Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Laboratuvar Farelerde Olgunlaşmamış Sert Kene Aşamaları Enfestasyon için Kapsül Tabanlı Model

6.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61430

⸱

9 Temmuz 2020

 ,  ,  ,  , 
1UMR BIPAR, INRAE, Ecole Nationale Vétérinaire d'Alfort, ANSES, Université Paris-Est, 2Faculté de Pharmacie, Université de Limoges, 3UMR SPE 6134 CNRS, Université de Corte Pascal Paoli

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada, laboratuvar faresine bağlı bir kapsül kullanılarak sert kenenin nymphal ve larva evreleri için bir besleme sistemi geliştirilmiştir. Besleme kapsülü esnek malzemelerden yapılır ve en az bir hafta boyunca fareye sıkıca bağlı kalır ve kene beslemenin rahat bir şekilde izlenmesini sağlar.

Özet

Keneler, gelişimin tüm aşamalarında (yumurta hariç) zorunlu kan besleme parazitleridir ve çeşitli patojenlerin vektörleri olarak kabul edilirler. Kene araştırmalarında fare modellerinin kullanımı biyolojilerini ve kene-konak-patojen etkileşimlerini anlamak için çok önemlidir. Burada laboratuvar fareleri üzerinde sert kenelerin olgunlaşmamış evrelerinin beslenmesi için zahmetli olmayan bir teknik gösteriyoruz. Yöntemin yararı basitliği, kısa süresi ve bir deneyin farklı zaman noktalarında keneleri izleme veya toplama yeteneğidir. Buna ek olarak, teknik aynı fare üzerinde iki ayrı kapsül eklenmesine izin verir, hangi keneler iki farklı grup aynı hayvan üzerinde beslemek için gerekli olan deneyler çeşitli için yararlıdır. Tahriş edici olmayan ve esnek kapsül kolayca erişilebilir malzemelerden yapılır ve deneysel hayvanların rahatsızlık en aza indirir. Ayrıca, ötenazi gerekli değildir, fareler deneyden sonra tamamen kurtarmak ve yeniden kullanılabilir.

Giriş

Keneler çeşitli patojenlerin önemli vektörleridir ve hayvan ve insansağlığıiçin ciddi bir risk teşkil 1. Etkili bir beslenme sistemi kurmak, biyolojilerini, kene-konak-patojen etkileşimlerini incelerken veya etkili kontrol önlemleri alırken çok önemlidir. Şu anda, canlı hayvanların kullanımını önlemek çeşitli yapay besleme sistemleri, kene için kullanılabilir2,3,4 ve bu deneysel koşullar izin verildiğinde kullanılmalıdır. Ancak, çeşitli deneysel ortamlarda bu sistemler uygun belirli fizyolojik özellikleri taklit etmek ve canlı hayvanların kullanımı ilgili sonuçlar elde etmek için gereklidir.

Laboratuvar fareleri yaygın olarak birçok biyolojik sistemlerin çalışması için kullanılır ve rutin kene besleme için ev sahibi olarak kullanılmaktadır5,6,7,8,9. Fareler üzerinde olgunlaşmamış kenebesleme iki yaygın yöntem ücretsiz enfestasyonlar ve fare bağlı hapsi odalarının kullanımı içerir. Serbest istilalar öncelikle larva aşamaları için kullanılır ve tıkanmış keneler kurtarılabilir bir alana düşebilir. Hapsedilme odaları genellikle farenin sırtına yapıştırılmış akrilik veya polipropilen kapaklardan oluşur. İlk teknik kene besleme için etkili bir doğal sistemdir ancak tek tek keneler ana gövdenin farklı bölgelerinde dağınık olduğundan deney sırasında yakın izleme izin vermez. Ayrıca, bir kurtarma alanına damla tıkanmış kene dışkı ve idrar ile kontamine olabilir10,11,,12,13,14 bu ciddi kene fitness etkileyebilir ya da hayvan ve kurtarma alanı arasında herhangi bir ayrım varsa onlar zarar görebilir veya fare tarafından yenen15. Oda tabanlı sistemler kenelerin tanımlanmış bir alana hapsedilmesine izin verir, ancak yapıştırma işlemi zahmetlidir ve kapaklar genellikle tutkala sıkısıkıya bağlıdır ve bu nedenle deney sırasında genellikle ayrılırlar16,17,18,19. Kapaklar da sert, rahatsız, ve farelerin yeniden kullanılmasını önlemek ve deneyden sonra ötanazi gerektiren cilt reaksiyonları, yol açar.

Bir önceki çalışmamızda, laboratuvar tavşanları20'dekeneler beslemek için etilen-vinil asetat (EVA) köpükten yapılmış odaları kullanarak etkili bir sistem geliştirdik. Burada, bu sistemi bir fare modeline uyarladık ve EVA-köpükten yapılmış kapalı kapsüllerde olgunlaşmamış sert kene aşamalarını beslemek için basit ve temiz bir yöntem öneriyoruz. Özellikle, sistemimiz hızlı kurutma (3 dk), tahriş edici olmayan lateks tutkal ile geri tıraşlı fareler yapıştırılmış elastik EVA-köpük kapsül kullanır. Bu teknik, kapsüllerin deneysel fareye sağlam ve uzun süreli bağlanmasının yanı sıra deney boyunca etkili kene istilası/toplama olanağı sağlar. Düz kapsül esnek malzemelerden yapılmış ve kan toplama veya diğer amaçlar için fare manipülasyon engel değildir. Sistem esas olarak perili kene aşamaları için uygundur, ancak hafif bir modifikasyon ile larvaların beslenmesi için de kullanılabilir. Yöntem tek deneyimli kişi tarafından tamamlanabilir ve kapsamlı eğitim gerekli değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol sadece tüm sosyal yardım ve güvenlik önlemleri laboratuvarda karşılandığında uygulanabilir. Bu protokol, Hayvan Deneyleri Etik Komitesi ComEth Anses/ENVA/UPEC, İzin Numaraları E 94 046 08 tarafından kene besleme için farelerkullanmak için izin aldı. Son nokta için, hayvanlar her biri 4 ve 5 dk iki fazda 9 dakika co2 maruz kaldı.

1. Kapsülün hazırlanması

  1. Stick 2 mm kalınlığında EVA-köpük ve yapışkan çift yapışkan köpük birlikte (Şekil 1A).
  2. 20 mm çapında deri delik zımba kullanarak, yapışmış köpük parçaları bir daire kesti. Daha sonra, 12 mm çapında delik yumruk kullanarak, çift köpük daire oluşturmak için iç kesilmiş(Şekil 1B).
    NOT: Kapsülün çerçeve kalınlığı, ana ciçin yapıştırma işlemi için yeterli yüzeyi garanti etmek için 3 mm'den büyük olmalıdır (aşağıya bakın).
  3. Koruyucu kağıt şeridini yapışkan çift yapışkan köpükten(Şekil 1C)soyun ve 20 mm çapında şeffaf dairesel plastik(Şekil 1D)takın.
    NOT: Larvaları besliyorsanız, koruyucu kağıt şeridini yapışkan köpükten çıkarmayın ve protokoldeki adım 2'ye doğrudan taşıyın. Fareye koruyucu kağıt şerit de dahil olmak üzere çift köpük halka, tutkal.
  4. Şeffaf plastikte ~ 1 cm yarık yapın(Şekil 1E).
  5. Deney sırasında aşırı nem buharlaşmasına izin vermek için entomolojik iğneli(Şekil 1F)en az 10 küçük delik oluşturun.
    NOT: Kapsül(Şekil 1G)toplam yüksekliği 4 mm (2 mm EVA-köpük ve 2 mm yapışkan köpük) vardır ve tüm sert kene türlerinin perileri ve larvalarını beslemek için kullanılabilir. 20 mm dış çapı kapsül boyutu(Şekil 1H)fare suşlarının çoğu için uygundur ancak gerekirse değiştirilebilir.

2. Kene istilası öncesi farelerin hazırlanması

NOT: Bu çalışmada, 10 - 12 haftalık kadın deneysel fareler (su C57BL/6 ve BALB/cByJ) Fransa'nın Maisons-Alfort kentinde ki Fransız Gıda, Çevre ve İş Sağlığı ve Güvenliği Ajansı'nda (ANSES) reklam libitum (Yeşil hat havalandırmalı raflar-20 Pa) sunulan gıda ve su ile standart kafeslerde muhafaza edilmiştir. Hayvanlar her türlü anormal cilt reaksiyonları, sağlık sorunları veya komplikasyonları için deneyimli teknisyenler tarafından günde iki kez izlendi.

  1. Indüksiyon odasında izofluran e ile anesthetize fare. Anestezi yapıldıktan sonra fareyi manipülasyon yastığına yerleştirin ve sürekli isofluran beslemesi için bir burun konisine takın (Şekil 2A). Dakikada 80 nefesten daha az olduğundan emin olmak için solunum hızını izleyin ve izofluran seviyesini düşürün.
    NOT: Manipülasyondan önce, gerekirse fareyi dövme veya radyo frekansı tanımlama çipi ile etiketlendirin. Isırarak kapsül hasarı önlemek için ayrı kafeslerde bireysel fareler tutmak için tavsiye edilir.
  2. Farenin ön kısmını kürek kemiklerinin arkasından kulakların hemen arkasındaki alana kadar tıraş edin(Şekil 2A).
    NOT: Tıraş alanı kapsül yüzeyinden daha büyük olmalıdır.
  3. Hazırlanan kapsülün tüm EVA-köpük bölgesine tahriş edici olmayan lateks tutkal uygulayın ve 1 dakika bekleyin(Şekil 2B).
  4. Kapsülü, özellikle kapsülün sol ve sağ tarafında, parmak(lar)(Şekil 2C)ile hafif 3 dk sabit basınçla fareye yapıştırın. Biraz görsel cilde bağlılığını kontrol etmek için kapsül kaldırın. Bağlı olmayan bölgeler bulunursa, bir spatula kullanarak daha fazla tutkal uygulayın ve 3 dakika daha basın.

3. Kene Istilası

  1. Perisi istilası için, adım 1.4(Şekil 2D)yapılan kesim yoluyla kapsül içine bireysel perileri tanıtmak.
    NOT: Ixodes kene türleri için bir kapsül başına en fazla 20 perisi tavsiye edilir.
  2. Şeffaf plastiğin ince diseksiyon forsepsleri kullanarak tek tek perileri daha kolay piyasaya sürülmesi için bükülebilmesi için kapsülü iki taraftan hafifçe sıkın(Şekil 2D). Kapsül içinde kesim yoluyla bireysel perileri itin. İçeri girdikten sonra, 90° halinde ki forceps'ü çevirin ve keneleri kapsülün içine yatırmak için forcepleri çıkarın.
  3. Larva istilası için kağıt kaymayı ekli kapsülden çıkarın (Şekil 2E). Larva içeren şırıngayı(Şekil 2F)doğrudan kapsülün içine yerleştirin ve şırınga pistonuna iterek keneleri yatırın. Bağlı kalan larvaları çıkarmak için yavaşça pistonu cilde doğru çevirin.
    NOT: Larvaları deneyden önce pamuk parçasıyla takılı kesik uçlu 1 mL'lik şırıngayerleştirin.
  4. Larvalar cilde birikdikten sonra, şeffaf plastik(Şekil 2G)takarak kapsülü kapatın.
  5. Kapsületrafında koruyucu plastik bant uygulayın (Şekil 2H).
    NOT: Koruyucu plastik bant, kapsülün deney boyunca dayanıklılığını büyük ölçüde artırmiştir(Şekil 2I,J). Tek bir fareye iki kapsül takmak mümkündür (Şekil 2K). Bu durumda kapsüller arasında en az 3 mm boşluk gereklidir ve tıraş alanı uygun şekilde artırılmalıdır.
  6. Fareleri kafese geri ver.

4. Keneler Koleksiyonu

  1. Yukarıdaki adım 2.1'deki gibi fareyi anesthetize edin.
  2. Bir neşter ile plastik bir haç şeklinde kesim(Şekil 3A)olun.
    NOT: Bu çapraz şekilli kesim, tıkanmış kenelerin kolayca toplanmasını veya gerekirse besleme kenelerin ayrılmasını sağlar.
  3. Gerekirse, şeffaf plastik (20 mm çapında, Şekil 3B)bir yapışkan plastik yama yapıştırarak kapsül yeniden kapatın.
    NOT: Birden çok zaman noktalarında kene lerin toplanması isteniyorsa, aynı yapışkan plastik yama kullanılabilir. Protokol gerektiriyorsa, fareyi ötenazi yapabilir, kapsülü kaldırabilir ve keneleri toplayabilir/ayırabilir(Şekil 3C).

5. Farelerin kurtarılması

  1. Fareleri bir hafta daha kafeste tutun.
  2. Kapsülün doğal olarak ayrılmasına izin verin.
    NOT: Bu durumda kapsüllerin düşmesi yaklaşık 8-9 gün sürer. Kapsül çıkarıldığında, farelerin deri üzerinde anormal reaksiyonlar kontrol etmek önemlidir. Tahriş durumunda bir yumuşatıcı losyon uygulayın, normalde hiçbir tedavi gerekli olmasına rağmen. Etik protokol izin veriyorsa, kurtarılan fareler(Şekil 3D)başka bir kene istilası veya farklı deney(ler) için yeniden kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Farenin sırtına uygulanan EVA-köpük kapsüllerinde olgunlaşmamış sert kene aşamalarını beslemek için ayrıntılı adım adım yöntemi ni öneriyoruz(Şekil 2). Bu zahmetli olmayan protokol, hassas kene izleme ve toplama gerektiğinde çeşitli deneme türleri için uygundur. Bu yöntemin başlıca avantajları basitliği, kolay erişilebilir uygun maliyetli malzemeler ve kısa sürelidir. Buna ek olarak, bir fare bireyine(Şekil 2K)iki kapsül takarak aynı hayvan üzerinde iki farklı k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Protokoldeki en kritik adım kapsülün fare derisine sıkıca yapıştırmasıdır. Bu nedenle lateks tutkal kapsülün tüm EVA-köpük yüzeyine homojen bir şekilde uygulanmalı ve kapsülün özellikle sol ve sağ tarafına 3 dakika boyunca sabit basınç uygulanmalıdır. Ayrıca arka patilerini kullanarak fare tarafından kaldırılmasını önlemek için kapsülün mümkün olduğunca ileriye doğru yerleştirilmelerini öneririz. Deneylerimizde, fare derisine sadece EVA-köpük ve lateks tutkal yapışması doğrulanmıştır ve farklı malzemeler kullanılarak ayn...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Alain Bernier Fransız Ulusal Tarımsal Araştırma Enstitüsü (INRAE) ve Océane Le Bidel'in (ANSES) teknik yardımLarını kabul ediyoruz. Çalışma DIM One Health - Région Île-de-France (Projenin kısaltması: NeuroPaTick)tarafından desteklendi. Fareler ANSES tarafından satın alındı. Dr. Jeffrey L. Blair makalenin önceki halini gözden aldığı için kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
EVA-köpük 2 mm kalınlığında, (düşük yoğunluklu)Cosplay ShopEVA-45kg (950/450/2 mm)Amazon üzerinden de sipariş edilebilir (ref. no. B07BLMJDXD)
Isıyla Daralan Makaron Elektrikli Tel Sarma Kılıfı 31mm/1.22 inçAmazonB0848S3S6TAmazon üzerinden farklı çaplarda Isıyla Daralan Makaron mevcuttur.
Fareler BALB/cByJCharles RiverSuş kodu 627
Fareler C57BL/6Charles RiverSuş kodu 664
Toksik Olmayan Lateks TutkalYırtma tamircisiKumaş ve Deri YapıştırıcıAyrıca Amazon'dan da temin edilebilir (referans no. B001RQCTUU)
Punch Aleti El Sanatı AletiAmazonB07QPWNGBFAmazon tarafından Deri İşleme Aletleri olarak satılmaktadır Kemer Kayışı için Çalışan 1-25mm Yuvarlak Çelik Deri El Sanatları Kesici
PVC Ciltleme Kapakları ŞeffafAmazonB078BNLSNP0,150 mm ila 0,180 mm arasındaki herhangi bir şeffaf PVC kene tabakası uygundur
Kendinden Yapışkanlı Ped Sünger Çift Taraflı Köpük BantAmazonB07RHDZ35JAmazon tarafından 2 Rulo Çift Taraflı Köpük Bant, Süper Güçlü Beyaz Montaj Bandı Köpük
Şeffaf conta çıkartmaları (20 mm çapında daireler)satılırAmazonB01DAA6X66
olarak

Kaynaklar

  1. Sonenshine, D. E., Roe, M. Biology of Ticks. , Oxford University Press. (2014).
  2. Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
  3. Bonnet, S., et al. Transstadial and transovarial persistence of Babesia divergens DNA in Ixodes ricinus ticks fed on infected blood in a new skin-feeding technique. Parasitology. 134 (2), 197-207 (2007).
  4. Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: A tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
  5. Kohls, G. M. Tick rearing methods with special reference to the Rocky Mountain wood tick, Dermacentor andersoni. Culture methods for invertebrate animals. Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. , Comstock Publishing Co. Ithaca, N.Y. 246-256 (1937).
  6. Faccini, J. L. H., Chacon, S. C., Labruna, M. B. Rabbits (Oryctolagus cuniculus) as experimental hosts for Amblyomma dubitatum. Neumann (Acari: Ixodidae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 58 (6), 1236-1239 (2006).
  7. Chacon, S. C., Freitas, L. H. T., Barbieri, F. S. Relationship between weight and number of engorged Amblyomma cooperi. Nuttal (sic.) and Warburton, 1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs and eggs from experimental infestations on domestic rabbit. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 13, 6-12 (2004).
  8. Sonenshine, D. E. Maintenance of ticks in the laboratory. Maintenance of Human, Animal, and Plant Pathogen Vectors. Maramorsch, K., Mahmood, F. , Science Publishers Inc. Enfield NH. 57-82 (1999).
  9. Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
  10. Almazán, C., et al. Identification of protective antigens for the control of Ixodes scapularis infestations using cDNA expression library immunization. Vaccine. 21 (13-14), 1492-1501 (2003).
  11. Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi. (Acari:Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 35, 177-179 (1998).
  12. Almazán, C., et al. Characterization of three Ixodes scapularis cDNAs protective against tick infestations. Vaccine. 23 (35), 4403-4416 (2005).
  13. Levin, M. L., Ross, D. E. Acquisition of different isolates of Anaplasma phagocytophilum by Ixodes scapularis from a model animal. Vector Borne Zoonotic Diseases. 4 (1), 53-59 (2004).
  14. Heinze, D. M., Wikel, S. K., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J. Transcriptional profiling of the murine cutaneous response during initial and subsequent infestations with Ixodes scapularis nymphs. Parasites & Vectors. 6 (5), 26(2012).
  15. Nuss, A. B., Mathew, M. G., Gulia-Nuss, M. Rearing, Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice. Journal of Visualized Experiments. (123), e55286(2017).
  16. Wada, T., et al. Selective ablation of basophils in mice reveals their nonredundant role in acquired immunity against ticks. Journal of Clinical Investigation. 120 (8), 2867-2875 (2010).
  17. Saito, T. B., Walker, D. H. A Tick Vector Transmission Model of Monocytotropic Ehrlichiosis. The Journal of Infectious Diseases. 212 (6), 968-977 (2015).
  18. Boppana, V. D., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J., Adler, A. J., Wikel, S. K. Blood feeding by the Rocky Mountain spotted fever vector, Dermacentor andersoni, induces interleukin-4 expression by cognate antigen responding CD4+ T cells. Parasites & Vectors. 2 (1), 47(2009).
  19. Gargili, A., Thangamani, S., Bente, D. Influence of laboratory animal hosts on the life cycle of Hyalomma marginatum and implications for an in vivo transmission model for Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Frontiers in Cell and Infection Microbiology. 20 (3), 39(2013).
  20. Almazán, C., et al. A Versatile Model of Hard Tick Infestation on Laboratory Rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994(2018).
  21. Zhijun, Y., et al. The life cycle and biological characteristics of Dermacentor silvarum Olenev (Acari: Ixodidae) under field conditions. Veterinary Parasitology. 168 (3-4), 323-328 (2010).
  22. Ahmed, B. M., Taha, K. M., El Hussein, A. M. Life cycle of Hyalomma anatolicum Koch, 1844 (Acari: Ixodidae) fed on rabbits, sheep and goats. Veterinary Parasitology. 177 (3-4), 353-358 (2011).
  23. Široký, P., Erhart, J., Petrželková, K. J., Kamler, M. Life cycle of tortoise tick Hyalomma aegyptium under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 54, 277-284 (2011).
  24. Chen, X., et al. Life cycle of Haemaphysalis doenitzi (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions and its phylogeny based on mitochondrial 16S rDNA. Experimental and Applied Acarology. 56, 143-150 (2012).
  25. Jin, S. W., et al. Life Cycle of Dermacentor everestianus Hirst, 1926 (Acari: Ixodidae) under Laboratory Conditions. Korean Journal of Parasitology. 55 (2), 193-196 (2017).
  26. Labruna, M. B., Fugisaki, E. Y., Pinter, A., Duarte, J. M., Szabó, M. J. Life cycle and host specificity of Amblyomma triste (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 30 (4), 305-316 (2003).
  27. Breuner, N. E., et al. Failure of the Asian longhorned tick, Haemaphysalis longicornis, to serve as an experimental vector of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi sensu stricto. Ticks Tick Borne Diseases. 11 (1), 101311(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Sert Kene stilasKene Besleme ModeliKaps l Ba lamaEVA K p k Kaps lKene zlemeKene ToplamaFare Yeniden Kullan mKene BiyolojisiPatojen letimi
Laboratuvar Farelerde Olgunlaşmamış Sert Kene Aşamaları Enfestasyon için Kapsül Tabanlı Model
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.