Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Çeşitli Sığır Beyin Yapılarında Kuduz Virüsünün Nicelliği

3.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61429

⸱

22 Mayıs 2021

 ,  ,  , 
1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA), INIFAP, 2Campus Toluca, Universidad del Valle de México, 3Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro

Bu makalede

Özet

Bu protokol, in vitro transkripsiyon kullanarak çeşitli sığır beyin anatomik yapıları içindeki kuduz virüsü nükleoprotein (N) gen kopya numarasını belirlemek için qRT-PCR tabanlı bir yaklaşım sunar.

Özet

Sığır paralitik kuduz (BPR), büyük bir zoonotik risk oluşturduğu Latin Amerika'da önemli ekonomik öneme sahip bir viral ensefalit şeklidir. Burada amacımız, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanarak farklı sığır beyin anatomik yapılarında kuduz virüsü (RABV) genomunun bağıl kopya numarasını belirlemek için bir laboratuvar protokolü kullanmaktı. qRT-PCR, bir numunede bulunan belirli gen kopyalarının sayısını, örnekte bulunan hedef nükleik asit miktarıyla doğru orantılı olan amplifikasyondan sonra yayılan floresan bazlı olarak ölçendir. Bu yöntem, kısa süresi, kontaminasyon riskinin azalması ve farklı numunelerdeki viral nükleik asitleri diğer tekniklere göre daha kolay tespit etme potansiyeli nedeniyle avantajlıdır. Altı kuduz hayvanın beyni altı anatomik yapıya, yani Ammon boynuzu, beyincik, korteks, medulla, pons ve talamusa ayrılmıştır. Doğrudan immünoresans testinde tüm beyinlerin RABV antijenleri için pozitif olduğu belirlendi. Dört RABV negatif sığırın beyninden elde edilen anatomik yapıların aynısı da değerlendirildi. RNA her yapıdan çıkarılmış ve qRT-PCR için kullanılmıştır. RABV genlerinin kopya numaralarını belirlemek için in vitro transkript edilmiş nükleoprotein geni kullanılarak bir test yapıldı. Viral RNA'yı ölçmek için kullanılan standart eğri% 100 verimlilik ve 0.99 doğrusallık gösterdi. Analizler, korteks, medulla ve talamusun, bu yapıların en yüksek RABV seviyelerine sahip olduğu gözlemine dayanarak, RABV tespitinde kullanılmak üzere ideal CNS bölümleri olduğunu ortaya koydu. Test özgüllüğü %100 idi. Tüm örnekler pozitif çıktı, yanlış pozitif tespit olmadı. Bu yöntem BPR tanısı sırasında düşük düzeyde RABV içeren örneklerde RABV'yi tespit etmek için kullanılabilir.

Giriş

Kuduz, beyin, cilt, idrar veya tükürükteki viral nükleik asitlerin tespitini sağlayan çeşitli tekniklerle ante-mortem ve post-mortem olarak doğrulanabilir1. Kuduz virüsü nükleoprotein(N)geninin tespiti öncelikle moleküler testlerle kuduz tanısı için kullanılır. Bu gen viral genotipleme için de kullanılır. Kuduz, etkilenen beynin herhangi bir bölümünü kullanarak hayvanlarda teşhis edilebilir; bununla birlikte, kuduz olasılığını dışlamak için, beyindeki en az iki bölgeden doku test edilmelidir2. Hayvanlarda kuduz tespiti için çeşitli tanı yöntemleri mevcuttur; bununla birlikte, doğrudan immünofluoresans testi standart referans tekniği olmaya devam etmektedir3. Diğer testler arasında fare aşılama, doku kültüründe enfeksiyon ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)4içeren biyolojik testler yer almaktadır. Tüm bu teknikler, insanlarda ve hayvanlarda kuduz tanısı için Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ve Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü (OIE) tarafından önerilmektedir, sırasıyla5.

Nükleik asit tespiti ve amplifikasyon teknikleri son yıllarda kuduz tanısında devrim sağlamıştır6 ve bu teknikler insan kuduzunun ante mortem tanısında önemli rol oynamaktadır. Ante-mortem ve post-mortem kuduz tanıları7,8,9,10için konvansiyonel testleri tamamlamak için çeşitli PCR tabanlı testler değerlendirilmiştir. Çoğu tahlil, viral genom 1,11'deen çok korunan bölge olan amplifikasyon için kuduz viral nükleoprotein genini hedefalmaktadır. Son 20 yılda RABV tanısı koymak için çeşitli moleküler tahliller geliştirilmiş ve bu testlerden bazıları virüs karakterizasyonu için kullanılmıştır. Çoğu çalışma, viral genomdaki korunmuş genleri tespit etmeyi amaçlamıştır, en yaygın olarak geleneksel veya nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) tahlillerikullanılarak 12,13.

PCR, bu dokular ayrıştığında bile dokular içindeki belirli bir patojenin genomlarını tespit edebilen son derece hassas bir tanı tekniğidir. PCR tabanlı yaklaşımlar kullanılarak, bir DNA nükleotid dizisinin seçici ve tekrarlayan amplifikasyonu yoluyla klinik bir örnekte minimum miktarda enfeksiyöz ajan tespit edilebilir14. floresan probları (örneğin, TaqMan) veya DNA bağlayıcı boyaları (örneğin, SYBR Green) içeren qRT-PCR, RABV'yi hem antehem de post- mortem'i yüksek hassasiyetle teşhis etmek için çalışmalarda kullanılmıştır; ancak, böyle bir yaklaşım özel ekipman gerektirir. Bu sınırlamayı aşmak için, RABV'nin tespiti için düşük maliyetine, basitliğine ve arzu edilen özelliklerine dayanarak ters transkripsiyon döngüsü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) önerilmiştir. Bu tahlil özellikle gelişmekte olan ülkelerde kullanılabileceği için önemlidir15.

qRT-PCR, floresan sinyal artışlarının tek bir reaksiyondaki PCR ürün miktarıyla doğru orantılı olduğu bir molekülün tespitine ve nicelleştirilmesine dayanır. Nükleik asit hedefinin kopyalarının sayısı arttıkça floresan da artar. SYBR Green DNA bağlayıcı boya veya florofor ve quencher taşıyan sıraya özgü oligonükleotid problar gibi spesifik olmayan interkaling boyalar genellikle qRT-PCR'deki floresan okumayı sağlamak için kullanılır. Bu tahlil, daha kısa bir test süresi (2-4 saat), kapalı tüp sistemi nedeniyle kontaminasyon riskinin azalması (güçlendirilmiş ürünlerin PCR sonrası manipülasyon eksikliği) ve aynı anda farklı hedefleri tespit etme yeteneğini içeren geleneksel RT-PCR'ye göre avantajlar sunar16. qRT-PCR, tükürük ve diğer örneklerden kuduz ante-mortem tanısı koymak için kullanılabilir. Bu test, farklı Lyssavirus türlerinin veya RABV15soylarının tespiti için evrensel bir gerçek zamanlı test olarak da kullanılabilir. Bu kombo RT-PCR yaklaşımında iki reaksiyon kullanılır. Birincisi RABV'nin farklı genetik linajlarını, ikincisi ise Lyssavirus türlerini tespit eder. Her iki adım da qRT-PCR tahlillerini içerir, burada ilki hibridizasyon probları kullanır ve ikincisi boyalarkullanır 15. Bu tekniği kullanarak RABV'nin başarılı bir şekilde moleküler olarak tespit edildiğini gösteren çok sayıda test sayesinde, mevcut OIE Karasal El Kitabı (2018), RABV17'ninmoleküler tespiti için PCR kullanılmasını önermektedir.

Meksika önemli hayvancılık potansiyeline sahip bir ülkedir. Hayvancılık üretiminin en yüksek olduğu eyaletler, kuduzun ana vericisi olan vampir yarasa Desmodus rotundus'un varlığı nedeniyle kuduz salgınları için risk altında olan hem nemli tropikal bölgeleri hem de kuru bölgeleri içerir. Bu nedenle, México'da sığır paralitik kuduzunun (BPR) önlenmesi ve kontrolü için daha fazla araç geliştirmek önemlidir. Buna dayanarak, bu çalışmanın amacı kuduz enfeksiyonuna bağlı ölümü takiben sığır beyinlerinin farklı anatomik yapılarındaki viral parçacıkların sayısını belirlemek için nicel qRT-PCR kullanmaktı.

RABV pozitif sığırlardan elde edilen altı beyin, aşağıda açıklanan qRT-PCR protokolünün geliştirilmesinde kullanılmak üzere harici bir laboratuvar tarafından bağışlanmıştır. Sığır beyin yapısı örnekleri inifap CENID-MA laboratuvarı BSL-2 tesisine soğuk zincirle taşınmış ve kullanıma kadar -80 °C'de saklanmıştır. Beyinler Campeche, Yucatán ve Querétaro eyaletlerindeki hayvanlardan elde edildi. Makbuzdan önce, beyinlerden çeşitli yapılar parçalandı. Bu yapılar Ammon boynuzu, serebellum, korteks, medulla, pons ve talamus18,19'uiçeriyordu. Genetik materyal aşağıda açıklandığı gibi çıkarılmıştır. RABV tanısı doğrudan floresan antikorlar (DFA) kullanılarak doğrulandı20. Pozitif kontrol olarak RABV21 ile aşılanmış fare beyinleri kullanılmıştır. Ayrıca, dört RABV negatif sığır beyni (DFA tarafından belirlendiği gibi) negatif kontrol olarak kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından sağlanan hayvanların kullanımına yönelik tavsiyeler doğrultusunda onaylanmış ve yürütülmüştür.

1. Örnekler

  1. RT-PCR analizi için beynin 6 farklı kuduz pozitif sığır beyninden parçalanmış farklı bölgelerini kullanın.

2. Kuduzu doğrulamak için doğrudan floresan antikorlar (DFAs)

NOT: Kuduz antijeninin DFA tarafından tespit edilmesi, floresan etiketli antikorlar kullanılarak kuduz nükleoproteinin varlığını belirlemek için nitel bir yöntemdir. Test, aşağıda açıklandığı gibi Dean ve ark. (1966)20tarafından sağlanan protokol kullanılarak gerçekleştirildi.

  1. Yaklaşık 15 mm çapında steril bir slayt üzerinde farklı beyin yapılarından parçalanmış her dokudan iki izlenim bırakın. Dokunun yaklaşık 3mm 3 kısmını steril kaydırağa sürmek için ahşap bir aplikatör kullanın. Lekeyi oluşturmak için, ahşap aplikatörü slayta hafifçe bastırın.
  2. Slaytları -20 °C'de 1 saat boyunca %100 aseton olarak batırarak örnek leke slaytlarını sabitleyin. Kuluçkadan sonra, slaytları 21 °C'de kuru bir bez üzerinde 30 dakika kurutun.
  3. Bir şırıngamdan dağıtarak her beyin smear'ına 1:10 seyreltmede floresan etiketli anti-nükleoprotein antikorunun 50 μL'sini ekleyin.
  4. Slaytları konjuge ile 37 °C'de nemli bir odada 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
  5. Kuluçkadan sonra, fazla konjugeyi ortadan kaldırmak için slaytları iki kez suyla ve PBS ile yıkayın. Slaytların 21 °C'de kurumasını bekleyin. Fazla sıvıyı çıkarmak için dikkatlice lekelenin ve montajdan önce kısa bir süre hava kurutun.
  6. Bölümün yüzeyini örtmek için% 50 fosfat gliserin damlası ekleyin ve ardından bir kapakla örtün. Epifluoresans mikroskobu altındaki bölümleri 40x büyütmede gözlemleyin.
    1. Pozitif ve negatif kontrolleri (pozitif kontrol: RABV ile aşılanmış fare beyinleri; negatif kontroller: RABV negatif sığır beyinleri) örneklerle aynı şekilde işleyin ve gözlemleyin.

3. RT-PCR için pozitif kontrol oluşturma

  1. Mikroplazm bankasından BHK-21 hücreleri alın. RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) suşunu 2.
  2. BHK-21hücrelerini, CO 2 (%5) varlığında 37 °C'de %10 fetal baldır serumu (FCS) ile desteklenmiş minimum esansiyel ortam (MEM) içeren şişelerde muhafaza edin ve yayın ve nemli koşullar altında. Hücreleri% 80 birışıklığa ve daha sonra alt kültüre ulaşana kadar25 cm 2 kültür şişelerinde büyütün.
  3. Kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve şişeyi fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. RABV strain ERA'nın 105 TCID/mL'si ile kültürü aşıla. Co 2 (%5) varlığında 37 °C'de sürekli sallanarak viral inokülüsleri2 saat kuluçkaya yatırın ve nemli koşullar altında.
  4. Enfeksiyon ortamını çıkarın ve% 5 (serum fetal sığır) SFB ile desteklenmiş MEM ekleyin. CO 2 (%5) varlığında 37 °C'de72 saat kuluçkaya yatır nemli koşullarda.
  5. Hücreler sitopatik etkiler sergilediğinde aşılamadan 3 gün sonra RABV hasat edin. Enfekte hücreleri dondurun ve hücreleri izne çıkarmak için 4 °C'de çözün. Ortamı şişeden toplayın ve ardından hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.050 x g'da santrifüjleme için bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
  6. RABV'den gelen süpernatantları -80 °C'de saklayın ve -70 °C'de depolama için çalışan aliquots hazırlayın.
  7. İntraserebrally, önceki adımda elde edilen virüsü 21 günlük dişi CD1 farelerine aşılar. 106 MICLD 50 (fare enfeksiyöz kültürü ölümcül doz% 50) içeren50 μL çözeltiyi aşılamak için 1 mL şırınna kullanın farelere dozlar22.

4. RNA ekstraksiyonu

NOT: Toplam RNA, aşağıdaki protokole göre organik ekstraksiyon yöntemi kullanılarak doğrudan sığır beyinlerinden çıkarılmıştır.

  1. Guanidium izotiyosiyanat içeren piyasada bulunan bir reaktif kullanarak toplam RNA çıkarmak için her anatomik yapıdan 100 mg beyin dokusu kullanın.
  2. Maksimum hızda 15 s için mikrotüp içinde küçük bir pestil ile bir Dounce homojenizat kullanarak girdap kullanarak guanidium izotiyosiyanat reaktifinin 1 mL'sinde her yapıdan toplam 100 mg dokuyu manuel olarak homojenize edin.
  3. Numuneleri 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın ve ardından 200 μL kloroform ekleyin. Numuneleri 15 sn boyunca kuvvetlice karıştırın, 2 ila 3 dakika buzda kuluçkaya yatırın ve ardından 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjlayın.
  4. Sulu fazı temiz bir tüpe aktarın ve 500 μL izopropil alkol ekleyin. Numuneleri 21 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  5. Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj edin. Sulu süpernatantı pipetleme ile epire edin. İzole RNA tüpte bir pelet olarak mevcut olacaktır.
  6. Daha sonra, RNA peletini pipetleme ile% 75 etanol 1 mL ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 7500 x g'da santrifüj.
  7. Süpernatantı kurutun ve RNA peletini oda sıcaklığında (21 °C) havayla kurutun. Daha sonra, peletin 50 μL çekirdeksiz suda seyreltin.
  8. Spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ve kalitesini 260 nm olarak belirleyin. Kullanıma kadar RNA'yı -80 °C'de saklayın.
  9. DNA'yı DNase I ile sindirerek RNA örneklerinden çıkarın. Ardından, 5 μL 10x reaksiyon tamponu ekleyin ve ardından 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın. Karışıma 1 μL EDTA ekleyerek DNase I'i devre dışı bırak ve ardından 65 °C'de 10 dakika kuluçka.

5. cDNA sentezi ve PCR

  1. Oligo dT ve ters transkriptaz kullanarak ilk iplikçik cDNA sentezlemek. Her 1 μg RNA için 1 μL oligo DT (500 μg/mL), 1 μL 10 mM dNTP karışımı ve 12 μL'lik son hacme çekirdeksiz damıtılmış su ekleyin. Karışımı 65 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  2. Reaksiyon karışımını 4 °C'ye soğutun. Tüpü 1.050 x g'da30 sn sn santrifüjleyin ve ardından 4 μL reaksiyon tamponu, 2 μL 0,1 M DTT ve 1 μL ribononik önleyici (40 U/μL) ekleyin.
  3. Reaksiyon karışımını 37 °C'de 2 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından 1 μL ters transkriptaz (200 U) ekleyin. Daha sonra, reaksiyon karışımını 37 ° C'de 50 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından reaksiyonun 70 ° C'de 15 dakika boyunca inaktive edin.
  4. Kullanmadan önce cDNA'yı -20 °C'de saklayın.
    NOT: Sentezlenen cDNA'nın kalitesini doğrulamak için, sentez in vitrosunu gerçekleştirmeden önce RABV N geninin 761 bp'lik bir parçasının amplifikasyonunun gerçekleştirilmesi gerçekleştirilir. Aşağıdaki 5.5. adımda açıklandığı gibi Loza-Rubio ve ark.11 tarafından açıklanan protokolü kullanın.
  5. Aşağıdaki koşullar altında Taq DNA polimeraz kullanarak PCR gerçekleştirin. Reaksiyon kurulumini aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 20 mM MgCl 2,0,2mM dNTP içeren 10x Taq tamponu, 1 U Taq polimeraz, her astarın 10 μM'si (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ ve SuEli-: 5′ caggctcraacattcttctta 3′), 2.5 μL cDNA ve ultra saf su 50 μL'lik son hacme.
  6. Aşağıdaki bisiklet koşullarını kullanarak bir termosikleyicide amplifikasyonu gerçekleştirin: 3 dakika boyunca 95 ° C; 30 s için 95 ° C 35 döngü, 30 s için 60 ° C ve 1 dakika için 72 ° C; 7 dakika boyunca 72 °C'lik bir döngü.
  7. % 1 agarose jel kullanarak 761 bp PCR ürünlerinin varlığını değerlendirin.

6. Tüp bebek transkripsiyon

NOT: In vitro transkripsiyon hedef genin mRNA'ını oluşturur. Tam RABV N genini yükselten ve qRT-PCR tahlili için pozitif kontrol olarak kullanılan bir astar çifti kullanın. Bu astarlar, tam RABV N genini güçlendirmek ve T7 polimerazını (TAATACGACTCACTATAG) tanıyan bir promotör eklemek için tasarlanmıştır.

  1. Tüm N geni RABV'yi güçlendirmek için Trans-Nrab ileri (5ʹ gatgagtcactcgaatatattcttctt 3ʹ) ve ters (5ʹ caataatacgactcactataggatgccgacaagatt 3ʹ) ve yüksek kaliteli bir PCR kiti kullanın.
    1. Her reaksiyon için, temiz bir PCR tüp reaksiyon tamponu 10x ekleyerek bir PCR ana karışımı hazırlayın, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTP, her astarın 10 μM'si, 0,5 U yüksek kaliteli polimeraz, 1,5 μL cDNA (adım 5'te hazırlanmış) ve ultra saf su 50 μL'lik son hacme kadar.
    2. Amplifikasyon için aşağıdaki koşullara ayarlanmış bir termosikler kullanın: 1 dakika boyunca 94 °C; 1 dakika için 94 °C, 1 dakika için 40 °C ve 2 dakika için 72 °C döngü; 1 dakika için 94 °C, 1 dakika için 60 °C ve 2 dakika için 72 °C 35 döngü; 2 dakika boyunca 72 °C'nin son uzantısı.
  2. PCR ürününü in vitro sentez için bir şablon olarak kullanmak ve enzimatik reaksiyonun bileşenlerini adım 6.1.2'den çıkarmak için, PCR ürününü üreticinin talimatlarına göre sütun tabanlı bir yoğunlaştırıcı kiti kullanarak arındırın ve ardından bir spektrofotometre kullanarak ölçün.
  3. RNA sentezi için, aşağıdaki reaksiyon karışımına sahip bir in vitro transkripsiyon kiti kullanın: 5 μL T7 Transkripsiyon 5x tampon, her trifosfat nükleotitten 1,9 μL, 10 μg saflaştırılmış RABV N DNA VP2 DNA ve enzim karışımının 2,5 μL'si. Daha sonra, karışımı 37 °C'de 4 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Ardından, reaksiyon karışımına 1 μL 1 U/μg RNase Içermeyen DNaz ekleyin ve DNA kirlenmesini ortadan kaldırmak için 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Tüp bebek transkriptif RNA'sını saflaştırın ve fenol:kloroform:izoamil alkol kullanarak konsantre edin (25:24:1).
  5. Saflaştırılmış RNA peletini 70 μL TE arabelleğine yeniden depolayın ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
  6. PCR protokolünü adım 6.1'den yaklaşık 5 μg PCR ürünü elde edilene kadar tekrarlayın. Saflaştırma ve konsantrasyondan sonra, in vitro transkript N gen mRNA 4.711 μg / μL konsantrasyonda mevcut olacaktır.
  7. In vitro transkriptörlü mRNA'nın bu protokolün 5.

7. Gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR)

  1. qRT-PCR için, üreticinin talimatlarına göre hibridizasyon probları kullanan ticari bir tek adımlı qRT-PCR kiti ile birlikte pozitif bir kontrol olarak tam N genini kodlayan bir in vitro mRNA transkript kullanın. RABV geni N'nin korunmuş bir bölgesini tespit etmek için Carneiro ve ark.(2010) 23 tarafından açıklanan prob ve astarları kullanın (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′, ve BRDesrot-Probe: 5′-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).
  2. Aşağıdaki termal bisiklet koşullarını kullanın: 10 dakika için 50 °C 1 döngü ve 2 dakika için 95 °C; 15 s için 95 °C 40 döngü ve 30 sn için 50 °C.

8. Kalibrasyon eğrisi veya standart eğri

  1. Altı dektil seyreltme elde edilene kadar 1 μg/μL mRNA'yı tüplere seri olarak pipetleme yaparak in vitro transcribed mRNA'nın seri seyreltmelerini gerçekleştirin. Tüpleri standart eğriyi oluştururken kullanılmak üzere üç taraflı olarak 100 μL hacimde hazırlayın. QRT-PCR'ı 7.
  2. QRT-PCR'yi, çeşitli beyin örneklerini standart eğriyi oluşturmak için çalışan reaksiyonlarla aynı anda işleyerek ve hücre kültüründen izole edilmiş pozitif kontroller, negatif kontroller ve süpernatantlar kullanarak bir rotorlu termosikler halinde gerçekleştirin.
  3. Testin algılama, test etkinliği ve duyarlılığı sınırını değerlendirmek için, aynı koşullar altında üç taraflı olarak standart bir eğri kullanın.

9. biyolojik örneklerin qRT-PCR'si

  1. RABV gen N'nin tespiti için, 7.
  2. Sığır beyin örneklerinde bulunan RABV genomunun kopya sayısını belirlemek için, standart eğri ve biyolojik örneklerden ve kalibrasyon eğrisi denkleminden enterpolasyonlu olanlardan Ct verileri elde edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Önceki çalışmalar, DFA'nın RABV'i sadece numunenin oda sıcaklığında (21 °C)14'tedepolanmasının yedi gün içinde tespit dabileceğini göstermiştir. Buna karşılık, bu çalışma, numuneler 12 gün boyunca oda sıcaklığına maruz kaldıktan sonra RT-PCR'nin hassasiyetinin azalmaya başladığını göstermiştir. Bu nedenle RABV genom, 23 güne kadar oda sıcaklığına maruz kalan örneklerde qRT-PCR ile tespit edilebilir. Bu, daha fazla ayrışmış numuneler için qRT-PCR duyarlılığının nispeten daha yüksek olduğunu gösterm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Tarım, Ormancılık ve Hayvancılık Araştırmaları Enstitüsü (INIFAP) tarafından desteklendi. Jerzayn Fraustro Esquivel'e bu belgeyle ilişkili videonun geliştirilmesindeki işbirliği için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
KloroformSIGMAC7559Mineral yağ ile kaplanmış PCR'lerin sulu fazının geri kazanımını kolaylaştırır.
DNA Temiz & Konsantratör-500ZimoD4031DNA Temiz & Konsantratör-500 (DCC-500), hızlı, geniş formatlı saflaştırma ve 500 & mikroya kadar konsantrasyon için tasarlanmıştır; büyük ölçekli kısıtlama endonükleaz sindirimleri ve saf olmayan DNA preparatları dahil olmak üzere numunelerden elde edilen g yüksek kaliteli DNA.
EtanolAmresco193-500Nükleik asitlerin saflaştırılması
FastStart High Fidelity PCR Sistemi kiti, dNTPackRoche3553400001Rastgele baz değişikliklerinden kaçınarak PCR ürünlerinin amplifikasyonu için yüksek kaliteli enzim
GelDoc XRBioRad XR +Daha büyük protein ve DNA jellerini analiz eder
GelRedBiotium41003Yeni nesil nükleik asit jel boyaları, boyaların canlı hücrelerdeki nükleik asitlerle etkileşime girme şansını en aza indirmek için tasarlanmış yeni kimyasal özelliklere sahiptirler.
iCycler Termal Döngüleyici GradyanıBioRad582BRSıcaklık, cihaz algoritması, numune içi prob veya numune blok modları ile izlenebilir ve kontrol edilebilir
iTaq Üniversal Problar Tek Adımlı KitBioRad1725141TaqMan tipi hibridizasyon probları kullanılarak PCR reaksiyonlarını gerçek zamanlı olarak gerçekleştirmek için reaksiyon karışımı
İzopropil alkolAmresco0918-500Nükleik asitlerin çökelmesi
QIAquick jel ekstraksiyon kitiQiagen28706QIAquick Kitleri, DNA'nın yüksek tuzlu tamponda bağlanması ve düşük tuzlu tampon veya su ile elüsyon için bir silika membran düzeneği içerir. Saflaştırma prosedürü, DNA örneklerinden primerleri, nükleotidleri, enzimleri, mineral yağı, tuzları, agarozu, etidyum bromür ve diğer safsızlıkları giderir
M-MLV Ters TranskriptazInvitrogen28025-021Moloney Murine Lösemi Virüsü Ters Transkriptaz (M-MLV RT), tamamlayıcı
bir DNA zincirini sentezlemek için bir primer varlığında tek sarmallı RNA veya DNA kullanır.
NanoDrop 2000Thermo-ScientificND2000Mikrohacimli Spektrofotometre
Oligo(dT)18 astarInvitrogenSO132Oligo (dT)18 astarı, 5'- ve 3'-hidroksil uçlu sentetik tek sarmallı 18-mer oligonükleotiddir.
RiboMAX Büyük Ölçekli RNA Üretim Sistemleri kiti SP6 ve T7PromegaP1300İn vitro transkripsiyon reaksiyonları, rekombinant DNA şablonlarından RNA problarının mikrogram miktarlarını sentezlemek için kullanılır. RNA probları oluşturmak için tasarlanan çoğu transkripsiyon reaksiyonu, büyük miktarlarda RNA Taq DNA Polimeraz Invitrojen üretmek yerine radyoaktif işaretli ribonükleotidlerin dahil edilmesini en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiştir
#EP0402Taq DNA Polimeraz, termofilik bakteri Thermus aquaticus'un oldukça termostabil bir DNA polimerazdır. Enzim 5'i katalize eder ve 3' DNA
  sentezi;
TRIzol reaktifiInvitrogen15596026TRIzol reaktifi, yüksek kaliteli toplam RNA'nın izolasyonu veya çeşitli biyolojik numunelerden RNA, DNA ve proteinlerin aynı anda izolasyonu için tasarlanmış eksiksiz, kullanıma hazır bir reaktiftir.

Kaynaklar

  1. Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).
  2. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html (2019).
  3. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  4. Prabhu, K. N., et al. Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India. Veterinary Science. 5 (1), 24(2018).
  5. Woldehiwet, Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).
  6. Singh, R., et al. Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review. Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).
  7. David, D. Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis. Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).
  8. Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies. Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).
  9. Wacharapluesadee, S., et al. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).
  10. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
  11. Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants. Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).
  12. Dedkov, V. G., et al. Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).
  13. Boldbaatar, B., et al. Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).
  14. Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).
  15. Dacheux, L. Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812(2016).
  16. Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).
  17. Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE. , Available from: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p (2018).
  18. Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests. Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).
  19. Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2017).
  20. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  21. Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino. Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).
  22. Mendez-Ojeda, M. L., et al. Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats. Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).
  23. Carneiro, A. J., et al. Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil. Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).
  24. Andrew, S. Calculator for determining the number of copies of a template. URI Genomics & Sequencing. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html (2020).
  25. Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions. The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).
  26. Finke, S., Cox, J. H. Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene. Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).
  27. Fooks, A. R., et al. Rabies. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).
  28. Bingham, J., Van Der, M. M. Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test. Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kuduz Vir s KantitasyonuqRT PCR AnaliziRNA Ekstraksiyon ProtokolViral Genom Kopya Say sN kleoprotein Gen SaptamasStandart E ri AnaliziSaptama S n rBeyin Dokusu HomojenizasyonuIn Vitro Transkripsiyon
Çeşitli Sığır Beyin Yapılarında Kuduz Virüsünün Nicelliği
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.