Larva Zebra Balıklarında İrkilme Tepkisinin Prepulse İnhibisyonunun Ticari Otomatik Sistem ve Yazılım Kullanılarak Farmakolojik Doğrulaması

Özet

Burada, larva zebra balıklarında prepulse inhibisyonu (PPI) testini farmakolojik olarak doğrulamak için ticari olarak mevcut otomatik sistemleri kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Özet

Kemirgenlerde prepuls inhibisyonu (PPI) testini gerçekleştirmek için çok sayıda ticari ve standartlaştırılmış otomatik sistem ve yazılım olmasına rağmen, bildiğimiz kadarıyla, zebra balığında gerçekleştirilen tüm PPI testleri, şimdiye kadar, sadece bireysel gruplar için mevcut olan özel yapım sistemler kullanılarak yapılmıştır. Bu durum, özellikle verilerin tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu konularında zorluklar ortaya çıkarmıştır. Bu çalışmada, larva zebra balıklarında PPI testini farmakolojik olarak doğrulamak için ticari olarak mevcut otomatik sistemleri kullanan bir protokol oluşturduk. Yayınlanan bulgularla tutarlı olarak, apomorfin, haloperidol ve ketamin sonuçlarını, döllenmeden 6 gün sonra zebra balığı larvalarının PPI yanıtı üzerinde çoğaltabildik.

Giriş

Zebra balığı (Danio rerio) larvası, sahip olduğu sayısız avantaj nedeniyle şizofreni gibi psikiyatrik hastalıkların modellenmesi için uygun bir adaydır (Gawel ve ^ark.1 tarafından gözden geçirilmiştir). Bunlar, insan ortologlarına %70 dizi homolojisine sahip tam dizilenmiş bir genomu^{içerir 2}, genomu manipüle etmek ve belirli bir genin gelişime veya hastalığa katkısını belirlemek için ileri ve geri genetik araçların varlığı³ ve zebra balığı beyninde ana insan / kemirgen nörotransmiterlerinin varlığı⁴. Zebra balıklarında kaygı, öğrenme ve hafıza gibi çeşitli nöro-fenotipik alanların mevcudiyeti vardır³. Optik şeffaflık ve nörotropik ilaçların ana sınıflarına duyarlılık, onu farmakolojik manipülasyonlar ve fenotipik ilaç taraması için ideal bir aday haline getirir ^5,6.

Yüksek verimli ilaç taraması yapmak için otomasyon ve sağlam bir endofenotipin varlığı son derece önemlidir⁷. Örneğin, larva zebra balığı davranışını ölçmek için timotaksis, ürkme tepkisi, optokinetik tepki, optomotor tepki, alışkanlık, av yakalama, uyku/uyanıklık davranışı, lokomotor davranış ve diğerleri gibi çeşitli otomatik kayıt teknikleri geliştirilmiştir⁶. Bazı laboratuvarlar bu davranışların bazılarının otomatik ölçümleri ve analizi için özel olarak oluşturulmuş sistemler geliştirirken, ticari olarak temin edilebilen görüntüleme ve yazılım sistemleri vardır^8,9,10,11. Ürkütücü uyarandan kısa bir süre önce zayıf bir ürkütücü olmayan uyaran sunulduğunda irkilme tepkisinin azaldığı bir sensorimotor geçit biçimi olan prepulse inhibisyonu (PPI), hayvan modellerinde şizofreniyi incelemek için bir endofenotip olarak kullanılmıştır (^12,13 tarafından gözden geçirilmiştir). Ek olarak, akustik irkilme tepkisi (ASR) ve PPI, zebra balığı da dahil olmak üzere hayvan modellerinde işitme ve işitsel işlevlerin incelenmesinde yararlı roller oynamıştır^14,15. Larva zebra balığı, prepulse adı verilen daha zayıf bir uyaranla azaltılan beklenmedik bir ürkütücü uyarana yanıt olarak karakteristik bir C-başlangıç gösterir. C-start, uzun zamandır farklı nöral hücre popülasyonları tarafından kontrol edilen bir kaçış davranışı olarak tanımlanmıştır ve larva zebra balığında 15,16,17 kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir.

Kemirgenlerde^PPI testini gerçekleştirmek için çok sayıda ticari ve standartlaştırılmış otomatik sistem ve yazılım vardır ^18,19,20. Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, şimdiye kadar zebra balığında gerçekleştirilen tüm PPI testleri, yalnızca bireysel gruplar için mevcut olan özel yapım sistemler kullanılarak yapılmıştır 15,16,21,22. Bu, standardizasyon ile ilgili olarak veri tekrarlanabilirliği ve tekrarlanabilirliği elde etmek için zorluklar ortaya çıkarmaktadır²³.

Son zamanlarda, zebra balığı topluluğunda bilinen bir satıcı, larva zebra balığı^24'te PPI testini gerçekleştirmek için hızlı bir kamera ve PPI jeneratör eklentileri ile gömülü bir kurulum geliştirdi. Kamera saniyede 1000 kare hızında kayıt yapar, bu da C-start gibi hızlı hareket eden davranışların kaydedilmesini sağlarken, PPI jeneratörü bir irkilme tepkisi uyandırmak için çeşitli akustik uyaranların kullanıcı kontrollü olarak iletilmesine izin verir²⁴. Burada, larva zebra balıklarında PPI yanıt deneylerini gerçekleştirmek için bir protokol oluşturmak üzere, yukarıda bahsedilen sistemi, karmaşık davranışların¹¹ otomatik analizi için tasarlanmış, ticari olarak temin edilebilen kapsamlı bir yazılım paketi ile birleştiriyoruz. PPI yanıtını 1) PPI'da eksikliklere neden olduğu bilinen bir dopamin agonisti olan apomorfin; 2) PPI'yi arttırdığı bilinen bir dopamin antagonisti ve antipsikotik olan haloperidol ve 3) PPI'yi modüle ettiği bilinen bir NMDA reseptör antagonisti olan ketamin.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Norveç Gıda Güvenliği Kurumu Deney Hayvanları İdaresi'nin denetim ve uygulama sistemi (FOTS-18/106800-1) tarafından onaylanmıştır.

1. Zebra balığı yetiştiriciliği

1. Yabani tip yetişkin erkek ve dişi zebra balığı (Danio rerio) stoklarının çiftleşmesini sağlayın,²⁵ akşam önce standart koşullar altında bakımı yapın. Burada Tupfel uzun yüzgeçli (TL) suşu kullanılır.
2. Ertesi sabah engelleri kaldırın ve doğal yumurtlama yoluyla çiftleşmeye izin verin.
3. Çiftleşme tanklarından yumurtaları toplayın.
4. Döllenmemiş yumurtaları ve diğer kalıntıları çıkarın, daha sonra yumurtaları petri kaplarına (n = 60) aktarın ve embriyo ortamında 28 ° C'de bir inkübatörde yükseltin: 1.5 mM HEPES, pH 7.6, 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgSO4 ve 0.18 mM Ca(NO3)₂.
5. Embriyo ortamının yarısını yenileyin ve ölü larvaları 6 dpf'ye kadar günlük olarak çıkarın.
   NOT: Tüm deneyler döllenmeden 6 gün sonra (dpf) bireysel larvalar üzerinde gerçekleştirilmiştir.

2. Farmakolojik ajanlar ve larvaların ön tedavisi

1. Apomorfin ve ketamini sırasıyla 500 μM ve 10 mM stok çözeltileri yapmak için E3 ortamında çözün.
2. 10 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için haloperidolü %100 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün. Kullanılan DMSO'nun nihai konsantrasyonu% 0.1 idi.
3. Araç kontrolleri olarak %0,1 DMSO ve E3 ortamı kullanın.
4. Aşağıdaki son ilaç konsantrasyonlarını kullanın: 10 mg / mL apomorfin, 1 mM ketamin ve 20 μM haloperidol¹⁶.
5. Apomorfin ve ketamin gruplarını, larvaları 10 dakika ve haloperidol ve DMSO araç kontrol gruplarını 20 dakika^{boyunca önceden maruz bırakın 16}.

3. Davranış testinden önce kurulum

1. Deney günü larvaları ve ilgili tüm malzemeleri deney odasına aktarın. Deney odasını 27 ± 1 °C sıcaklığa ayarlayın.
2. Test odasındaki arka plan gürültüsünün mümkün olduğunca düşük olduğundan, tercihen 45 dB ses basıncı seviyesinden (SPL) fazla olmadığından emin olun.
   1. Desibel (dB) ölçerin sonometre mikrofonunu test odasına takın (kurulum açıklığı üretici tarafından zaten sıkılmıştır).
   2. Odadaki arka plan gürültüsünü azaltmak için, test odasını özel yapım bir ses kabini ile yalıtın (kuruluma genel bakış için Şekil 1B'ye bakın).
3. Prepulse inhibisyon testi için 96 oyuklu bir plaka hazırlayın.
   NOT: Video kamera 2048 × 500 piksel çözünürlüğe sahiptir, yani bir seferde yalnızca en fazla 3 şerit (33 kuyu) görüntülenebilir.
   1. Gölgelerden kaynaklanan paraziti azaltmak için 96 oyuklu formatta özel yapım bir akrilik plaka kullanın.
      NOT: Özel plaka için ölçümler aşağıdaki web sitesinde bulunabilir: https://zenodo.org/record/3739378#.XooyLW5uKas
4. Bir transfer pipeti yardımıyla, her bir kuyucuğa bir larva ile 310 μL maruz kalma çözeltisi / ortamı aktarın.
5. Stereo amplifikatörün ses düğmesini ve bir desibel ölçeri kullanarak uyaran yoğunluğunu kalibre edin ve ölçün.
6. "Seviye referansı" bölümünde maksimum ses yoğunluğunu kaydedin.

4. Uyaran parametreleri ve video alımı

1. Bilgisayarı, amplifikatör sistemini ve dB metreyi açın (kuruluma genel bakış için Şekil 1A'ya bakın).
2. Ses yoğunluğunu ayarlamak için ses düğmesini minimuma veya maksimuma çevirerek kullanın.
   1. Her seferinde dB metre ile ses seviyesini kontrol edin, ses düğmesi ayarlanır. Bu, kurulum tarafından üretilebilecek maksimum ve minimum ses yoğunluğunu bulmak için önemlidir.
      NOT: dB ölçer, uyaran için RMS dB çıkışını hesaplar. Sistem, sesi test odasının katı bileşenlerinin içinde üretir ve tüm plaka desteğinin yatay düzleminde bir titreşim üretirken plakayı sağlam tutar.
      1. Ses düğmesini maksimuma ayarlayın, dB metre ile ses yoğunluğunu ölçün ve bu değeri kullanın.
3. PPI üretecinin arayüzünde parametreleri tanımlayın: Gecikme olarak temsil edilen uyaranlar arası aralık; Edinme delta süresi olarak temsil edilen denemeler arası aralık; ön itme süresi vb.
   1. Tek başına prepulse denemeleri için, Startle parametreleri için "Genlik" veya Uyaran Süresinin sıfır olarak ayarlandığından emin olun ve tek başına irkilme denemeleri için bunun tersi de geçerlidir.
4. Deneme sürümü listesi oluşturmak için Ekle'yi seçin > denemeye bir ad verin. Örneğin, "Tek başına 50 dB ön darbe".
   NOT: İstenildiği kadar çok deneme oluşturulabilir, ancak programın çökmesine neden olabileceğinden listenin ne kadar uzun olduğuna dikkat edin.
   1. Sözde rastgele bir düzen kullanılarak tüm PPI deneylerinde tek başına darbe denemeleri ile darbe öncesi denemeleri birleştirin. Bir deneyde birden fazla uyaranın sunulduğu durumlarda, 30 s'lik bir denemeler arası aralık (ITI) kullanılır.
      NOT: Bu çalışmada 660 Hz'lik 100 ms'lik irkilme uyaranı (nabız) ve 440 Hz'lik 5 ms'lik prepuls uyaranları kullanılmıştır. PPI deneyleri için, uyaranlar arası aralık (ISI) 100 ms idi.
5. Protokolü kaydetmek için Dosya > Farklı kaydet'i seçin.
6. Test odasındaki aydınlatma koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın.
   1. USB ölçüm hesaplamasını başlatın, analog çıkışı seçin ve ardından aydınlatmada değişiklik yapmak için D/A OUT O'ya (P13) gidin. Sıfır değeri ışık olmadığı anlamına gelirken, D/A OUT O değeri arttıkça kutu içindeki ışığın yoğunluğu artar. Tüm deneyler için 100 ışık yoğunluğu kullanılmıştır.
7. Kamerayı kurun
   1. Yazılımı başlatın ve kameranın yüklenmesini bekleyin.
   2. Ayarlamalar'ı seçin (sağ tarafta bulunur) ve alım kare hızını 1.000 olarak ayarlayın, ardından değişikliği gerçekleştirmek için uygula'ya tıklayın.
8. Deneylere başlamadan önce larvaları 5 dakika boyunca %100 ışıkla aydınlatılan bir test odasına alıştırın.
9. Bir denemeye başlamak için, PPI oluşturucudaki Deney menüsünü seçin, Çalıştır'a tıklayın ve kuyu seçme biçimini (örneğin, 33 kuyu) tıklayın.
   1. Bir deney çalıştırmadan önce her zaman kamera yazılımının doğru ayarlarla başlatıldığından emin olun.
   2. Her deneme için 2 sn'lik bir video edinin.
   3. Alım kare hızının 1.000 olarak ayarlandığından emin olun.

5. Akustik irkilme tepkisi ve ÜFE'nin otomatik olarak izlenmesi ve analizi

1. Protokol kurulumu.
   1. Analiz yazılımını başlatın ( Malzeme Tablosuna bakın). Şablondan Yeni'yi seçin > Önceden tanımlanmış bir şablon uygulayın ve ardından diğer menülere geçin (ayrıntılar aşağıdadır).
      1. Video Kaynağı altındaki video dosyasından seçim yapın.
      2. Video dosyasına göz atın. Konuyu balık > zebra balığı larvaları > bölgesi şablonu (şablon yok) olarak ayarlayın. Arenalar altında Arena sayısı'nı belirtin.
      3. Konular altında Arena başına konu sayısını (1 olarak ayarlayın) belirtin.
      4. İzlenen Özellikler altında Merkez noktası, burun noktası ve kuyruk tabanı algılama'yı seçin (bkz. Şekil 2A,B).
         NOT: Bu, C-start yanıtının vücut açısını hesaplamak için önemlidir (bkz. Şekil 2C).
      5. Farklı kaydetmek > Ad seçeneğine tıklayın. Kullanılan birimler sırasıyla mesafe, zaman ve dönüş için mm, s, derecedir.
         NOT: Teraziyi kalibre etmek için aynı üniteyi kullanmayı unutmayın.
   2. Arena ayarını seçin.
      1. Arka plan resmini yakala'ya tıklayın.
      2. Sağdaki menüdeki adımları izleyin (şüpheniz varsa, Yardım menüsünü kullanın).
      3. Arenaları çizmek için daire çizim aracını seçin.
   3. Yeni > adı oluşturmak > Deneme kontrol ayarları'nı seçin.
   4. Algılama ayarları'nı seçin, sağdaki menüdeki adımları izleyin.
      1. Örnekleme hızını 25 olarak ayarlayın. Gelişmiş algılama ayarlarını seçin. Yöntem'in altında dinamik çıkarma, gelişmiş model/yetişkin balık'ı seçin, ardından Arka plana kıyasla konu rengi'ni Daha Koyu olarak ayarlayın ve larvanın kontrastını tanımlamak için kaydırıcıyı hareket ettirin.
      2. Konu konturu altında, önce aşındırmayı seçin, ardından genişletin ve hayvan tamamen algılanana kadar kontur erozyonu ve genişleme değerlerini artırın.
   5. Protokolü kaydedin ve elde edilen PPI videolarının sonraki analizleri için kullanın.
2. Deneme listesi kurulumu.
   1. Deneme listesini seçin, larva kimliği, tedavi, uyaran türü vb. gibi bağımsız değişkenleri tanımlayın. Videoların yolunu seçin ve toplu alım için bir deneme listesi tanımlayın.
3. Edinme kurulumu.
   NOT: Bir deneme listesi oluşturulmuşsa, videoların toplu alımı gerçekleştirilebilir.
   1. Bazı parçalar kaybolursa, izlenen özellikleri ayarlamak için parça düzenleyiciyi kullanın.
   2. İzleme düzenleyicisini kullandıktan sonra çözümlenmeden kalan izleme hatalarını analizden hariç tutun.
   3. Verilerden kaynaklanan paraziti azaltmak için iz yumuşatma profilini 1 mm'ye ayarlayın. Bu, larvaların arka plan aktivitesine göre ayarlanabilir.
4. Analiz kurulumu.
   1. Analiz edilecek denemeleri seçmek için Veri profilleri'ni seçin ve ilgilenilen bağımsız değişkene göre izleri tanımlayın.
      NOT: Bileşenler gizliyse, görüntülemek için sağ üst köşedeki göz sembolüne tıklayın.
      1. Analiz edilecek denemelerin bölümlerini filtreleyin (örneğin, tedaviye veya uyaran grubunun türüne göre).
      2. Analiz edilecek parçaların bir kısmını seçin (iç içe geçme). Bu çalışma için, uyaranın başlangıcı ile uyaranın başlamasından 100 ms sonraki süre arasındaki izler için veriler iç içe yerleştirildi.
      3. Talimatı tamamlamak için tüm filtreleri ve yuvalama kutularını ok çizgileriyle bağlamayı unutmayın.
   2. Analiz edilecek bağımlı değişkenleri tanımlayın, Analiz profillerini seçin ve ilgilenilen değişkenleri belirtin (bağımlı değişkenler altında Gövde'ye odaklanın).
      NOT: Bileşenler gizliyse, görüntülemek için sağ üst köşedeki göz sembolüne tıklayın.
      1. Çift tıklama Gövde açısı. Mutlak virajı seçin. Deneme ayarlarını gözden geçirin ve maksimumu seçin, ardından ekle'ye tıklayın.
   3. Gövde açısı durumunu çift tıklayın. Ortalama aralığını 5 örnek olarak ayarlayın. Bükülme açısı eşiğini ayarlayın. Bükülmüş istatistiklerini hesaplamak için Deneme istatistiklerini gözden geçirin ve ilk olarak eklemek > için gecikme süresini seçin. Değişen eşikler elde edilene kadar (20-80° arasında) adımları tekrarlayın ve buna göre adlandırın.
   4. İstatistik ve çizelge oluşturma.
      1. Analiz > sonuçları > istatistikler ve grafikler'i seçin, ardından hesapla'yı tıklayın.
      2. Her bölümün altında birkaç şablon oluşturulabileceğinden, veri ve analiz profillerinin doğru şablona ayarlandığından emin olun.
   5. Deneme ve grup istatistiklerini işleme ve analiz için elektronik tablo dosyaları olarak dışa aktarın.

6. Veri analizi

1. Deneme istatistiklerini içeren elektronik tablo dosyasını açın.
2. Gövde açısı Maksimum derece, Bükülmüş gecikme süresi (çeşitli gövde açısı eşiklerinden) sütunlarını seçin.
3. Uyaran başlangıcından sonra 30 ms'lik bir kesme gecikmesi içinde vücut açısındaki her değişikliği 50°'≥ pozitif bir C-başlangıç yanıtı (yani bir yanıtlayıcı) olarak düşünün; 30°'lik < vücut açısına sahip olanlar yanıt vermeyenlerdir.
4. İkili bir şekilde, her plaka için yanıt veren bir larvaya 1 ve yanıt vermeyen larvalara 0 atayın.
   1. Her plaka için toplam yanıtlayıcı ve yanıtlayıcı olmayan larva sayısını sayın. (Yanıt veren larva sayısı / toplam larva sayısı) × 100 olarak hesaplanan her durumda yanıtlayıcıları (%) hesaplayın. İrkilme uyaranına %30'dan daha az yanıt veren larvaları analizden çıkarın¹⁶.
      NOT: Larvaların %70'ine eşit veya daha fazla bir C-başlangıç yanıtı ortaya çıkarabilen herhangi bir uyaran yoğunluğu, uygun bir irkilme uyaranı¹⁶ olarak kabul edilir.
5. %ÜFE'yi 100 × olarak hesaplayın (irkilme uyaranına yanıt verme yüzdesi - ön darbeye yanıt verme yüzdesi + irkilme dizisi)/ (irkilme uyaranına yanıt verme yüzdesi)¹⁶.

7. İstatistiksel analiz

1. Verileri ortalama ± standart sapma, S.D. olarak sunun (istatistiksel yazılım için Malzeme Tablosuna bakın).
2. Tek yönlü ANOVA ve ardından bir Tukey'in post-hoc testi kullanarak değişen prepuls yoğunluklarının larva tepkisi üzerindeki etkilerini belirleyin.
3. İlaç tedavisinin değişen prepuls yoğunluklarında % PPI yanıtı üzerindeki etkilerini belirlemek için iki yönlü ANOVA ve ardından Holm-Sidak'ın post-hoc testini kullanın.

Sonuçlar

Larva zebra balığında akustik irkilme tepkisinin darbe öncesi inhibisyonunu analiz etmek için birden fazla sistemi birleştirme protokolünü doğrulamak için üç deney yapıldı. İlk olarak, akustik uyaranları doğru bir şekilde iletme ve larvaların irkilme uyaranına tepkisini yakalama yeteneği test edildi. Daha sonra, bir ön darbe uyaranı sunulduğunda irkilme tepkisini hafifletme yeteneğini doğrulamaktı. Son olarak, apomorfin, haloperidol ve ketamin ilaçları tarafından irkilme yanıtının prepulse inhibisyonunun farmakolojik modülasyonunu tespit etme yeteneği kurulmuştur.

Larva zebra balığı akustik ürkütücü uyaranlara tepki
Önceki çalışmalar, larva zebra balıklarının ürkütücü akustik uyaran¹⁶ ile sunulduğunda karakteristik bir C-başlangıç sergilediğini göstermiştir. Larvaların davranışlarını ürkütücü uyaranlara teşvik etme ve yakalama yeteneği test edildi. Kaydedilen larvaların C-start yanıtı gösterdiği gözlenmiştir (Şekil 2). 70 dB re'lik bir uyaran (100 ms, 660 Hz, Ek Şekil 1A), larvaların %≥70'inde yanıt ortaya çıkaracak kadar güçlüydü (Şekil 3A). 30 s'lik bir denemeler arası aralıkta 30 kez tekrar tekrar sunulduğunda, 70 dB yeniden uyaran, Şekil 3B'de gösterildiği gibi larva alışkanlığı (N = 3 tekrar; 16 larva/replika) ile sonuçlanmadı.

Prepulse, larva zebra balığının akustik uyaranlara verdiği irkilme tepkisini azaltır
Çok sayıda kanıt, prepulse uyaranların bir irkilme uyaranına^larva tepkisini modüle ettiğini göstermektedir 15,21,22,26. İki darbeli bir paradigma kullanıldı, burada ön darbe adı verilen zayıf bir uyaran, nabız adı verilen ürkütücü uyarandan önce geldi. Kullanılan ön darbe uyaranları, 70 dB re'ye ayarlanan nabız uyaranından 20, 17 veya 14 dB daha azdı. Ön darbe (5 ms, 440 Hz) her zaman darbe başlangıcından 100 ms önce sunuldu (Ek Şekil 1B). Test edilen her prepulse uyaranı, nabız larva yanıtını önemli ölçüde azalttı. Şekil 4'te E3 ortamında 6 dpf TL için larva yanıtı (% olarak) akustik irkilme uyaranlarına (% olarak) gösterilmiştir, N = 6 (16 larva/grup). İrkilme uyaranına (nabız) yanıt veren larva yüzdesi 79.86 ± 9.772 idi. Beklendiği gibi, irkilme uyaranından önce 50, 53 veya 56 dB'lik bir ön darbe geldiğinde, larva yanıtı sırasıyla% 40.87'±% 11.30'a,% 39.58'±% 7.345'e ve% 29.17'±% 9.350'ye düşmüştür. Tek yönlü Anova analizi, larvalar üzerindeki uyaran etkisinde istatistiksel bir fark ortaya koydu (F (3, 48) = 57.23, P <

Tartışma

Nörodavranışsal araştırmalar için protokolleri geliştirmek ve iyileştirmek amacıyla herhangi bir yeni davranışsal tahlil sistemini doğrulamak esastır. Mevcut araştırmada, ticari olarak temin edilebilen iki sistem ve yazılımın, zebra balığı larvalarında akustik bir irkilme tepkisi oluşturma ve bu tür davranışların daha önce açıklanan farmakolojik modülasyonunu tespit etme ve ölçme yeteneği değerlendirildi.

Kurulumu optimize etmek için bir dizi değişiklik ve sorun giderme gerçekleştirildi. C-start yanıtlarının analizi için varsayılan yazılım, her deney için veriler elde edildikten sonra analizin otomatik olarak devam edeceği şekildeydi (22 deneme/plaka bir deney oluşturdu). Bu, günde çalıştırılabilecek kalıp sayısını azalttı, böylece verimi azalttı (günde 5 plaka). Bu sınırlamayı önlemek için, analiz yazılımını veri toplama sürecinden ayırmaya ihtiyaç vardı ve bu da verimi günde ortalama 10 plakaya çıkardı. Bu nedenle, canlı olmayan analiz için bağımsız bir analiz yazılımına başvurma kararının başarılı ve daha verimli olduğu kanıtlandı. Verilere gürültü çıkaran gölgelerden veya diğer kalıntılardan kaynaklanan paraziti önlemek için, kuyuların tamamen ortamla doldurulması, tüm kabarcıkların çıkarılması ve larvalarla karıştırılabilecek yiyecek parçacıklarından veya benzerlerinden kaçınılması ve böylece verilerde gürültü oluşması önerilir. Ses uyaranlarının kalibrasyonundan sonra, dB metre tarafından yakalanan amplifikatör sistemi tarafından ulaşılabilen maksimum yoğunluk 85 dB re iken, test odasındaki ilk arka plan gürültüsü 60 dB re idi. Bu, çalıştırılacak dar bir dB penceresi ile sonuçlandı. Bu nedenle, arka plan gürültüsünü mümkün olduğunca az tutmak çok önemliydi. Bunu başarmak için, test odasının etrafına ek bir yalıtım katmanı ve bir vokal kabini demeti kullanılarak ekstra bir yalıtım katmanı oluşturmak için parafon akustik malzemesi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılmıştır (bkz. Malzeme Tablosu). Bu yalıtım katmanlarıyla, test odasının içindeki arka plan gürültüsü, başlangıçtaki 60 dB'den 45 dB'ye başarıyla düşürüldü.

Şu anda, bu kurulumun bir avantajı, tüm bileşenlerin ticari olarak mevcut olması ve bu nedenle yalnızca birkaç laboratuvarla sınırlı olmamasıdır. Protokolün anlaşılması ve takip edilmesi oldukça kolay olduğu için kodlama dilinde sınırlı bilgiye sahip kişiler kullanabilir. Örneğin, PPI sistemini kullanarak, değişen uyaranlar arası ve denemeler arası aralıklarla darbeler ve ön darbeler vermek ve bu tür uyaranlara larva tepkilerini yakalamak mümkün oldu. Bu davranışlar yakalandıktan sonra, analiz yazılımı kullanılarak yanıt verenler ve yanıt vermeyenler olarak sınıflandırılabilirler. Yanıtlayıcı grup, <50 ms'lik bir gecikme süresinde 30° veya daha fazla C-başlangıcı gösteren larvalar olarak kategorize edildi. Ek olarak, PPI yanıtı, dopaminerjik ve glutamaterjik sinyalleri hedef alan ilaçlar tarafından modüle edilir (Geyer ve meslektaşları tarafından gözden geçirilmiştir²⁷). Önceki çalışmalarla tutarlı olarak, seçici olmayan bir dopamin reseptörü agonisti olan apomorfin, larva zebra balıklarında irkilme tepkisinin nabız öncesi inhibisyonunu azaltırken, bir dopamin antagonisti olan haloperidol yanıtı arttırdı. Larva zebra balığında, ketaminin ISI^16'nın süresine bağlı olarak PPI'yi farklı şekilde modüle ettiği gösterilmiştir. Yukarıda bahsedilen çalışmada, larva PPI 30 ms'de arttırılmış, ancak ketamin ile ön işleme tabi tutulduğunda 500 ms ISI'de baskılanmıştır. Bu çalışma değişken ISI kullanmamış olsa da, ketaminin 100 ms'lik bir ISI'de ÜFE'yi arttırdığı gözlemi, 30 ms'lik bir ISI kullanıldığında önceki çalışmanın verileriyle karşılaştırılabilir hale getirir. Çalışma, ticari olarak mevcut bu sistemleri birleştirerek, PPI testini gerçekleştirmenin ve zebra balığı larva PPI yanıtında farmakolojik olarak indüklenen değişiklikleri güvenilir bir şekilde tespit etmenin mümkün olduğunu göstermiştir. Sistemin bir sınırlaması, analiz yazılımı tarafından izlenen burun noktası özelliğinin her zaman larvaların gözlerinden birine düşmesi ve böylece bir temel açı oluşturmasıdır. Bunun üstesinden gelmek için, bu çalışmada kullanılan larvalar için ~ 30 ° olarak bulunan uyarılmamış larvaların temel bükülme açısını her zaman belirlemek gerekir. Böylece, ürkmüş larvalarda pozitif bir C-başlangıç yanıtı olarak kabul edilen eşik olarak 30° seçiminin temelini oluşturur. Bu noktalar dikkate alınırsa, PPI testini kurulum ekipmanına erişimi olan herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirmek mümkün olmalıdır. Bu makale, gecikme değişkenliğinin kapsamı nedeniyle, irkilme tepkisinin kinematiğini, daha önce¹⁶ bildirildiği gibi kısa gecikme süresi ve uzun gecikme süresi olarak kategorize etmeye odaklanmamıştır. Bu nedenle, uyaran başlangıcından <50 ms sonra sadece C-başlangıç yanıtları kullanılmıştır¹⁵.

Gerinim farklılıklarının çeşitli tahlillerde zebra balığı davranışını etkilediği^{bildirilmiştir 28,29,30,31} ve ayrıca işitme hassasiyetini³² etkiler. Bu nedenle, test edilen her bir gerinimin temel bükülme açısının belirlenmesi önemlidir. İşitme hassasiyetleri de farklı olabileceğinden, temel irkilme tepkilerini, her bir zorlanma için ön darbe veya irkilme uyarıcısı olarak en uygun ses yoğunluğunu ve uyaranın ne kadar süreyle sunulduğunu belirlemek çok önemlidir. ISI, dikkatli bir şekilde düşünülmesi gereken başka bir parametredir, çünkü bazı ilaçlar, prepulse ve irkilme uyaran başlangıcı arasındaki aralığa bağlı olarak PPI'yı artırabilir veya azaltabilir¹⁶. Beklenti, bilişsel işlev, nöropsikiyatrik bozukluklar ve işitme (işitsel işlev) ile ilgilenen laboratuvarların, bu PPI kurulumunu ve protokolünü farmakolojik ve/veya genetik modellerini taramada yararlı bulmasıdır. Bu protokol aynı zamanda bileşik kitaplıkların yüksek verimli taraması için bir temel sağlar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Apomorfin	Sigma Aldrich	A4393	Dopamin agonisti
dB metre	PCE cihazları	PCE-MSM 4	Uyaran yoğunluğunu ölçmek için
DMSO	Sigma Aldrich	D8418	Organik çözünen maddeleri çözmek için
Dynavox Amplifikatör	Dynavox	CS-PA1 MK	Akustik uyaranları iletmek için
EthoVision XT	Noldus, Hollanda	EthoVision XT, sürüm 14	Otomatik izleme yazılımı
GraphPad Prism	GraphPad Yazılımı	Sürüm 8	İstatistiksel analiz yazılımı
Haloperidol	Sigma Aldrich	H1512	Dopamin antagonisti
Ketamin	Sigma Aldrich	Y0000450	NMDA reseptör antagonisti
parofon akustik malzemeleri	Paroc	8528308	Test kabinindeki arka plan gürültüsünü azaltmaya yardımcı olur
t.akustik Vokal Kabini Paketi	Thormann, Almanya	458543	Test kabinindeki arka plan gürültüsünü azaltmaya yardımcı olur
PPI eklentilerine sahip ZebraBox Revo	ViewPoint, Fransa	PPI eklentilerine sahip ZebraBox Revo	Donanım ve yazılım içerir