Burada açıklanan protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı beyin benzeri endotel hücrelerinin ayırt edilmesinde, enfeksiyon için Neisseria meningitidis'in hazırlanmasında ve diğer moleküler analizler için numune toplanmasında ana adımları vurgulamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Neisseria meningitidis İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Beyin Endotel Hücrelerinin Enfeksiyonu
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Meningokok menenjiti, Neisseria meningitidis (meningokok , Nm) son derece özelleşmiş beyin endotel hücrelerine (BEC'ler) nüfuz ederek merkezi sinir sistemine (CNS) erişebildiğinde ortaya çıkan hayatı tehdit eden bir enfeksiyondur. Nm insana özgü bir patojen olduğundan, sağlam in vivo model sistemlerinin olmaması, Nm ve BEC'ler arasındaki konak-patojen etkileşimlerinin incelenmesini zorlaştırmakta ve doğal BEC'leri taklit eden insan tabanlı bir modele ihtiyaç duyulmasını sağlamaktadır. BEC'ler, karmaşık sıkı bağlantılar ve yüksek trans-endotelyal elektrik direnci (TEER) ile karakterize periferik endotel hücrelerine kıyasla daha sıkı bariyer özelliklerine sahiptir. Bununla birlikte, birincil BEC'ler ve ölümsüzleştirilmiş BEC'ler gibi birçok in vitro model, doğal nöral mikroçevreden çıkarıldıktan sonra bariyer özelliklerinden yoksundur veya hızla kaybeder. İnsan kök hücre teknolojilerindeki son gelişmeler, diğer in vitro insan modellerine kıyasla fenoskopi BEC'lerini daha iyi hale getiren indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) beyin benzeri endotel hücreleri türetmek için yöntemler geliştirmiştir. Nm-BEC etkileşimini modellemek için iPSC'den türetilen BEC'lerin (iPSC-BEC'ler) kullanılması, BEC bariyer özelliklerine sahip insan hücrelerini kullanma avantajına sahiptir ve bariyer yıkımını, doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonunu ve bakteri etkileşimini incelemek için kullanılabilir. Burada, bakteri preparasyonu, enfeksiyon ve analiz için numune toplamaya ek olarak iPSC'lerden iPSC-BEC'lerin nasıl türetileceğini gösteriyoruz.
Giriş
Kan-beyin bariyeri (BBB) ve meningeal kan-BOS bariyeri (mBCSFB), dolaşımı merkezi sinir sisteminden (CNS) ayıran ve esas olarak oldukça özelleşmiş beyin endotel hücrelerinden (BEC'ler) oluşan son derece sıkı hücresel bariyerlerdir1,2. Birlikte, BEC'ler birçok toksin, ilaç ve patojeni hariç tutarken, beynin içindeki ve dışındaki besinleri ve atık ürünleri düzenleyerek uygun beyin homeostazını korur 1,2. Bakteriyel menenjit, kan yoluyla bulaşan bakteriler BEC'lerle etkileşime girebildiğinde ve BEC'ler tarafından oluşturulan bariyere nüfuz edebildiğinde v....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Tüm besiyeri / reaktif hazırlama, kök hücre bakımı ve farklılaşma adımları Stebbins ve ark.22'den uyarlanmıştır.
1. iPSC kültürü ve BEC farklılaşması için gerekli malzemelerin hazırlanması.
- IMR90-4 iPSC kültürü için doku kültürü (TC) plastiğinin matris kaplaması
- Aliquot bazal membran matris jeli (örn., Matrigel) 2.5 mg alikotlar halinde ve -20 ° C'de saklayın.
NOT: 4 °C'nin üzerinde bir jel oluşturduğundan ve katılaştıktan sonra alıntılanamayacağından, matris jeli ve alikotu buz üzerinde tutarken hızlı çalışın. - TC plastiği kaplamak için, 50 mL'lik konik bir tüpte 30 mL Dulbecco'nu....
- Aliquot bazal membran matris jeli (örn., Matrigel) 2.5 mg alikotlar halinde ve -20 ° C'de saklayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada açıklanan protokol Stebbins ve ark. ve iPSC'leri BBB özelliklerine sahip beyin benzeri endotel hücrelerine ayırma sürecini ve bu modelin Nm19,22 ile iPSC-BEC'leri kullanan enfeksiyon çalışmaları için nasıl kullanılacağını vurgulamaktadır. iPSC-BEC'ler, uygun şekilde farklılaştırıldığında, TEER tarafından ölçülen ve genellikle 2000 Ω·cm2'den büyük olan sıkı bariyer özellikleri sergiler ve VE-kaderin ve CD31 (PECAM) gibi endotelyal belirteçleri ek.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
BEC'lerin ve BBB'nin modellenmesi, birincil ve ölümsüzleştirilmiş insan BEC'leri, in vitro olarak, sağlam bariyer fenotiplerinden yoksun olma eğiliminde olduğundan, zorluklar yaşamıştır. İnsan kök hücre teknolojilerinin ortaya çıkışı, endotelyal belirteçler, sıkı bağlantı ekspresyonu, bariyer özellikleri, diğer CNS hücre tiplerine yanıt ve fonksiyonel akış taşıyıcıları gibi beklenen ayırt edici BBB fenotiplerini koruyan iPSC'den türetilmiş BEC benzeri hücrelerin üretilmesine izin vermiştir12,13.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
L.M.E., A. S-U'ya verilen "İnsan Patojenleri Tarafından Mikrobiyal Enfeksiyonların İncelenmesi için 3D Doku Modelleri" başlıklı GRK2157 DFG araştırma eğitim programı tarafından desteklenmektedir. B.J.K., Alexander von Humboldt Vakfı tarafından doktora sonrası bursu ile desteklenmektedir. Ek olarak, kültürde iPSC-BEC'lerin oluşturulmasındaki teknik yardımı için Lena Wolter'a teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Accutase (1x) | Sigma | A6964 | Enzimatik hücre ayrışma reaktifi |
| Asetik asit | Sigma | A6283 | |
| All-trans retinoik asit (RA) | Sigma | R2625 | |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | Thermo Scientific (Labvision) | RB-10333 | |
| Anti-Claudin-5 | Invitrogen | 4C3C2 | |
| Anti-Glut-1 | Thermo Scientific (Labvision) | SPM498 (MA5-11315) | |
| Anti-Oklüdin, | İnvitrojen | 33-1500 | |
| Anti-VE-cadherin, | Santa Cruz | sc-52751 | |
| Anti-ZO-1 | Invitrogen | 33-9100 | |
| Bacto Proteoz, Pepton | BD | 211684 | |
| b-Merkaptoetanol | Merck (Sigma-Aldrich) | 805740 | |
| Hücre kültürü plakaları ve şişeleri | Sarstedt | ||
| Santrifüj (Heraeus Megafuge 1.0R) | Thermo Scientific | ||
| Class II biyogüvenlik kabini | Nuaire | NU-437-400E | |
| CO2 İnkübatörü (DHD Autoflow CO2 Hava Ceketli İnkübatör) | Nuaire | ||
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Columbia ager + %5 koyun kanı | Biomerieux | 43049 | |
| Costar Transwell polyester filtreler (12 veya 24 kuyulu) | Corning | 3460, 3470 | |
| D (+) - Glikoz | Merck (Sigma-Aldrich) | G8270 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | |
| DMSO | ROTH | A994.1 | |
| Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) | Gibco | 21600-069 | |
| STX elektrotlu Epitelyal Volt-Ohm Metre (Millicell ERS-2) | Merck (Millipore) | MERS00002 | |
| Fe(NO3)3 | ROTH | 5632.1 | |
| Fibronektin | Sigma | F1141 | |
| Floresan mikroskobu (Eclipse Ti) | Nikon | ||
| Hemacytometer (Neubauer) | A. Hartenstein | ZK06 | |
| İnsan temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) | PeproTech | 100-18B | |
| İnsan Endotelyal Serumu Serbest Ortam (hESFM) | Gibco | 11111-044 | |
| Ters mikroskop (Wilovert) | Hund (Will Wetzlar) | ||
| iPS(IMR90)-4 hücre | WiCell | ||
| Kellogg's takviyesi | hazırlamak için 100 ml 4 g/ml glikoz, 0.1 g/ml glutamin ve 0.2 mg/ml tiamin pirofosfat ve 10 ml 5 mg/ml Fe (NO3< / sub>)3< / sub> hazırlayın ve solüsyonları birleştirin. Filtre, sterilize edin ve -20 ° C'de saklayın. | ||
| Nakavt serum replasmanı (KOSR) | Gibco | 10828-028 | |
| L-glutamin (GlutaMAX) | Invitrogen | 35050-038 | |
| LunaScript RT SuperMix Kiti | NEB | E3010L | cDNA sentez kiti |
| Matrigel Matrix | Corning | 354230 | |
| Metanol | ROTH | 4627.5 | |
| MgCl2 | ROTH | KK36.1 | |
| Mikropipetler (Araştırma Plus) | Eppendorf | ||
| NaHCO3 | ROTH | 6329 | |
| Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| NucleoSpin RNA izolasyon kiti | Machery-Nagel | 740955 | RNA izolasyon kiti |
| Pipet çocuğu (Accu-Jet Pro) | Marka | ||
| Trombositten fakir plazma türevli serum, sığır (PDS) | Fisher | 50-443-029 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25742 | qPCR ana karışım |
| qPCR filmi (MicroAmp Optik Yapışkan Film) | Applied Biosystems | 4211971 | |
| qPCR plakaları (MicroAmp Fast 96 kuyulu) | Applied Biosystems | 4346907 | |
| ROCK inhibitörü, Y27632 dihidroklorür | Tocris | 1254 | |
| RT-PCR termo döngüleyici (StepOnePlus) | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Serolojik pipetler | Sarstedt | ||
| StemFlex bazal ortam + 50x StemFlex takviyesi | Gibco | A3349401 | Kök hücre bakım ortamı |
| Sallanan Kova Rotoru (Heraeus #2704) | Thermo Scientific | ||
| Tiamin pirofosfat | Sigma | C8754-5G | |
| Tripan Mavisi Çözeltisi, %0.4 | Gibco | 15250061 | |
| Versene | Gibco | 15040-033 | Enzimatik olmayan hücre ayrışma reaktifi (EDTA) |
Kaynaklar
- Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
