Method Article

Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

DOI:

10.3791/61434

⸱

October 31st, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 2Department of Neuroscience, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 3Dulbecco Telethon Institute, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, primer nöronal kültürlerde protein ko-lokalizasyonunu incelemek için süper çözünürlüklü mikroskopinin nasıl yapılacağını göstermektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinapslar nöronların fonksiyonel elemanları dır ve bunların kusurları veya kayıpları çeşitli nörodejeneratif ve nörolojik bozuklukların temelinde dir. Görüntüleme çalışmaları fizyolojik ve patolojik koşullarda işlevlerini ve plastisitesini araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Büyüklükleri ve yapıları nedeniyle proteinlerin lokalizasyon çalışmaları yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri gerektirir. Bu protokolde, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanılarak süper çözünürlük düzeyinde sinaptik belirteçlerle hedef proteinlerin birlikte lokalizasyonu nun primer nöronlarda incelenmesi için bir prosedür tanımlıyoruz. SIM, geniş alan mikroskopisinin uzamsal çözünürlüğünü iki katına çıkararak yaklaşık 100 nm'lik bir detaya ulaşan desenli ışık aydınlatma tekniğidir. Protokol, sağlam eş yerelleştirme çalışmaları için gerekli denetimleri ve ayarları ve görüntüleme verilerini doğru analiz etmek için istatistiksel yöntemlere genel bakışı gösterir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anlayış ve sinaps görünümü 18971Yılında Foster ve Sherrington tarafından ilk açıklamasından bu yana büyük ölçüde değişti. O zamandan beri, nöronal iletişim bilgimiz ve arkasındaki moleküler süreçler katlanarak 2büyüdü. Bu sinapslar iki bölmeli bir sistem olarak düşünülebilir açık hale gelmiştir: nörotransmitterlerin salınımı için veziküller içeren bir pre-sinaptik bölmesi ve reseptörleri ile post-sinaptik bölmesi3. Bu basit görüş, son yirmi yıl içinde, sinyalizasyon 4içine bağlayıcı transduce için gerekli proteinlerin karmaşık bir ağ haline gelmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Birincil kültürler

  1. #1.5 (0.17 mm) kapak kalınlığı için objektif gereksinime uyan odalı kapaklı dudaklarda (Ibidi μ-Slide 8 Kuyu veya Nunc Lab-Tek Odalı Coverglass gibi) kültür faresi hipokampal primer nöronlar.
  2. 100 μL poli-L-lizin (100 μg/mL) ile paltolu kapaklar.
  3. Ertesi gün, steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez odalı kapakları yıkayın.
  4. Fare birincil nöronlar elde etmek için, P1-P4yavru23gelen hipokampi izole .
  5. Diseksiyon Media(Tablo 1)10 mL diseksiyon hipokampi yerleştirin ve onları tüpün altına yatırın.
  6. Steril bir pipet kullanarak, dikkatle Diseksiyon Me....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada nöronal proteinlerin eş lokalizasyonunu incelemek için standart iş akışını sıyoruz. Önce mikroskobu kalibre ettik ve ardından numunelerin SIM analizini yaptık. Sistemi kalibre etmek için 0,1 m çapında floresan mikroküreler kullandık. Boncukların süper çözümlü 3D-SIM görüntüleri elde edildikten sonra, temel deki görüntü verileri, bunları uzamsal frekans gösterimine dönüştürmek için Fourier dönüştürülmüştür. Şekil 2A'da,farklı çiçek deseni süper çözünürlük ayrıntı düzeylerinin bir göste.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinapsın yapısını ve bileşimini açıklamak, hafıza ve bilişi düzenleyen fizyolojik ve patolojik süreçlerin anlaşılması için çok önemlidir. Normal durumda iken, sinapsbellek yapı taşları dır, onlar da Alzheimer hastalığı gibi karmaşık nörolojik bozukluklar altında yatan32. Burada açıklanan protokol sim adı verilen bir süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği ile nöronal proteinlerin birlikte lokalizasyonu çalışma için hizmet vermektedir. Sim, belirli bir aydınlatma deseni kullanarak, normalde 0,03 ile .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar edoardo Micotti'ye el yazmasına yönelik yapıcı eleştirileri için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma BrightFocus A2019296F, Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), Fondazione Regionale by la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) ve Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK) tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 0.4 Tripan mavisi çözeltisi Thermo Fisher Bilimsel15250061Kimyasal
70 & M filtresi Corning352350Equiment
AlexaThermo FisherBilimsel-Antikor
Antikoru SENP1Santa Cruzsc-271360Antikor
B27 EkYaşam Teknolojileri17504044Kimyasal
Sığır serum albümini Merck5470Kimyasal
CaCl2Merck Life Science21115
Kimyasal Odacıklı lamellerIbidi80826Equiment
DyLightThermo Fisher Scientific-Antikor
FBS (Hyclone)GIBCOSH3007002 (CHA1111L)Serum
FluoSpheres karboksilat ile modifiye edilmiş mikroküreler, 0.1 & mu; m, sarı– yeşil floresanThermo Fisher ScientificF8803Ekipman
GlikozMerck Yaşam BilimleriG8769Kimyasal
GlutamaxGIBCO35050061Kimyasal
HEPESMerck Yaşam BilimleriH3537Kimyasal
L-Cystein ve nbsp;Merck Yaşam Bilimleri C6852-25gKimyasal
MAP2MerckAB15452Antikoru
MEM Yaşam Teknolojileri21575022Orta
MgClMerck Yaşam BilimleriM8266Kimyasal
NaOHVWR Uluslararası1.091.371.000Kimyasal
Nörobazal AYaşam Teknolojileri10888022Orta
N-SIM Süper Çözünürlüklü MikroskopNikon-Instrument
PapainMerck Yaşam Bilimleri ve nbsp;P-3125Kimyasal
paraformaldehit Thermo Fisher Scientific28908Kimyasal
Kalem/Strep 10xYaşam Teknolojileri15140122Kimyasal
fosfat tamponlu tuzlu su Gibco10010023Kimyasal
Poli-L lizinSigmaP2636Kimyasal
ProLong Elmas Cam Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970Kimyasal
PSD95 ve nbsp;NeuroMabK28/43Antikor
Yuvarlak kapak camıTermo12052712Ekipmanları
SUMO1Abcamab32058Antikor
Sinaptofizin MerckS5768 antikor
Triton X-100 MerckT8787
Kimyasal Tripsin inhibitörü ve nbsp;Merck Yaşam Bilimleri T9003-500MGKimyasal

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
  2. Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
  3. McAllister, A. K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Super Resolution ImagingProtein Co LocalizationSynaptic MarkersPrimary NeuronsStructured Illumination MicroscopySIM ImagingConfocal MicroscopyMAP2 AntibodySynaptophysin PSD 95Image Analysis

Related Articles