Method Article

Koşullu Stat3 Silme Fare Modelinin İskelet Fenotip Analizi

DOI:

10.3791/61390

⸱

July 3rd, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology, 2Department of Stomatology, Dalian Medical University, 3The 2nd Dental Center, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, in vivo osteoklast aktivitesini kontrol eden kritik genleri anlamak için kurallı bir yöntemi açıklar. Bu yöntem, iskelet fenotipini analiz etmek için transgenik bir fare modeli ve bazı kurallı teknikler kullanır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgenik fare modelleri, osteoklast farklılaşmasını ve aktivitesini kontrol eden kritik genleri anlamak ve osteoporozun mekanizmalarını ve farmasötik tedavilerini incelemek için güçlüdür. Cathepsin K (Ctsk)-Cre fareleri osteoklastların fonksiyonel çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Transkripsiyon 3'ün (STAT3) sinyal dönüştürücüsü ve aktivatörü kemik homeostazında geçerlidir, ancak in vivo osteoklastlardaki rolü zayıf tanımlanmıştır. STAT3'ün osteoklast farklılaşmasına ve kemik metabolizmasına katıldığına dair in vivo kanıtları sağlamak için osteoklast spesifik bir Stat3 silme fare modeli(Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) ve iskelet fenotipini analiz etti. Mikro-CT tarama ve 3D rekonstrüksiyon, koşullu nakavt farelerinde kemik kütlesinin arttığını ima etti. Kemik metabolizmasını tespit etmek için H&E lekelenmesi, kalsesin ve alizarin kırmızı çift boyama ve tarta dayanıklı asit fosfataz (TRAP) lekeleme yapıldı. Kısacası, bu protokol iskelet fenotipini analiz etmek ve in vivo osteoklast aktivitesini kontrol eden kritik genleri incelemek için bazı kurallı yöntem ve teknikleri açıklar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İskelet kemiği insan vücudunun ana yük taşıyan organıdır ve yürüyüş ve egzersiz sırasında hem iç hem de dış ortamdan baskı altındadır1. Kişinin yaşamı boyunca, kemikler sürekli olarak osteoblastlar ve osteoklastlar tarafından dengelenen kendini yenilemeden geçer. Osteoklastların eski kemikleri temizleme ve osteoblastların yeni kemik oluşturma süreci, iskelet sisteminin homeostazını ve mekanik işlevini korur2. Dengedeki bozukluk osteoporoz gibi kemik metabolik hastalıklarına neden olabilir. Aşırı osteoklastik aktivitenin neden olduğu osteoporoz, küresel olarak yaygındır ve topluma önemli ekonomik kayıplara neden olur2,3,4. Osteoporoz tedavisi için mevcut sınırlı sayıda ilada ve yan etki risklerine göre4, osteoklast oluşumu ve aktivitesinin ayrıntılarını ortaya çıkarmak önemlidir.

Monosit/makrofaj hematopoetik soyundan elde edilen osteoklastlar birden fazla çekirdeğe sahiptir (2 ila 50 çekirdek olabilir) ve büyüktür (genellikle çapı 100 μm'den büyüktür)2. Mekanizmaların keşfi ve ilaçların osteoklastik bozukluklar için taranma in vitro osteoklast kültürü ile yaygın olarak geliştirilmiş olmasına rağmen, karmaşık organik reaksiyonlar in vivo kanıtları hedeflenen tedavi için vazgeçilmez kılmaktadır. Fareler ve insanlar arasındaki genetik ve patofizyolojik benzerlikler nedeniyle, genetik olarak tasarlanmış fare modelleri, insan hastalığının mekanizmalarını ve farmasötik tedavilerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır in vivo6. Cre-loxP sistemi fare gen düzenlemesi için yaygın olarak kullanılan bir teknolojidir ve araştırmacıların gen fonksiyonlarını doku/hücreye özgü bir şekilde araştırmalarını sağlamıştır5. Cathepsin K (CSTK), kemik kollajen8'ibozabilen osteoklastlar tarafından salgılanan sistein proteazdır. CTSK'nın olgun osteoklastlarda seçici olarak ifade edildiği iyi kabul edilmektedir; Bu nedenle, Ctsk-Cre fareleri osteoklastların fonksiyonel çalışmaları için yararlı bir araç olarak kabul edilir ve6.

Transkripsiyon (STAT) ailesinin sinyal dönüştürücüsü ve aktivatörü klasiktir ve bağışıklık ve kanser ilerlemesi ve gelişiminde oldukça önemlidir7,8. Yedi STAT arasında, STAT3'ün kemik homeostazı9,10ile en alakalı olduğu bildirilmektedir. Çeşitli in vivo çalışmalar, OSTEOBLASTLARDA STAT3'ün spesifik inaktivasyonunun kemik oluşumunu azalttığını bildirmektedir9,10. Bununla birlikte, STAT3'ün osteoklast oluşumuna ve kemik metabolizmasına in vivo katılımına ilişkin sağlam kanıtlar hala sınırlıdır. Son zamanlarda, osteoklast spesifik Stat3 silme fare modeli (Stat3fl / fl; Ctsk-Cre, bundan sonra Stat3Ctskolarak adlandırılır) STAT3 osteoklast farklılaşmasına ve kemik metabolizması11'e katılır. Bu çalışmada, osteoklast spesifik STAT3 delesyonunun kemik homeostazı üzerindeki etkisini incelemek için Stat3Ctsk farelerinin kemik kütlesi, kemik histoporfolojisi ve kemik anabolizması ve katabolizmasındaki değişiklikleri analiz etmek için kullandığımız yöntem ve protokolleri açıklıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan hayvanlarla ilgili tüm yöntemler Şanghay Jiaotong Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

1. Osteoklast spesifik Stat3 silme farelerinin yetiştirilmesi

NOT: Stat3fl/fl fareler ticari olarak elde edilmiştir. Ctsk-Cre fareleri S. Kato tarafından sağlanmıştır (Tokyo Üniversitesi, Tokyo, Japonya12). Fareler, standart koşullarda kurumsal hayvan tesisinde belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında yetiştirildi ve bakımı yapıldı.

  1. Cinsel olarak olgun bir erkek fareyi aynı yaştaki iki dişi fareyle eşleştirin. 18 gün sonra, yenidoğan için günlük kontrolleri kontrol edin. Hamile dişi fareleri ayırın ve gerekirse yalnız tutun. Dişi fareler eşleştirmeden sonraki 1 ay içinde hamile değilse, erkek fareleri farklı üreme kafesleri arasında değiştirin.
  2. Stat3fl/fl farelerini Ctsk-Cre farelerine (F0) çapraz. Genotipleme için kuyrukları kırpın ve erkek Stat3fl /+; Ctsk-Cre fareleri, yaklaşık 6 haftalık (F1) olan cinsel olarak olgunlaşana kadar. Aşağıdaki astarları kullanın: Stat3 F-TTGACCTGTCTCCTACAAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTCTTC.
  3. Çapraz 6 haftalık erkek Stat3fl/+; Dişi Stat3fl / fl fareleri ile Ctsk-Cre fareleri. Genotipleme için kuyrukları kırpın ve erkek Stat3 fl / fl'itutun; Ctsk-Cre fareleri, yaklaşık 6 haftalık (F2) olan cinsel olarak olgunlaşana kadar.
  4. Çapraz 6 haftalık erkek Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre fareler ile dişi Stat3fl/fl fareler (F3). Genotipleme için kuyrukları kırpın ve eski üreme farelerini zamanla daha genç farelerle değiştirin (F3 + N).

2. Numune toplama

  1. Altı çift 8 haftalık erkek Stat3fl/fl ve Stat3Ctsk çöp eş farelerini karbondioksit boğulması ile ayrı ayrı ötenazi edin.
    NOT: CO2 akış hızı, kafes hacminin dakikada %30'unu yerinden eder (örneğin, 45 cm x 30 cm x 30 cm kafes için CO2 akış hızı 40 L/dk'dır).
  2. Fareleri bir destek pozisyonuna yerleştirin. bilateral kalça eklemlerini elle hafifçe yerinden sökün. Cildi distal kaval kemiğinden dikey olarak kesmek için oftalmik makas kullanın ve ardından tüm cildi arka uzuvdan parçalara bölün.
  3. Arka uzvu ayırmak için sağ kalça ekleminin ve diz ekleminin eklem bağını makasla kesin. Trokanteri ve fibulanın birleştiği yerde kesin ve arka uzvu% 4 paraformaldehit içine daldırın. 3. adım için sağ arka uzuvları saklayın. Kemik iliğini% 4 paraformaldehit ile tamamen daldırmak ve düzeltmek için kemiği her iki ucundan uygun şekilde kesin.
  4. Sol kalça ekleminin ve diz ekleminin eklem bağını makasla kesin, yumuşak dokuyu hafifçe çıkarın ve kaval kemiğini ve uyluk kemiğini dikkatlice ayırın. Kaval kemiğini ve uyluk kemiğini ayrı ayrı% 75 etanol içine daldır. 4. adım için femora ve adım 6 için kaval kemiği tutun. Trochanter'ı sağlam tuttuğunuzdan emin olun.

3. Parafin bölümü hazırlığı

  1. Sağ arka uzvu 48 saat boyunca 4 °C'de % 4 paraformaldehitte sabitle.
  2. Kireçten arındır: Numuneleri 1x PBS ile 10 dakika 3 kez hafifçe yıkayın. Kemikleri bükülene kadar 3 ila 4 hafta boyunca bir ultrasonik kireç çözücü ile örnekleri% 15 EDTA'da (800 mL'de 800 mL ddH2O ve 10x PBS'de 100 mL) kireçten arındırın. Her gün taze kireç çözen sıvı ile değiştirin.
  3. Numuneleri 1x PBS ile 3x hafifçe yıkayın ve ardından bir gecede 4 °C'de% 75 etanol içine daldırın.
  4. Susuzluk: İkinci gün, örnekleri her biri iki kez 1 saat boyunca% 95 etanol,% 100 etanol ve ksilen içine sırayla daldırma.
  5. Örnekleri 30 dakika boyunca 1/2 ksilen 1/2 parafin içine daldırın. Numuneleri gece boyunca 65 °C'de parafin içine daldırın.
  6. Gömme: Gömme için uygun bir gömme tankı seçin. Kaval kemiğini düzgün bir şekilde altına yerleştirin. Uyluk kemiğini ve kaval kemiğini 90° açıyla yerleştirin. Parafin tamamen soğuduktan ve katılaştıktan sonra gömme tankından çıkarın. Örnekleri numaralayın ve gece boyunca -20 °C'de saklayın.
  7. Mikrotom kullanarak sürekli olarak 5 μm kalınlığında bölümleri kesin. 20-40 bölüm kesin. Bölümleri 37 °C suya yayın, mikroskop slaytlarına yapıştırın ve gece boyunca 42 °C'de pişirin.

4. Mikro BT tarama ve analizi

  1. Mikro-CT tarayıcı ile sol femorayı tarayın. Çözünürlük: 10 μm; Gerilim: 70 kV; Akım: 114 μA; Fliter: 0,5 mm Al; Dönme adımı: 0,5°.
  2. Üreticinin talimatını takiben tarayıcının destekleyici yazılımını kullanarak kortikal kemik ve trabeküler kemiğin 3B görüntülerini yeniden yapılandırın. ROI'ler distal büyüme plakasına yakın toplam 1 mm genişlikte trabeküler kemikte ve femoranın ortasında kortikal kemiğin toplam 1 mm genişliğinde bir bölümündedir.
  3. Nicel mikro mimarisi parametrelerini hesaplayın: kemik mineral yoğunluğu (BMD), kemik hacmi fraksiyonu (BV/TV), trabeküler kalınlık (Tb.Th.), trabeküler sayı (Tb.N.), trabeküler ayırma (Tb.Sp.) ve kortikal kemik kalınlığı (Ct.Th.).

5. TUZAK boyama

  1. Parafin bölümlerini 65 °C'de 30 dakika pişirin.
  2. Dewax: Bölümleri 10 dakika boyunca ksilen içine daldırın. Bu adımı taze ksilen ile 3x gerçekleştirin.
  3. Rehidrat: Bölümleri sırayla% 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol ve ddH2O'ya daldırın, her biri iki kez 5 dakika boyunca.
  4. Üreticinin talimatlarına uyarak TRAP boyama kitini kullanarak boyama sokumini hazırlayın ve 37 °C'ye ısıtın.
    NOT: TRAP boyama sosu her test öncesinde hemen yeni hazırlanmalıdır.
  5. Her numuneye 50-100 μL boyama çözeltisi ekleyin ve 37 °C nemli bir odada 20-30 dakika kuluçkaya yatırın. Kırmızı çok fonksiyonlu osteoklastlar görülene kadar her 5 dakikada bir ışık mikroskobu altında osteoklastların boyama durumunu kontrol edin. Reaksiyona ddH2O ile son verin.
  6. 30 s için hematoksilin çözeltisinde karşıtlık. 1 dakika boyunca% 1 amonyak çözeltisinde daldırarak kararlı bir mavi renk oluşturun. Yavaşça akan musluk suyunda durulayın.
  7. Bölümleri nötr balsam kullanarak kapaklarla monte edin ve gece boyunca kurutun.
  8. 3-5 ilgi alanını mikroskopla yakalayın. Trabeküler çevreyi Resim J ile analiz edin: ' düzçizgi' aracını L1 olarak kullanarak ölçek çubuğunun (Ls) uzunluğunu ölçün, ardından 'parçalı çizgi' aracını L2, fiziksel uzunluk (Lp)= Ls * L2 / L1 olarak kullanarak trabeküler çevrenin uzunluğunu ölçün. Trap pozitif hücrelerin sayısını üçten fazla çekirdekle sayın.

6. Calcein ve alizarin kırmızı çift etiketleme

  1. Numune hazırlama: Intraperitoneally enjekte 20 mg/kg kalsein (1 mg/mL % 2 NaHCO3 çözeltisi içinde) gün 0, ve 25 mg/kg alizarin kırmızı S (AL, H 2 O'da2mg/mL) 4. 7. günde fareleri kurban edin. Kaval kemiğini dikkatlice ayırın ve 48 saat boyunca 4 °C'de% 4 paraformaldehitte sabitleyin.
  2. Dehidrat: Sabitlemeden sonra kaval kemiğini 3x'i 1x PBS ile hafifçe yıkayın. Numuneleri sırayla% 95 etanol,% 100 etanol ve ksilen için 5 dakika boyunca ayrı ayrı daldırın.
  3. Numuneleri 12 saat aseton, 2 saat boyunca 1/2 aseton 1/2 reçine ve bir gecede kurutma fırınında saf reçineye daldırin.
    NOT: Reçine, üreticinin talimatlarına göre piyasada bulunan reçine (örneğin, Embed 812 Reçine) tarafından hazırlanmıştır.
  4. Gömme: Uygun bir silika jel gömme tankına saf reçine ekleyin ve kabarcıkları önlemek için numuneleri hafifçe yerleştirin. Reçineyi 60 °C'de 48 saat boyunca kurutma fırınında polimerize edin.
  5. Numuneleri döner mikrotom ile sürekli olarak 5 μm kalınlığında bölümlere kesin. Numunelerin geri kalanını oda sıcaklığında kurutucu ile saklayın.
  6. Bölümleri% 75 alkol damlasına cımbızla yapıştırın. Bölümleri nötr balsam kullanarak kapaklarla monte edin. Floresan mikroskop ile kırmızı ve yeşil floresan etiketlemeyi yakalayın.
  7. İki etiketleme çizgisi (Ir.L.Wi), tek etiketli trabeküler çevre (sL.Pm), çift etiketli trabeküler çevre (dL.Pm) ve toplam trabeküler çevre (Tb.Pm) arasındaki genişliği ölçün. Mineral appozisyon oranını (MAR) ve kemik oluşum oranını (BFR/BS) hesaplayın. MAR = Ir.L.Wi/interval days. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*%100.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol kullanılarak, STAT3 silmenin osteoklast farklılaşması üzerindeki etkisini incelemek için osteoklast spesifik Stat3 silme fareleri üretildi. Stat3Ctsk fareleri ve wildtype (WT) çöp arkadaşları genotiplemeden sonra yetiştirildi ve tutuldu. Kemik iliği makrofajları izole edildi ve osteoklastlar halinde kültürlendi ve Stat3Ctsk farelerinde STAT3delesyonu gösterildi (Şekil 1).

Femora rek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetik olarak tasarlanmış fare modelleri genellikle insan hastalığının mekanizmasını ve farmasötik tedavisini incelemek için kullanılır13. Ctsk-Cre fareler osteoklastların fonksiyonel çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır6. Bu çalışmada iskelet fenotipini analiz etmek ve in vivo osteoklast aktivitesini kontrol eden kritik genleri incelemek için yöntemlerin protokolleri açıklanmıştır.

Histolojik analiz kemik metabolizmasını tes...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prof. Weiguo Zou ve S. Kato'ya reaktifler ve fareler için ve Zou laboratuvarı üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Ayrıca Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Kraniyofasiyal Anomaliler Için Dijitalleştirilmiş Stomatoloji ve Araştırma Merkezi Laboratuvarı'na yardım için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (NSFC) hibeleriyle desteklendi [81570950,81870740,81800949], Şanghay Zirvesi & Plato Disiplinleri, Şanghay Hassas Tıp Enstitüsü'nden SHIPM-mu fonu, Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi [JC201809], Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi için Üst Düzey İnovasyon Ekibinin Teşvik Projesi , Shanghai JiaoTong üniversitesi Tıp Fakültesi Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Disiplinler Arası Araştırma Fonu [JYJC201902]. Ve L.J. Üstün Gençlik Tıbbi Yetenekleri, Şanghay "Tıbbi Yeteneğin Yükselen Yıldızları" Gençlik Geliştirme Programı ve Şanghay Jiaotong Üniversitesi'nden "Chen Xing" projesinin bir bilginidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 4 Paraformaldehit çözeltisiSangon biotech Co., Ltd.
Aseton ŞangayDeneysel Reaktif Co., Ltd.
AlizarinSigma-AldrichA5533
Amonyak çözeltisiŞangay Deneysel Reaktif Co., Ltd.
CalceinSigma-AldrichC0875
Ctsk-Cre fareler, S. Kato, Tokyo Üniversitesi, Tokyo, Japonya'dan bir hediye
DDSAElektron Mikroskobu Bilimleri13710
DeCa Hızlı KireçÇözücü Pro-CureDX1100
DMP-30 ElektronMikroskobu Bilimleri13600
EDTAŞangay Deneysel Reaktif Co., Ltd.60-00-4
EMBED 812 REÇİNE ElektronMikroskobu Bilimleri14900
floresan mikroskobuOlympusIX73
Hematoksilen çözeltisiBeyotime BiotechanologyC0107
Mikro-CTScanco Medical AG& mu; CT 80
NaHCO3Şangay Deneysel Reaktif Co., Ltd.
Nötr balsamSangon biotech Co., Ltd.
NMAElektron Mikroskobu Bilimleri19000
ParafinSangon biyoteknoloji Co., Ltd.
döner mikrotomLeicaRM2265
Stat3fl/fl farelerGemPharmatech Co., LtdD000527
TRAP boyama kitiSigma-Aldrich387A
ksilenŞangay Deneysel Reaktif Co., Ltd.1330-20-7
E6720028000036010018918E675007A601889

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
  2. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  3. Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
  4. Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis. New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).
  5. Kos, C. H. Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models. Nutrition reviews. 62 (6), Pt 1 243-246 (2004).
  6. Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
  7. Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).
  8. Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).
  9. Itoh, S., et al. A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation. Bone. 39 (3), 505-512 (2006).
  10. Zhou, H., et al. Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species. Bone. 49 (3), 404-411 (2011).
  11. Yang, Y., et al. STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription. Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).
  12. Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130 (5), 811-823 (2007).
  13. Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).
  14. Minkin, C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).
  15. Vaaraniemi, J., et al. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).
  16. Ljusberg, J., et al. Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).
  17. Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).
  18. Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations. American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).
  19. Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).
  20. Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity. American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).
  21. Solberg, L. B., et al. Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats. Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).
  22. Tambutté, E., et al. Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification. Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).
  23. Han, Y., et al. Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).
  24. Dai, Q., et al. mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression. Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).
  25. Sun, J., et al. Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts. Bone Research. 6, 14(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stat3 Deletion Mouse ModelOsteoclast DifferentiationSkeletal Phenotype AnalysisMicro CT ScanningTRAP StainingCalcein Alizarin Red LabelingH and E StainingParaffin SectioningBone Mass MeasurementOsteoclastogenic Activity

Related Articles