Bu protokol, primer nöronal kültürlerde protein ko-lokalizasyonunu incelemek için süper çözünürlüklü mikroskopinin nasıl yapılacağını göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Sinapslar nöronların fonksiyonel elemanları dır ve bunların kusurları veya kayıpları çeşitli nörodejeneratif ve nörolojik bozuklukların temelinde dir. Görüntüleme çalışmaları fizyolojik ve patolojik koşullarda işlevlerini ve plastisitesini araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Büyüklükleri ve yapıları nedeniyle proteinlerin lokalizasyon çalışmaları yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri gerektirir. Bu protokolde, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanılarak süper çözünürlük düzeyinde sinaptik belirteçlerle hedef proteinlerin birlikte lokalizasyonu nun primer nöronlarda incelenmesi için bir prosedür tanımlıyoruz. SIM, geniş alan mikroskopisinin uzamsal çözünürlüğünü iki katına çıkararak yaklaşık 100 nm'lik bir detaya ulaşan desenli ışık aydınlatma tekniğidir. Protokol, sağlam eş yerelleştirme çalışmaları için gerekli denetimleri ve ayarları ve görüntüleme verilerini doğru analiz etmek için istatistiksel yöntemlere genel bakışı gösterir.
Giriş
Anlayış ve sinaps görünümü 18971Yılında Foster ve Sherrington tarafından ilk açıklamasından bu yana büyük ölçüde değişti. O zamandan beri, nöronal iletişim bilgimiz ve arkasındaki moleküler süreçler katlanarak 2büyüdü. Bu sinapslar iki bölmeli bir sistem olarak düşünülebilir açık hale gelmiştir: nörotransmitterlerin salınımı için veziküller içeren bir pre-sinaptik bölmesi ve reseptörleri ile post-sinaptik bölmesi3. Bu basit görüş, son yirmi yıl içinde, sinyalizasyon 4içine bağlayıcı transduce için gerekli proteinlerin karmaşık bir ağ haline gelmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Birincil kültürler
- #1.5 (0.17 mm) kapak kalınlığı için objektif gereksinime uyan odalı kapaklı dudaklarda (Ibidi μ-Slide 8 Kuyu veya Nunc Lab-Tek Odalı Coverglass gibi) kültür faresi hipokampal primer nöronlar.
- 100 μL poli-L-lizin (100 μg/mL) ile paltolu kapaklar.
- Ertesi gün, steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez odalı kapakları yıkayın.
- Fare birincil nöronlar elde etmek için, P1-P4yavru23gelen hipokampi izole .
- Diseksiyon Media(Tablo 1)10 mL diseksiyon hipokampi yerleştirin ve onları tüpün altına yatırın.
- Steril bir pipet kullanarak, dikkatle Diseksiyon Me....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada nöronal proteinlerin eş lokalizasyonunu incelemek için standart iş akışını sıyoruz. Önce mikroskobu kalibre ettik ve ardından numunelerin SIM analizini yaptık. Sistemi kalibre etmek için 0,1 m çapında floresan mikroküreler kullandık. Boncukların süper çözümlü 3D-SIM görüntüleri elde edildikten sonra, temel deki görüntü verileri, bunları uzamsal frekans gösterimine dönüştürmek için Fourier dönüştürülmüştür. Şekil 2A'da,farklı çiçek deseni süper çözünürlük ayrıntı düzeylerinin bir göste.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Sinapsın yapısını ve bileşimini açıklamak, hafıza ve bilişi düzenleyen fizyolojik ve patolojik süreçlerin anlaşılması için çok önemlidir. Normal durumda iken, sinapsbellek yapı taşları dır, onlar da Alzheimer hastalığı gibi karmaşık nörolojik bozukluklar altında yatan32. Burada açıklanan protokol sim adı verilen bir süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği ile nöronal proteinlerin birlikte lokalizasyonu çalışma için hizmet vermektedir. Sim, belirli bir aydınlatma deseni kullanarak, normalde 0,03 ile .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar edoardo Micotti'ye el yazmasına yönelik yapıcı eleştirileri için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma BrightFocus A2019296F, Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), Fondazione Regionale by la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) ve Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.4 Tripan mavisi çözeltisi | Thermo Fisher Bilimsel | 15250061 | Kimyasal |
| 70 & M filtresi | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher | Bilimsel-Antikor | |
| Antikoru SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antikor |
| B27 Ek | Yaşam Teknolojileri | 17504044 | Kimyasal |
| Sığır serum albümini | Merck | 5470 | Kimyasal |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | |
| Kimyasal Odacıklı lameller | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific-Antikor | ||
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres karboksilat ile modifiye edilmiş mikroküreler, 0.1 & mu; m, sarı– yeşil floresan | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Ekipman |
| Glikoz | Merck Yaşam Bilimleri | G8769 | Kimyasal |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Kimyasal |
| HEPES | Merck Yaşam Bilimleri | H3537 | Kimyasal |
| L-Cystein ve nbsp; | Merck Yaşam Bilimleri | C6852-25g | Kimyasal |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antikoru |
| MEM | Yaşam Teknolojileri | 21575022 | Orta |
| MgCl | Merck Yaşam Bilimleri | M8266 | Kimyasal |
| NaOH | VWR Uluslararası | 1.091.371.000 | Kimyasal |
| Nörobazal A | Yaşam Teknolojileri | 10888022 | Orta |
| N-SIM Süper Çözünürlüklü Mikroskop | Nikon-Instrument | ||
| Papain | Merck Yaşam Bilimleri ve nbsp; | P-3125 | Kimyasal |
| paraformaldehit | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Kimyasal |
| Kalem/Strep 10x | Yaşam Teknolojileri | 15140122 | Kimyasal |
| fosfat tamponlu tuzlu su | Gibco | 10010023 | Kimyasal |
| Poli-L lizin | Sigma | P2636 | Kimyasal |
| ProLong Elmas Cam Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Kimyasal |
| PSD95 ve nbsp; | NeuroMab | K28/43 | Antikor |
| Yuvarlak kapak camı | Termo | 12052712 | Ekipmanları |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antikor |
| Sinaptofizin | Merck | S5768 | antikor |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Kimyasal Tripsin inhibitörü ve nbsp; | Merck Yaşam Bilimleri | T9003-500MG | Kimyasal |
Kaynaklar
- Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
- Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- McAllister, A. K.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
