Method Article

Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

DOI:

10.3791/61434

⸱

October 31st, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 2Department of Neuroscience, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 3Dulbecco Telethon Institute, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, primer nöronal kültürlerde protein ko-lokalizasyonunu incelemek için süper çözünürlüklü mikroskopinin nasıl yapılacağını göstermektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinapslar nöronların fonksiyonel elemanları dır ve bunların kusurları veya kayıpları çeşitli nörodejeneratif ve nörolojik bozuklukların temelinde dir. Görüntüleme çalışmaları fizyolojik ve patolojik koşullarda işlevlerini ve plastisitesini araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Büyüklükleri ve yapıları nedeniyle proteinlerin lokalizasyon çalışmaları yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri gerektirir. Bu protokolde, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanılarak süper çözünürlük düzeyinde sinaptik belirteçlerle hedef proteinlerin birlikte lokalizasyonu nun primer nöronlarda incelenmesi için bir prosedür tanımlıyoruz. SIM, geniş alan mikroskopisinin uzamsal çözünürlüğünü iki katına çıkararak yaklaşık 100 nm'lik bir detaya ulaşan desenli ışık aydınlatma tekniğidir. Protokol, sağlam eş yerelleştirme çalışmaları için gerekli denetimleri ve ayarları ve görüntüleme verilerini doğru analiz etmek için istatistiksel yöntemlere genel bakışı gösterir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anlayış ve sinaps görünümü 18971Yılında Foster ve Sherrington tarafından ilk açıklamasından bu yana büyük ölçüde değişti. O zamandan beri, nöronal iletişim bilgimiz ve arkasındaki moleküler süreçler katlanarak 2büyüdü. Bu sinapslar iki bölmeli bir sistem olarak düşünülebilir açık hale gelmiştir: nörotransmitterlerin salınımı için veziküller içeren bir pre-sinaptik bölmesi ve reseptörleri ile post-sinaptik bölmesi3. Bu basit görüş, son yirmi yıl içinde, sinyalizasyon 4içine bağlayıcı transduce için gerekli proteinlerin karmaşık bir ağ haline gelmiştir.

Anlayış kazanımları kısmen sinapsların boyutuna uygun geleneksel ışık mikroskobu kırınım sınırını aştı süper çözünürlük teknikleri nedeniyle daha iyi5,6,7,8,9,10. Kırınım sınırı nedeniyle, optik mikroskop yanal olarak 200 nm üzerinde bir çözünürlüğe ulaşamaz11,12. Bu sınırı atlamak için, farklı yaklaşımlar kullanılarak ve farklı alt kırınım sınır kararlarına ulaşan süper çözünürlük teknikleri oluşturuldu: SIM, STED (Uyarılmış Emisyon Tükenmesi Mikroskopisi), PALM (FotoAktislokalizasyon Mikroskopisi) ve STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM uyarma ışını yolu15içine bir kırınım ızgara ekleyerek lazer tabanlı geniş alan mikroskobu sistemlerinin mekansal çözünürlüğü iki katına çıkar. Hareketli ızgara, lazer ışınlarını difüzörlererek bilinen bir aydınlatma deseni oluşturur, genellikle çizgiler. Bu amaçla yapılandırılmış ışık deseni floresan boyanın (numunenin) bilinmeyen mekansal dağılımına yerleştirilir. İki modelin oluşturduğu girişim saçaklar, normal geniş alan mikroskobu yla ayırt edilemeyen ince ayrıntıları kodlar. Son süper çözümlü görüntü, kırınım ızgarasının çevirileri ve rotasyonları ile elde edilen aynı örneğin birkaç ham görüntüsünün matematiksel yöntemlerle birleştirilmesi ve kodlanması ile elde edilir. Süper çözülmüş görüntülerin çözünürlüğü lateral de 100 nm ve eksenel yönlerde 500 nm'ye ulaşır 2D-SIM15 veya 100 nm lateral de xeksensel yönlerde 3D-SIM16.

Sinaps yeni anlayış sinaptik disfonksiyon başlangıçlı ve ilerleme önemli bir rol oynar birçok nörolojik bozukluklar ışığında daha da önemlidir17,18. Alzheimer hastalığı, Down sendromu, Parkinson hastalığı, prion hastalıkları, epilepsi, otizm spektrum bozuklukları ve diğerleri arasında kırılgan X sendromu sinaptik kompozisyon anormallikleri ile bağlantılı olmuştur, morfoloji ve fonksiyon19,20,21,22.

Son zamanlarda, SUMO özgü antikorlar bir dizi kullanarak, biz süper çözünürlük düzeyinde pre-ve post-sinaptik belirteçleri sinapofiz ve PSD95 ile SUMO proteinlerinin primer hipokampal nöronlarda co-lokalizasyon göstermek için SIM kullanılır23. Bu, nöronlarda SUMO lokalizasyonuna dair biyokimyasal ve konfokal mikroskopi kanıtlarını doğrulamamızı sağladı.

Burada, fare hipokampal primer nöronlarda proteinlerin lokalizasyonunu inceleyen bir protokol uyguluyoruz. Aynı zamanda, bu protokol birincil nöronal kültürlerin farklı adapte edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Birincil kültürler

  1. #1.5 (0.17 mm) kapak kalınlığı için objektif gereksinime uyan odalı kapaklı dudaklarda (Ibidi μ-Slide 8 Kuyu veya Nunc Lab-Tek Odalı Coverglass gibi) kültür faresi hipokampal primer nöronlar.
  2. 100 μL poli-L-lizin (100 μg/mL) ile paltolu kapaklar.
  3. Ertesi gün, steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez odalı kapakları yıkayın.
  4. Fare birincil nöronlar elde etmek için, P1-P4yavru23gelen hipokampi izole .
  5. Diseksiyon Media(Tablo 1)10 mL diseksiyon hipokampi yerleştirin ve onları tüpün altına yatırın.
  6. Steril bir pipet kullanarak, dikkatle Diseksiyon Medya kaldırmak, tüp altında hipokampi rahatsız bırakarak.
  7. Hippocampi'ye 10 mL Medya(Tablo 1)ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  8. Steril bir pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde Medya 1 kaldırmak, tüp altında hipokampi rahatsız bırakarak.
  9. 10 mL Media 2(Tablo 1)ekleyin ve (kapaklı) santrifüj tüpünü kaputun altında yatay olarak 45 dakika bekletin.
  10. Santrifüj tüpün dikey olarak durmasını bekleyin ve dokunun tüpün dibine yerleşmesini bekleyin.
  11. Steril bir pipet kullanarak Media 2'yi dikkatlice çıkarın ve hipokampiyi santrifüj tüpünün altında rahatsız edilmeden bırakarak.
  12. 2 mL Ortam 3(Tablo 1) ekleyin.
  13. Filtrelenmiş uçlu bir p1000 pipet kullanarak hücreleri dokudan mekanik olarak ayırın.
  14. İzole nöronların bulunduğu süpernatantı 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
  15. Hücre süspansiyonuna oda sıcaklığında 300 x g'da (RT) 2 dk santrifüj edin.
  16. Santrifüjden sonra hücreler santrifüj tüpünün alt kısmında yer alır. Steril bir pipet kullanarak supernatant atın.
  17. Media 4'ün 1 mL'inde hücreleri yeniden askıya alın.
  18. Çözünmemiş hücreleri ortadan kaldırmak için 70 μm filtre kullanın.
  19. Hücre süspansiyonunun 19 μL'sine %0,4 Trypan mavisi çözeltinin 1 μL'sini ekleyerek Bürker odasındaki canlı hücreleri sayın.
  20. 70.000 hücre/kuyudaki plaka hücreleri kuyu başına 200 μL hacimdedir.
  21. Hücrelerin 37 °C ve %5 CO 2'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 2 saat boyuncabağlanmasınaizin verin.
  22. Odacıklı kapakları kuvözden alın ve ortamı 200 μL Kültür Medya ile dikkatlice değiştirin.
  23. Odacıklı kapakları 37 °C ve %5 CO2'denemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde bırakın.
  24. Her 5-7 günde bir ortamın üçte birini taze kültür medyası ile değiştirin.
  25. Hipokampal primer nöronlar tamamen olgunlaşmış kadar bekleyin (12-14 gün kaplama sonra) co-lokalizasyon çalışmaları gerçekleştirmek için.

2. İmmünofluoresans boyama

  1. Kuvözdeki odacıklı kapakları alın.
  2. Ortamı çıkarın.
  3. Kuyuları 200 μL PBS ile hızlıca yıkayın.
  4. PBS'de (200 μL/well) nöronlara hızlı bir şekilde düzeltmek için %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin.
  5. HÜCRELERI 15 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
  6. PFA çözümlerini çıkarın.
  7. % 0.2 Triton X-100 (200 μL/ iyi) ile PBS ekleyerek hücreleri permeabilize.
  8. RT'de 1 dakika kuluçka.
  9. Çözeltiyi çıkarın ve numuneleri PBS'de %1 büyükbaş serum albumini (BSA) ile (200 μL/iyi) 1 saat boyunca RT'de analiz için alakasız bir proteinle plakanın tüm serbest bağlayıcı yüzeylerini pasif olarak kaplayın. Triton X-100 olmadan BSA tabanlı engelleme tamponu, %0,2 Triton X-100 ile aynı tampondan daha verimli bir şekilde antikor arka planını azaltır.
  10. Çözümü çıkarın.
  11. %1 BSA ve %0.2 Triton X-100 içeren bir PBS çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikor (antikor seyreltmesi ve kullanılabilirliğine bağlı olarak 120-200 μL/kuyu) ekleyin. Örnekleri 2 saat kuluçkaya yatırın.
    1. Negatif kontrol olarak, kuyulardan birine herhangi bir birincil antikor eklemeyin. Farklı hedeflere karşı farklı türlerin birden fazla antikorları aynı anda kullanılabilir. TAVUKTA YÜKSELTİlEN MAP2 (nöronal belirteç) karşı bir antikor, farede yetiştirilen PSD95 veya sinaptophysin'e karşı bir antikor ve tavşanda yetiştirilen bir hedef proteine karşı bir antikor kullanın. Bu, üç renkli SIM analizleri sağlar.
  12. Kuyuları PBS (200 μL/iyi) ile üç kez hızlıca yıkayın.
  13. %1 BSA ve %0,2 Triton X-100 (200 μL/well) içeren bir PBS çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikorlar (dyLight ve Alexa sekonder antikorlar kullanılabilir). Rt'de 1 saat boyunca örnekleri kuluçkaya yatırın.
  14. Kuyuları PBS (200 μL/iyi) ile üç kez hızlıca yıkayın.
  15. Çekirdekleri lekelemek için PBS'de (200 μL/iyi) seyreltilmiş 1 μg/mL konsantrasyonda Hoechst boyaekleyin. Rt'de 10 dakika boyunca örnekleri kuluçkaya yatırın.
  16. PBS ile kuyuları iki kez hızlıca yıkayın.
  17. SIM uyumlu bir montaj antonu kullanarak hücreleri monte edin. 10 μL/well prolong cam antifade mountant kullanın.
  18. Hücreleri bir kapak camı (örn. 8 mm çapında yuvarlak bir kapak lı cam) ile kaplayın ve koruyun. Kare olanlar da kullanılabilir.
  19. Odacıklı kapakları RT'de saklayın ve görüntü almadan önce en az 48 saat bekleyin. Diamond Glass süper çözünürlüklü satın almadan önce en az iki gün kür gerektirir.

3. Antikor özgüllük kontrolü

NOT: Antikor özgüllüğünü sağlamak için iki strateji kullanın. İlk strateji, aynı substratı hedefleyen en az iki farklı antikor kullanmaktır. İkinci strateji saflaştırılmış protein hedefi veya antikor yükseltmek için kullanılan epitop ile kuluçka ile antikor nötralizasyon olduğunu.

  1. PBS'de %1 BSA'da 1 saat boyunca rekombinant hedef veya epitopun beş kat fazlasıyla tercih edilen antikora inkübün.
  2. Kuluçkadan sonra, yukarıda açıklandığı gibi 2.11 boyama için her zamanki konsantrasyonda nötralize antikor kullanın.

4. Mikroskop kalibrasyonu

NOT: Nikon tarafından üretilen n-sim süper çözünürlüklü mikroskop sistemini süper çözünürlüklü çalışmalar için rutin olarak kullanıyoruz. Ancak, diğer birçok şirket de kendi kataloglarında süper çözünürlüklü mikroskoplar sunuyoruz. Nikon'un N-SIM sistemi için özel endikasyonlar açıklansa da, takip eden talimatlar diğer sistemlere genellenebilir. SIM görüntülerin edinilmesinden önce, sistem belirli alt çözünürlüklü boyutta floresan boncuklar ile uygun bir kalibrasyon gerektirir. Buna bir örnek TetraSpeck mikroküreleridir. Bu boncuklar farklı floresan boyalar ile tek bir örnek ile farklı lazerlerin kalibrasyonu sağlamak için boyanmıştır.

  1. Bir su banyosu nda 10 dakika boyunca 1.8 x 108 floresan mikrosferler civarında sonicate. Nikon'un N-SIM sistemi kalibrasyon için seyrek nüfuslu çok renkli boncuk örneği gerektirir. Bu alt çözünürlük boyutu floresan boncuk yoğun bir tek katman gerektiren diğer sistemler için farklı olabilir. Floresan partiküllerin sayısını buna göre ayarlayın.
  2. Floresan mikrosferleri 1:500'ü çift distile suda seyreltin.
  3. Ek bir 10 dakika için ikinci kez Sonicate.
  4. Pipet 15 l sulandırılmış boncuklar odalı bir kapak bir kuyuiçine.
  5. Çözeltinin RT'de 5 dakika kurutulmasına izin verin.
  6. Montaj çözeltisinin 10 μL'sini ekleyin ve üzerine 8 mm'lik bir kapak kaydırın.
  7. Uygun kür izin vermek için en az 48 saat bekleyin.
  8. Mikroskobu ve lazerleri açın.
  9. Tüm mikroskop bileşenlerinin termal dengesine ulaşmak için sistemin ısınmasına izin verin. N-SIM Süper Çözünürlüklü Mikroskop Sistemi en az 3 saat sürer.
  10. 100x hedefini seçin.
  11. Lazerleri kırınım ızgara bloğunun ortasına hizalayarak kalibrasyonu başlatın. N-SIM sisteminde, bir mikrometre knob ve özel bir kamera, ışık demetlerinin hedefe ortalanmasına olanak sağlar.
  12. Görüntülemek için odacıklı kapak fişini mikroskopa yerleştirin. Objektif düzeltme yakasını ayarlayarak sistemi odalı kapak kalınlığına ayarlayın. N-SIM Süper Çözünürlüklü Mikroskop sistemleri ile sağlanan tescilli yazılım Olan NIS yazılımı, düzeltme yakalarını düzenlemek için otomatik bir fonksiyona sahiptir.
  13. Numune üzerinde odaklanmış yapılandırılmış desen aydınlatması sağlamak için her kanal için ızgara bloğu odağı ayarlayın. NIS yazılımı bu görev için otomatik bir işlev sağlar.
  14. Ardından, çok renkli mikrokürelerin ham 3D-SIM görüntülerini edinin. Biyolojik görüntülerin analizi için mikroskop yazılımı veya açık kaynak yazılım platformu kullanarak süper çözümlü görüntü elde etmek için ham görüntüleri yeniden oluşturmak ImageJ24 ve eklenti fairSIM25.
  15. Her ayrılmış dalga boyu için 4,14'te elde edilen süper çözümlü görüntünün Fourier dönüşümünü hesaplayın. Dönüştürülen görüntü doğru çiçek benzeri bir desen elde edemezse, süper çözünürlük elde edilemediğinden kalibrasyonu 4,11'den yeniden başlatın.
  16. Süper çözümlü görüntüde, elde edilen çözünürlüğü ölçmek için tek bir mikrosfer seçin ve her kanal için yoğunluk profilini hesaplayın. Şimdi yanal olarak 100 nm yakın olmalıdır.
  17. Ardından, mikrokürelerin çok kanallı bir edinimi kaplayarak kanal kaydı gerçekleştirin. Amaç, tüm kanal sinyallerini yanal ve eksenli olarak harmanlamaktır. Bu, farklı kanalların yanlış hizalanması nedeniyle renk sapmalarını ortadan kaldırır ve birlikte yerelleştirme analizine yardımcı olur.
  18. Açık kaynak uygulaması ImageJ için bir eklenti paketi olan SIMcheck26'nın"Aydınlatma Faz Adımları" ve "Aydınlatma Desen Odağı" işlevlerini kullanarak kalibrasyon kalitesini onaylayın. Bu amaçla, yoğun bir TetraSpeck mikroküre tabakası elde etmek ve numunenin 3D SIM görüntüsünü elde etmek için odacıklı bir kapak fişi hazırlayın. ImageJ'deki görüntüyü analiz edin ve sapmalar tespit edilirse, 4.11 adımdan mikroskop kalibrasyonünü yeniden başlatın.

5. Satın alma

  1. Confocal veya widefield modunda 40x hedefi kullanarak örnek analiz başlayın. Bu, iyi ayrıntıları ve geniş bir görüş alanı koruyarak, örnek navigasyon sağlar.
  2. Nöronal süreçleri temsil eden bir alanı belirlemek için MAP2 antikor sinyalini kullanın.
  3. Boyama kalitesini belirlemek için numunenin konfokal modda görüntülerini edinin. Düşük konfokal kalite, düşük SIM kalitesini yansıtacak, bu nedenle numunelerin atılmasını gerektirecektir.
  4. Görüntülerin alanı ve kalitesi tatmin ediciyse, hedefi 100x'e geçin.
  5. 100x hedefine yağ uygulayın.
  6. Süper çözümlenmiş görüntünün kalitesini değerlendirmek için daha sonra kullanılacak geniş alan veya konfokal görüntü elde edin (Şekil 1A,B).
  7. 3D-SIM moduna geçin.
  8. Edinme parametrelerini ayarlamak için iletişim pencerelerini kullanarak, renk bilgilerini en üst düzeye çıkarmak için kullanılabilen en yüksek bit derinliği ayarını seçin. Genellikle, 16-bit standart seçimdir. Ayrıca, sinyal-gürültü oranını artırmak için, 1 MHz gibi satın alma için düşük frekans değeri seçin.
  9. Histogram pencereleri kullanarak, sinyal doğrusal bir yanıt elde etmek için lazerler güç ayarlayın. Bilgi kaybını önlemek için görüntülerdeki doymuş pikselleri sınırlayın. N-SIM sistemi Andor iXon3 kamera kullanır. 16 bit'te çalışırken, kameranın doğrusal tepkisini sağlamak için 16.000 hedef yoğunluğu seçin. Alternatif olarak, satın alma dinamik aralığını en üst düzeye çıkarmak için 30.000-45.000 arasında bir aralık seçin.
  10. Numuneleri görüntülerken %0,1 ile %50 arasında lazer gücü ve 50 ms ile 2 s arasında maruz kalma süreleri ayarlayın. %50'nin üzerindeki lazer güçleri, kullanımdaki floroforların hızlı fotobeyazrlanmasına neden olabilir.
  11. Görüntüleri 3D-SIM modunda edinmeye başlayın.
  12. Raw görüntülerin edinim kalitesini değerlendirmek için ImageJ için ücretsiz eklentipaketi olan SIMcheck'i kullanın.
  13. SIMCheck herhangi bir yapı veya kalite sorunu algılamazsa, istatistiksel analize izin vermek için 4 teknik kopyadan en az 10 görüntü elde edin.

6. Post-prodüksiyon: görüntü rekonstrüksiyonu

NOT: 3D-SIM edinilmiş görüntüler, yeniden oluşturulmuş süper çözümlü görüntüleri elde etmek için işlenmesi gereken ham görüntülerdir. Ham görüntülerin yanlış yeniden yapılandırılması, örneklerin analizini etkileyecek yapılara yol açabilir. Bu nedenle rekonstrüksiyon parametrelerinin doğru şekilde seçilmesi için büyük dikkat edilmelidir.

  1. Süper çözümlenmiş bir görüntü elde etmek için mikroskop rekonstrüksiyon analiz yazılımını kullanarak ham görüntüleri işleyin(Şekil 1C). Alternatif olarak, ham görüntüleri yeniden oluşturmak için serbestçe kullanılabilir ImageJ eklentifairSIM kullanın.
  2. Mikroskop rekonstrüksiyon yazılımı veya ImageJ eklentisi SIMCheck kullanarak süper çözülmüş görüntülerin Fourier dönüşümünü hesaplayın. İyi bir yeniden oluşturulmuş görüntü, her kanal için, bir çiçek gibi görüntü dönmek gerekir. Yeniden yapılandırıladaki görüntüler çiçek benzeri bir şekli yeniden oluşturamazsa, ham görüntülerden yeniden başlatın ve Wiener filtreleme, apodization ve sıfır sıra bastırma27gibi yeniden yapılandırma parametrelerini değiştirerek yeniden oluşturun. NIS yazılımında, parametrelerin değiştirilmesinin son çözülmüş görüntüyü nasıl etkilediğini izlemek için önizlemeyi kullanarak, parametreleri değiştirmek i) Aydınlatma Modülasyon Kontrastı, ii) Yüksek Çözünürlüklü Gürültü Bastırma ve iii) Odak Dışı Bastırma.
  3. Daha sonra, nanoj-SQUIRREL28kullanarak tarafsız bir şekilde eserler tespit etmek için yeniden oluşturulmuş görüntü analiz , süper çözülmüş görüntülerin kalitesini değerlendirmek için bir ImageJ tabanlı eklenti.
  4. NanoJ-SINCAP yapıları algılarsa, ham görüntülerden yeniden başlatın ve Wiener filtreleme, apodizasyon ve sıfır sıra bastırma gibi yeniden yapılandırma parametrelerini değiştirerek yeniden yapılandırın. NIS yazılımında, parametrelerin değiştirilmesinin son çözümlenmiş görüntüyü nasıl etkilediğini izlemek için önizlemeyi kullanarak, Aydınlatma Modülasyon Kontrastı, Yüksek Çözünürlüklü Gürültü Bastırma ve Odak Dışı Bastırma parametrelerini değiştirin.
  5. Ortak yerelleştirme profilini ve/veya Pearson ve Mander'in katsayılarını hesaplamak için süper çözümlenmiş görüntüleri kullanın.

7. Profil analizi ile birlikte yerelleştirme

NOT: Sinaptik belirteçler ve ilgi çekici bir protein arasındaki birlikte lokalizasyonu incelemek için ilk adım olarak, süper çözümlenmiş bir görüntü alın ve sinyal çakışmasını belirlemek için tek bir lokusu analiz edin.

  1. Süper çözümlenmiş görüntüde tek bir locus tanımlayın.
  2. İlgi çekirgelerinin floresan sinyallerinin yoğunluk profillerini elde edin.
  3. Verileri dışa aktarın.
  4. Tüm sinyal tepelerini normalleştirmek ve locus'a özgü eş yerelleştirmeyi belirlemek amacıyla her kanal için karşılaştırılabilir sinyal yoğunlukları elde etmek için GraphPad Prizma veya benzer bir analiz yazılımı kullanın.

8. Pearson ve Mander katsayıları quantification

NOT: Profil analizi tek lokus eş lokalizasyonu önermişse, Pearson ve Mander'in katsayıları29,30hesaplanarak tüm resmin daha genel bir analizi yapılabilir.

  1. Co-localizasyon iki parametre: Pearson ve Mander's: belirlemek için JACoP31kullanın , bir ImageJ eklentisi.

9. İstatistiksel analiz

  1. JACoP ile toplanan verileri işlemek için GraphPad Prizma'yı veya benzer bir analiz ve grafik yazılımLarını kullanın.
  2. Grafikleri elde etmek ve istatistiksel alaka düzeyi için analiz edilen her durum için en az 40 SIM görüntü kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada nöronal proteinlerin eş lokalizasyonunu incelemek için standart iş akışını sıyoruz. Önce mikroskobu kalibre ettik ve ardından numunelerin SIM analizini yaptık. Sistemi kalibre etmek için 0,1 m çapında floresan mikroküreler kullandık. Boncukların süper çözümlü 3D-SIM görüntüleri elde edildikten sonra, temel deki görüntü verileri, bunları uzamsal frekans gösterimine dönüştürmek için Fourier dönüştürülmüştür. Şekil 2A'da,farklı çiçek deseni süper çözünürlük ayrıntı düzeylerinin bir göste...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinapsın yapısını ve bileşimini açıklamak, hafıza ve bilişi düzenleyen fizyolojik ve patolojik süreçlerin anlaşılması için çok önemlidir. Normal durumda iken, sinapsbellek yapı taşları dır, onlar da Alzheimer hastalığı gibi karmaşık nörolojik bozukluklar altında yatan32. Burada açıklanan protokol sim adı verilen bir süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği ile nöronal proteinlerin birlikte lokalizasyonu çalışma için hizmet vermektedir. Sim, belirli bir aydınlatma deseni kullanarak, normalde 0,03 ile ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar edoardo Micotti'ye el yazmasına yönelik yapıcı eleştirileri için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma BrightFocus A2019296F, Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), Fondazione Regionale by la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) ve Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 0.4 Tripan mavisi çözeltisi Thermo Fisher Bilimsel15250061Kimyasal
70 & M filtresi Corning352350Equiment
AlexaThermo FisherBilimsel-Antikor
Antikoru SENP1Santa Cruzsc-271360Antikor
B27 EkYaşam Teknolojileri17504044Kimyasal
Sığır serum albümini Merck5470Kimyasal
CaCl2Merck Life Science21115
Kimyasal Odacıklı lamellerIbidi80826Equiment
DyLightThermo Fisher Scientific-Antikor
FBS (Hyclone)GIBCOSH3007002 (CHA1111L)Serum
FluoSpheres karboksilat ile modifiye edilmiş mikroküreler, 0.1 & mu; m, sarı– yeşil floresanThermo Fisher ScientificF8803Ekipman
GlikozMerck Yaşam BilimleriG8769Kimyasal
GlutamaxGIBCO35050061Kimyasal
HEPESMerck Yaşam BilimleriH3537Kimyasal
L-Cystein ve nbsp;Merck Yaşam Bilimleri C6852-25gKimyasal
MAP2MerckAB15452Antikoru
MEM Yaşam Teknolojileri21575022Orta
MgClMerck Yaşam BilimleriM8266Kimyasal
NaOHVWR Uluslararası1.091.371.000Kimyasal
Nörobazal AYaşam Teknolojileri10888022Orta
N-SIM Süper Çözünürlüklü MikroskopNikon-Instrument
PapainMerck Yaşam Bilimleri ve nbsp;P-3125Kimyasal
paraformaldehit Thermo Fisher Scientific28908Kimyasal
Kalem/Strep 10xYaşam Teknolojileri15140122Kimyasal
fosfat tamponlu tuzlu su Gibco10010023Kimyasal
Poli-L lizinSigmaP2636Kimyasal
ProLong Elmas Cam Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970Kimyasal
PSD95 ve nbsp;NeuroMabK28/43Antikor
Yuvarlak kapak camıTermo12052712Ekipmanları
SUMO1Abcamab32058Antikor
Sinaptofizin MerckS5768 antikor
Triton X-100 MerckT8787
Kimyasal Tripsin inhibitörü ve nbsp;Merck Yaşam Bilimleri T9003-500MGKimyasal

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
  2. Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
  3. McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
  4. Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
  5. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  6. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  7. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003(2018).
  8. Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644(2020).
  9. Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133(2019).
  10. Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
  11. Monro, T. Beyond the diffraction limit. Nature Photonics. 3 (7), 361(2009).
  12. Won, R. Eyes on super-resolution. Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).
  13. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290(2016).
  14. Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
  15. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  16. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  17. Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. Synaptopathy: dysfunction of synaptic function. Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).
  18. Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
  19. Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
  20. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
  21. Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
  22. Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803(2013).
  23. Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980(2016).
  26. Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915(2015).
  27. Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
  28. Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
  29. Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
  30. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
  31. Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
  32. Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
  33. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  34. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  35. Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
  36. Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
  37. Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
  38. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Super Resolution ImagingProtein Co LocalizationSynaptic MarkersPrimary NeuronsStructured Illumination MicroscopySIM ImagingConfocal MicroscopyMAP2 AntibodySynaptophysin PSD 95Image Analysis

Related Articles