Method Article

Yüksek İşlemli DNA Çıkarma Plakalarının Yüklenmesinde Modifiye Yöntemler Kontaminasyon Potansiyelini Azaltır

DOI:

10.3791/61405

⸱

June 3rd, 2020

 , 
1Department of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming, 2Program in Ecology, University of Wyoming, 3EPSCoR-IDEA, University of Wyoming, 4Department of Botany, University of Wyoming

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA ekstraksiyonları için 96 kuyulu plakayükleme için mevcut yöntemler kontaminasyona yatkın olabilir. Kuyular arasında çapraz kontaminasyon riskini azaltan 96 kuyulu plakaların yüklenmesi için yeni bir yöntem ayrıntılı olarak inceleniyoruz. Yöntemimiz, diğer araştırmacıların yüksek verimli DNA çıkarma tekniklerinin verimliliğinden yararlanmalarına ve kontaminasyon riskini en aza indirmelerine yardımcı olacaktır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek verimli DNA dizileme teknikleri mikrobiyal topluluklar, ev sahibi özellikleri ve daha geniş ekosistem fonksiyonları arasındaki ilişkileri anlamamızda önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Genişlik ve sıralama yetenekleri derinliği bu hızlı artış ile ayıklamak için yöntemler geldi, yükseltmek, analiz etmek, ve maksimum verimlilik ile başarılı bir şekilde çevresel DNA yorumlamak. Ne yazık ki, hızlı bir şekilde DNA çıkarma gerçekleştirme örnekleri arasında kontaminasyon riskini artırma pahasına gelebilir. Özellikle, 96 kuyulu bir plakada bulunan numunelere dayanan yüksek iş çıkarmalar, tek tüplü ekstraksiyonlara kıyasla nispeten hızlı bir yöntem sunmakla birlikte, iyiye çapraz kontaminasyon olanaklarını da artırır. Numuneler arasında çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmek için, yüksek iş hacmi çıkarma tekniklerinin avantajlarını korurken, çevresel numuneleri 96 kuyulu plakalara yüklemek için yeni bir yöntem geliştirdik. Numuneleri yüklerken her plakayı kapsayacak şekilde delilebilir PCR sızdırmazlık filmlerini kullandık ve numuneleri kuyulara taşımadan önce PCR tüplere ekledik; birlikte, bu uygulamalar örnek sürüklenme ve kuyuların istenmeyen çift yükleme riskini azaltır. Bu makalede özetlenen yöntem, araştırmacılara mevcut yüksek iş gücü çıkarma tekniklerini en üst düzeye çıkarma yaklaşımı sağlarken, 96 kuyulu plakalara doğal çapraz kontaminasyon riskini de azaltır. İstenmeyen çapraz kontaminasyon riskini en aza indirirken örnek toplamadan DNA çıkarmasına nasıl geçebileceğimize dair adım adım ayrıntılı bir adım sayılmayı sağlıyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiyal toplulukların yüksek iş bölümü ndeki son gelişmeler benzersiz sıralama derinliği ve sonuç olarak, Dünya'nın mikrobiyom1'inişleyişi ne ve çeşitliliğine emsalsiz bir bakış sağlamaktadır. Tek bir sıralama şeridine daha fazla numune katlandırma yeteneği arttıkça, tek tüpLÜ DNA çıkarma, ekolojik veri üretiminde hız sınırlayıcı bir adım olma potansiyeline sahiptir. Ancak, yüksek verimli DNA ekstraksiyonları yeni yöntemler daha önce mümkün olandan daha fazla verimlilik ile çevresel örneklerin büyük miktarlarda işlenmesi için söz tutun2. Bu yöntemler genellikle tek tüpler yerine 96-iyi plakalar kullanarak, bu nedenle ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 96 kuyulu bir plakanın yüklenmesi için laboratuvar tezgahı ve takım hazırlığı

  1. % 70 etanol ile sisleme tarafından tezgah üst temizleyin. % 10 çamaşır suyu ile tezgah üst püskürtme önce silin ve hava kuru izin. Tezgahın üstlerini kurutun.
  2. Mikro-scoopula sterilize, spatula, ve cerrahi makas (kavisli) daldırma tarafından 95% etanol ve daha sonra bir alev maruz. Her biri %10 çamaşır suyu daldırın ve kullanmadan önce havanın kurumasını bekleyin.
    NOT: Araçlar her numune arasında sterilize edilmelidir.

2. Alt örnekleme ve numune hazırlama

  1. Alt örnekleme den önce etanol kullanarak eldivenleri sterilize edin.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yeni yöntem 96 kuyulu DNA çıkarma plakalarını yüklemek için başarıyla kullanılmıştır. Plaka yükleme yöntemlerinin karşılaştırılması, metoduzun boş kuyularda en düşük DNA konsantrasyonuna sahip olduğunu gösterdi. Boş kuyularda DNA konsantrasyonu benim McPherson et al.9 (p < 0.05) önerilen yöntemden önemli ölçüde daha düşüktü, ancak yöntemimizdeki DNA konsantrasyonları istatistiksel olarak Qiagen varsayılan yönteminden istatistiksel olarak farklı değildi(Şekil 2)........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, yüksek üretim numune çıkarma plakaları yüklerken iyi-to-well çapraz kontaminasyon için fırsatları azaltır ve mevcut plaka yükleme stratejileri 9 ötesinde 96-iyi plakalar yüklemek için daha kontrollü bir araç sunuyor9,10. Kuyular arasında kontaminasyon tek tüp çıkarmalarda daha 96-iyi plaka ekstraksiyon daha yaygın olabilir, özellikle otomatik6,7, ve, herhangi bir metodoloji de özel olarak test .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması rapor ve ifşa etmek için hiçbir şey var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma Mikrobiyal Ekoloji İşbirliği tarafından NSF ödülü #EPS-1655726 fon ile desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
18 oz WhirlPakNascoB01065
2 mL santrifüj tüpleriFisherbrand05-408-129
200 & mikro; L mikro-PCR tüpleriThermo ScientificAB 2000
96 kuyulu PowerSoil DNA ekstraksiyon kitiQiagen12955-4Bir toprak ekstraksiyon kiti kullandık, ancak herhangi bir 96 oyuklu format kiti işe yarayacaktı.
2 mL santrifüj tüpleri için buz bloğuHerhangi2mL tüpler için yapılan herhangi bir buz bloğu işe yarayacaktır
200 ve mikro için buz bloğu; L mikro-PCR tüpleriHerhangi BirHerhangi 200 & için yapılmış herhangi bir buz bloğu; L tüpler işe yarayacak
Mikro kepçeHerhangi
Önceden Kesilmiş Delinebilir Sızdırmazlık FilmiExcel ScientificXPS25
SpatulaHerhangiBir Cerrahi
MakasHerhangi Bir
Bir

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).
  2. Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High Throughput DNA Extraction96 Well Plate LoadingCross Contamination ReductionPierceable Sealing FilmSample Transfer TechniquePCR Tube PreparationBead Solution AdditionBlank Well ControlMicrobiome Research MethodsDNA Extraction Efficiency

Related Articles