Hematolojik Tanı için Polimer Damlacık Jeneratör Cihazı ile Metilasyona Özgü Multipleks Damlacık PCR

Summary

Epigenetik belirteçler beyaz kan hücresi (WBC) DNA metilasyon desenleri nicelik selektib yoluyla subtyping için kullanılır. Bu protokol, WBC diferansiyel sayımlarının hassas ve çok katlı metilasyona özgü hedef nicelemesine olanak sağlayan damlacık üretimi için termoplastik elastomer (TPE) tabanlı mikroakışkan bir cihaz kullanılarak çok katlı damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (mdPCR) yöntemi ni sunar.

Abstract

Çok katlı damlacık PCR (mdPCR) iş akışı ve epigenetik tabanlı beyaz kan hücresi (WBC) diferansiyel sayımının belirlenmesi için ayrıntılı protokol, termoplastik elastomer (TPE) mikroakışkan damlacık üretim cihazı ile birlikte tanımlanmıştır. Epigenetik belirteçler farklı hastalıklarda önemli prognostik değeri olan WBC subtyping için kullanılır. Bu, genomdaki (CpG loci) belirli CG açısından zengin bölgelerin DNA metilasyon paternlerinin ölçülmesi ile elde edilir. Bu yazıda, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMCs) bisülfit le tedavi DNA' sı, WBC alt popülasyonları ile ilişkili CpG loci'ne özgü astarlar ve hidroliz floresan probları da dahil olmak üzere mdPCR reaktifleri ile damlacıklarda kapsüllenmiştir. Multipleks yaklaşımı, ayrı mdPCR reaksiyonlarına gerek kalmadan birçok CpG loci'nin sorgulanmasını sağlayarak, metilasyon alanlarının epigenetik analizini kullanarak WBC alt popülasyonlarının daha doğru parametrik belirlenmesini sağlar. Bu kesin nicelik farklı uygulamalara genişletilebilir ve klinik tanı ve sonraki prognoz için yararları vurgulamaktadır.

Introduction

Beyaz kan hücreleri (WBCs) bileşiminin analizi hematolojik tanılarda en sık istenen laboratuvar testleri arasındadır. Diferansiyel lökosit sayısı enfeksiyon, inflamasyon, anemi ve lösemi gibi hastalıkların bir spektrum için bir gösterge olarak hizmet vermektedir, ve diğer birçok durum için erken prognostik biyomarker olarak soruşturma altında da. WBC subtyping altın standart immünboyama ve / veya akış sitometri her ikisi de pahalı gerektiren içerir, kararsızlığa eğilimli floresan antikorlar ve genellikle son derece örnek hazırlanmasında operatör yeterlilik bağlıdır. Ayrıca, bu yöntem sadece taze kan örnekleri için geçerlidir, böylece numuneler sevkiyat veya daha sonra....

Protocol

İnsan örneklerini içeren bu çalışmada yapılan tüm deneyler NRC Etik Kurulu tarafından onaylandı ve NRC'nin yürürlükteki araştırma yönergelerine uygun ve Québec, Kanada'daki yasalara uygun insan deneklerini yöneten politikalarına göre yapıldı.

1. Hücre hazırlama

1. Dondurulmuş insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs) hemen 5 dakika için 37 °C'de bir su banyosunda cryovial yerleştirerek çözültün.
2. Hücreleri yavaşça yeniden askıya almak ve 1 mL pipet kullanmak için cryovial'ı iki kez ters çevirin ve 1 mL pipet kullanarak hücre süspansiyonuna 15 mL konik tüpe aktarın.
3. PBMC'leri içeren 15 mL tüpe fetal sığır s....

Results

TPE tabanlı mikroakışkan damlacık jeneratör cihazı Şekil 1'degösterildiği gibi açıklanan protokol kullanılarak üretılmıştır. Fotolitografide silikon (Si) ustası elde etmek için saydamlık maskesi kullanılmıştır. Yumuşak litografi daha sonra epoksi kalıp imal etmek için kullanılan Si master ters BIR PDMS kopyasını elde etmek için yapıldı. Epoksi öncül PDMS üzerine dökülür ve çapraz bağlantı ve sertleşmek için tedavi edildi. Si ustasının tam kopyasını temsil eden bu kalıp, sıcak kabartma kullan.......

Discussion

Sunulan deneysel protokol ve yöntemler, fabrikasyon TPE damlacık jeneratörü, termal çevrimleyici ve floresan mikroskobu kullanarak şirket içi mdPCR'ye olanak sağlar. TPE yapıştırma yumuşak TPE kullanarak fabrikasyon cihaz tüm kanal duvarları boyunca düzgün hidrofobik yüzey özellikleri sağlar, bu nedenle son cihaz bir damlacık jeneratör olarak sonraki kullanım için herhangi bir yüzey işleme gerektirmez. Bu malzeme rutin yüksek iş üretimi⁹,^10,,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Rad, Mississauga, ON	TFI0201	PCR tüpü
RAN Biyoteknolojileri, Beverly, MA	008-FloroYüzey Aktif	Madde Floro-yüzey aktif madde
Silicon Quest International, Santa Clara, CA
Oxford Instruments, Abingdon, Birleşik Krallık		EMCCD kamera
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	22-8425-71
Floresan görüntü analizi		CellProfiler
Nikon, Japonya		10x objektif
Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC), Manassas, VA	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)	p/n 200-U1
Fisher, Kanada
Vitrocom, NJ, ABD	5015 ve 5010	Borosilikat kılcal tüp
(http://definetherain.org.uk/)
Hamamatsu, Japonya	LC-L1V5	DEL UV ışık kaynağı
Dolomit	3200063	Tek kullanımlık akışkan boru
Dolomit	3200302	Tek kullanımlık akışkan boru
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NY		Dik ışık mikroskobu
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schä rding, Avusturya
Zymo Research, Irvine, CA	D5030
Photron, San Diego, CA
IDT, Coralville, IA
Gersteltec, Pully, İsviçre		SU-8 fotorezist
Fineline Görüntüleme, Colorado Springs, CO
Qiagen, Hilden, Almanya
Resim J		Damlacık çapını
Anachemia, Montreal, QC
Excelitas, MA, ABD		Geniş spektrumlu LED floresan lamba
Galenvs Sciences Inc., Montreal,	QC DE1010
Hexpol TPE, Å MÅ l, İsveç		Termoplastik elastomer (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	13-400-518
Nikon, Japonya		Görüntü alımı
3M, St Paul, MN		Taşıyıcı Yağ
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R37605	Mavi floresan canlı hücre boyası (DAPI)
IDEX Sağlık & Bilim, Meşe Limanı, WA	P-881	PEEK bağlantı parçaları
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	806552
Dow Corning, Midland, MI
ThinkyUSA, CA, ABD	ARV 310
Ihc dünyası, Maryland, ABD	IW-125-0
Zinsser NA, Northridge, CA	2607808
Cetoni GmbH, Korbussen, Almanya
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	484431
Bio-Rad, Mississauga, ON	1861096
Hitachi Yüksek Teknolojileri, Mississauga, ON
		Ters mikroskop
Nikon, Japonya
Loctite	AA 352