik yapılar ( G'deki kırmızı ok). (H) Büyük L formları için tipik olan hücre içi veziküller. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu rakam10'dan değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bakteri kültürü teknikleri; Çizgi Plakası Diyagramı, Petri Kabı Çizgileri, Mikrokoloni Mikroskobu Görüntüsü.
Şekil 4: Katı ortam üzerinde L-formlarının indüksiyonu için çizgi plakası tekniği. (A) L-formlarının indüksiyonu için bir plakanın dörtte biri kullanılarak çizgi oluşturan bakterilerin şematik gösterimi. Ok, bakterilerin çizgilenme yönünü gösterir. (B) 30 ° C'de 3 günlük inkübasyondan sonra (A)'da gösterildiği gibi, çizgilenmeyi takiben Bacillus subtilis L-form büyümesinin bir örneği. (C) faz kontrast mikroskobu ile görüntülenen (B)'de indüklenen L-formları. Ölçek çubuğu = 5 μm. Panel B ve C,16'dan değiştirildi Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu yazıda açıklanan protokoller, E. coli, Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Enterococcus ve Enterobacter spp dahil olmak üzere çeşitli bakteri türlerinin L-formlarını insan idrarından izole etmek ve işlemek için kullanılmıştır ve bunların tümü tipik olarak İYE'lerle ilişkilidir10,24. Bununla birlikte, bir laboratuvarda oluşturulan L-formlarını işleme yöntemleri başka bir laboratuvarda hemen işe yaramayabilir ve bir bakteri türü için işe yarayan bir şey başka bir laboratuvarda işe yaramayabilir. Bu nedenle, burada açıklanan protokollerin birden fazla deneme ve ek optimizasyon gerektirmesi muhtemeldir. Özellikle, besiyerinin besin gereksinimleri, oksijen mevcudiyeti, ozmoprotektan konsantrasyonu ve akışkanlığının test edilmesi gerekebilir. L-form geçişi ve büyümesi için en uygun koşullar, aynı türün duvarlı formlarının büyümesi için en uygun koşullardan farklı olabilir. Ayrıca, protokoller denenirken çeşitli teknik sorunlarla karşılaşılabilir.

L-form besiyerinin hazırlanması ile ilişkili yaygın bir sorun, otoklavlamayı takiben sükroz karamelizasyonudur. Ortamın rengi koyu kahverengiye dönerse, atılmalı ve taze bir parti hazırlanmalıdır. Sükrozun bir şişede suda ve kalan bileşenlerin başka bir şişede, her ikisi de 2x konsantrasyonda hazırlanması gerekebilir. 2x konsantre çözeltiler daha sonra istenen nihai konsantrasyonları elde etmek için otoklavlamanın ardından 1:1 oranında birleştirilebilir. Ayrı ayrı otoklavlanan sükrozun rengi hafif sarıya dönebilir (Şekil 2B), bu kabul edilebilir, ancak koyu kahverengiye dönerse (Şekil 2C), deneyler için kullanılmamalıdır. Sükroz karamelizasyonunu hafifletmek için otoklavlama döngüsünün uzunluğunun ve sıcaklığının ayarlanması gerekli olabilir. Ayarlanmış bir otoklav döngüsü kullanılarak hazırlanan ortamın sterilitesinin test edilmesi, her bir ortamın bir alikotunun 37 ° C'de en az 3 gün boyunca inkübe edilmesi önerilir. Son olarak, karamelizasyon sorunu devam ederse, tuz gibi alternatif bir ozmoprotektif ajanın test edilmesi gerekebilir18.

Hasta örneklerinden L-formlarının izolasyonu sırasında da çeşitli sorunlarla karşılaşılabilir. Protokolde belirtildiği gibi, numunelerde bulunan L-formları potansiyel olarak bozulabilir; Bu nedenle, numunelerin bağıştan sonra mümkün olan en kısa sürede laboratuvara taşınması önemlidir. Aynı nedenle, numunelerin düşük sıcaklıklarda saklanması veya numune bileşiminin değiştirilmesi (örn.ampPBS ilavesi ile) kesinlikle önerilmez.

Filtrasyon yönteminin kendisinin sınırlamaları vardır. Bazı L-formları, filtreden geçen ortam akışı tarafından üretilen kesme kuvvetleri nedeniyle parçalanabilir. Mickiewicz ve ark. tarafından yapılan çalışmada, laboratuvar kaynaklı E. coli L-formları içeren kontrol numunelerindeki L-formlarının sadece% 41'i filtredengeçti 10. Bu, filtrasyon yönteminin pozitif numune sayısının hafife alınmasına yol açabileceğini ve kantitatif çalışmalar için önerilmediğini göstermektedir.

Çok nadir durumlarda, filtrasyonu takiben, ertesi gün L-form izolasyonu için kullanılan yarı sıvı ortam alikotlarında önemli bir büyüme gözlenebilir. Bu, filtrenin protokol sırasında kırıldığının ve duvarlı bakterilerin geçişine izin verdiğinin veya numunenin kontamine olduğunun bir göstergesi olabilir. Bu tür numuneleri atmak veya en azından dikkatli bir şekilde tedavi etmek iyi bir uygulamadır. Yanlış pozitifleri önlemek için numunelerin günlük görsel muayenesi kritik öneme sahiptir. İdrar örneklerini filtrasyon ile işlemeden önce, L-form ayrımının etkinliğini, filtre kırılması nedeniyle duvarlı bakterilerin potansiyel geçişini kontrol etmek ve kullanılan steril tekniğin iyi çalıştığından emin olmak için laboratuvar kaynaklı L-formları, duvarlı bakteriler ve steril ortamdan birkaç numunenin tercih edilen filtreden geçirilmesi önerilir.

Nadir durumlarda, stabil L-formları filtrasyon ile izole edilebilir, mikroskopi ile tespit edilebilen duvarlı formlar yoktur. Canlı L-form bakterileri korumak için, büyümenin verimliliğine bağlı olarak, numunenin birkaç "ilmek dolusunun" taze yarı sıvı LM ortamı içeren bir tüpe aktarılması veya her 3-7 günde bir katı ozmoprotektif ortam üzerinde yeniden çizgi çekilmesi önerilir. Birkaç geçişten sonra duvarlı formlar ortaya çıkmazsa, izolatı korumak için numunelerin –80 °C'de% 40 gliserol içinde dondurulması denenebilir; bununla birlikte, bazı L-formları böyle bir prosedürü iyi tolere edemeyebilir.

Sınırlamalarına rağmen, filtrasyon yöntemi, hasta örneklerinde L-formlarının duvarlı formlardan ayrılması için şimdiye kadar kullanılan tek yöntemdir. İn vivo olarak L-form anahtarlama yapabilen bakteri suşlarının tanımlanmasına izin verir. L-formlarının diğer insan veya çevresel numune türlerinden (örneğin kan veya bitkiler) izolasyonu için filtrasyon yöntemini geliştirme ve uyarlama potansiyeli vardır.

Yukarıdaki hususların tümünü göz önünde bulundurarak, bu yazıda özetlenen protokolleri, katı talimatlar yerine bireysel laboratuvarlarda özel L-form protokolleri geliştirmek için iyi bir başlangıç noktası olarak öneriyoruz. L formlarıyla çalışmak büyük özen, özveri ve sabır gerektirir, ancak pratikle son derece faydalı olabilir. Bu yazıda özetlenen kılavuzların, L-form protokollerinin geliştirilmesi için bir ölçüt haline geleceğini ve bu büyüleyici bakteri formlarını araştırmak için daha temel ve klinik araştırma gruplarını teşvik edeceğini umuyoruz.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Jeff Errington'a (Newcastle Üniversitesi Bakteriyel Hücre Biyolojisi Merkezi Direktörü) bir Avrupa Araştırma Konseyi (hibe numarası 670980) tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.45 ve mikro; L kesme filtreleriSarstedt83.1826
20 mL şırıngaFisher17955460
30 mL polistiren üniversal tüplerStarlabE1412-3010
92 x 16 mm Petri KaplarıStartedt82.1473
AgarOksoitLP0011
AmpisilinSigma-AldrichA9518
Beyin Kalp İnfüzyonuOksoitCM1135
Kapak fişleri (22 x 22 mm, 22 x 50 mm)VWR631-0137/-0125
D-sikloserinSigma-AldrichC6880
Cam mikroskop slaytlarıVWR631-1550P
LizostafinSigma-AldrichL7386
LizozimSigma-AldrichL4919
MgSO4VWR25165.26
MoenomisinSigma-Aldrich32404
Penisilin GSigma-Aldrich13752
FosfomisinSigma-AldrichP5396
SükrozSigma-Aldrich84100

Kaynaklar

  1. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews Microbiology. 10, 123-136 (2011).
  2. Wolf, A. J., Underhill, D. M. Peptidoglycan recognition by the innate immune system. Nature Reviews Immunology. 18, 243-254 (2018).
  3. Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).
  4. Leaver, M., et al. Life without a wall or division machine in Bacillus subtilis. Nature. 457, 849-853 (2009).
  5. Mercier, R., Kawai, Y., Errington, J. General principles for the formation and proliferation of a wall-free (L-form) state in bacteria. eLife. 3, 642(2014).
  6. Cross, T., et al. Spheroplast-Mediated Carbapenem Tolerance in Gram-Negative Pathogens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (9), 00756(2019).
  7. Ramijan, K., et al. Stress-induced formation of cell wall-deficient cells in filamentous actinomycetes. Nature Communications. 9, 5164(2018).
  8. Errington, J., et al. L-form bacteria, chronic diseases and the origins of life. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371, 20150494(2016).
  9. Kawai, Y., Mickiewicz, K., Errington, J. Lysozyme counteracts β-Lactam antibiotics by promoting the emergence of L-form bacteria. Cell. 172, 1038-1049 (2018).
  10. Mickiewicz, K. M., et al. Possible role of L-form switching in recurrent urinary tract infection. Nature Communications. 10, 4379(2019).
  11. Domingue, G. J. Sr, Woody, H. B. Bacterial persistence and expression of disease. Clinical Microbiology Reviews. 10, 320-344 (1997).
  12. Clasener, H. Pathogenicity of the L-phase of bacteria. Annual Review of Microbiology. 26, 55-84 (1972).
  13. Onwuamaegbu, M. E., Belcher, R. A., Soare, C. Cell wall-deficient bacteria as a cause of infections: a review of the clinical significance. Journal of International Medical Research. 33, 1-20 (2005).
  14. Allan, E. J., Hoischen, C., Gumpert, J. Bacterial L-forms. Advances in Applied Microbiology. 68, 1-39 (2009).
  15. Domingue, G. J. Demystifying pleomorphic forms in persistence and expression of disease: Are they bacteria, and is peptidoglycan the solution. Discovery Medicine. 10, 234-246 (2010).
  16. Kawai, Y., et al. Crucial role for central carbon metabolism in the bacterial L-form switch and killing by β-lactam antibiotics. Nature Microbiology. 4, 1716-1726 (2019).
  17. Klieneberger, E. The natural occurrence of pleuropneumonia-like organisms in apparent symbiosis with Streptobacillus moniliformis and other bacteria. The Journal of Pathology and Bacteriology. 40, 93-105 (1935).
  18. Osawa, M., Erickson, H. P. L form bacteria growth in low-osmolality medium. Microbiology. 165 (8), 842-851 (2019).
  19. Domingue, G. J., Schlegel, J. U. The possible role of microbial L-forms in pyelonephritis. The Journal of Urology. 104, 790-798 (1970).
  20. Braude, A. I., Siemienski, J., Jacobs, I. Protoplast formation in human urine. Transactions of the Association of American Physicians. 74, 234-245 (1961).
  21. Kalmanson, G. M., Hubert, E. G., Guze, L. B. Production and therapy of Proteus mirabilis pyelonephritis in mice undergoing chronic diuresis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9, 458-462 (1969).
  22. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064(2012).
  23. Takada, T., Matsumoto, K., Nomoto, K. Development of multi-color FISH method for analysis of seven Bifidobacterium species in human feces. Journal of Microbiological Methods. 58, 413-421 (2004).
  24. Drage, L. K., et al. Elevated urine IL-10 concentrations associate with Escherichia coli persistence in older patients susceptible to recurrent urinary tract infections. Immunity & Ageing. 16, 1-11 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

drardan zolasyonFaz Kontrast MikroskobuL form BesiyeriOsmolarite Duyarl lH cre Duvar EksikBakteriyel Persistansriner Sistem EnfeksiyonlarL form nd ksiyonu
Video yakında

İlgili makaleler