Birincil Murine Hipokampal Nöronlarda Majör Histocompatibility Complex Class I'in Akış Sitometrisi ile İfadesinin Değerlendirilmesi

Summary

Bu protokol, embriyonik fare beyninden birincil hipokampal nöronları kültleme için bir yöntem açıklanmaktadır. Kültürlü nöronların hücre dışı yüzeyinde majör histocompatibility complex class I'in ekspresyolü daha sonra akış sitometrik analizi ile değerlendirilir.

Abstract

Artan kanıtlar, nöro-immün etkileşimlerin hem homeostatik hem de patolojik koşullarda sinir sistemi işlevini etkilediği hipotezini desteklemektedir. Majör histocompatibility complex class I'in (MHCI) iyi çalışılmış bir işlevi, hücre türevi peptitlerin adaptif bağışıklık sistemine, özellikle enfeksiyona yanıt olarak sunulmasıdır. Daha yakın zamanda, MHCI moleküllerinin nöronlar üzerindeki ekspresyonunun, normal gelişim ve nörolojik bozukluklar sırasında sinaptik bağlantıdaki aktiviteye bağlı değişiklikleri modüle edebileceği gösterilmiştir. Bu fonksiyonların beyin sağlığı için önemi, nöronlar üzerinde MHCI ekspresyonunu kolayca tespit eden hassas bir test ihtiyacını desteklemektedir. Burada murine hipokampal nöronların birincil kültürü için bir yöntem ve daha sonra akış sitometrik analizi ile MHCI ekspresyonunun değerlendirilmesi için bir yöntem açıklıyoruz. Murine hipokampus embriyonik gün 18 prenatal fare yavru mikrodissected. Doku, enzymatic ve mekanik teknikler kullanılarak tek bir hücre süspansiyonuna ayrışır, daha sonra nöronal olmayan hücrelerin büyümesini sınırlayan serumsuz bir ortamda kültüre edilir. 7 gün in vitrodan sonra kültürlü hücreler farmakolojik olarak beta interferon ile tedavi ederek MHCI ekspresyonu uyarılır. MHCI molekülleri floresan etiketli bir antikor ile yerinde etiketlenir, daha sonra hücreler enzmatik olmayan bir şekilde tek bir hücre süspansiyonuna ayrışır. Nöronal kimliği doğrulamak için hücreler paraformaldehit ile sabitlenir, permeabilize edilir ve nöronal nükleer antijen NeuN'u tanıyan floresan etiketli bir antikorla etiketlenir. MHCI ekspresyotiği daha sonra akış sitometrik analizi ile nöronlar üzerinde ölçülür. Nöronal kültürler, belirli hipotezleri test etmek için genetik değişiklikler veya farmakolojik müdahalelerle kolayca manipüle edilebilir. Hafif değişikliklerle, bu yöntemler diğer nöronal popülasyonları kültüre etmek veya diğer ilgi çekici proteinlerin ekspresyonlarını değerlendirmek için kullanılabilir.

Introduction

Merkezi sinir sisteminin (CNS) bir zamanlar "bağışıklık ayrıcalıklı^1"olarak adlandırılan bağışıklık gözetiminden yoksun olduğu düşünülüyordu. Bu ayrıcalığın bağışıklık bileşenlerinin mutlak yokluğuna eşit olmadığı, aksine, immünopatoloji ile ilişkili hasarı sınırlamak için işlev gören özel bir düzenleme olduğu açıktır¹. Aslında, CNS ve bağışıklık sistemi arasındaki iletişim, sağlıklı beyin gelişimi ve enfeksiyonlara yanıt için gerekli olan devam eden bir konuşmadır^2,3.

Majör histocompatibility complex sınıf I (MHCI) molekülleri, enfeksiyon sırasında CD8⁺ T hücrelerine antijenik peptitlerin sunulmasındaki işlevleriyle bilinen polijenik ve polimorfik transmembran proteinleridir^4. Klasik MHCI kompleksleri transmembran α zinciri ve β2-mikroglobulin adı verilen hücre dışı bir ışık zincirinden oluşur. α zinciri, sunum için antijenik bir peptit bağlayan polimorfik bir oluk içerir⁵. MHCI'nın hücre dışı membran üzerinde doğru ifadesi, yüksek benzeşimli peptit ligand^5'inyüklenmesiyle birlikte α zinciri ve β2 mikroglobulinin düzgün bir şekilde katlanmasını sağlamak için endoplazmik retikülumdaki moleküler refakatçilerin koordineli bir şekilde hareket etmesini gerektirir. Mhci kompleksleri bir araya getirildikten sonra, endoplazmik retikülükten plazma membran^6'yaihraç edilir. Kognate T hücre reseptörünün peptit yüklü MHCI kompleksi ile angajmanı üzerine, CD8⁺ T hücreleri, perforin ve granzim içeren litik granülleri serbest bırakarak veya hedef hücre zarı üzerindeki Fas reseptörü bağlama yoluyla kesme ilamsını indükleyerek hücre öldürmeye aracılık eder⁷. Ek olarak, CD8⁺ T hücreleri, sitopatik etkileri olmadan enfekte hücrelerde antiviral mekanizmaları aktive ürkütebilen gama interferonu (IFNφ) ve tümör nekroz faktörü alfa (TNFα) gibi sitokinler üretir^8,9. Birçok nörotropik virüs için, CD8⁺ T hücreleri enfeksiyonu CNS^{10 , 11,12}'den temizlemek için gereklidir.

Daha önce nöronların MHCI'yı sadece hasar, viral enfeksiyon veya in vitro sitokin stimülasyonu ile ifade ettiği düşünülüyordu. Son zamanlarda, araştırmalar mhci nöronal ekspresyotiği için sinaptik remodeling ve plastisitede bir rol belirlemiştir^13,14. Sinaps düzenlemesinin altında kalan kesin mekanizmalar iyi anlaşılmasa da, veriler MHCI ifade düzeyinin sinaptik aktivite^15,16ile düzenlendiğini göstermektedir. Bir hipotez, nöronların, MHCI'yi transiplaptik olarak^bağlayanimmünoglobulin benzeri reseptör B 'yi (PirB) presynaptik olarak ifade ettiğini öne^{sürmektedir.} Bu etkileşim, PirB tarafından sinaptik yeniden şekillendirmede yer alan yollara karşı çıkan bir sinyal basamaklama başlatır, böylece sinaptik bağlantıyı güçlendirir ve stabilize eder^17,18,19. Nöronal aktivitenin yokluğunda, MHCI ekspresyasyonu¹⁴azalır ve MHCI kaybı kusurlu sinaps eliminasyonu ve yanlış düzenlenmiş sinaptik devreler^20,21ile sonuçlanır.

Burada açıklanan ve Chevalier ve ark.^9'danuyarlanan test, MHCI'nın murine hipokampal nöronların birincil kültürleri üzerindeki hücre dışı protein ekspresyonını nicel olarak değerlendirmek için akış sitometrik analizini kullanır. Bu protokol, embriyonik fare yavrularından hipokampal dokuyu mikrosekse etmek için ilk teknikleri göstermektedir. Daha sonra dokunun tek bir hücre süspansiyonuna enzipmatik ve mekanik ayrışması için süreçleri ve kültürleri in vitro olarak koruma yöntemlerinidetaylandırıyor. Bölünmedikleri için, kültüre girdikten sonra, nöronlar deneysel uç noktalarına uygun bir tabakta ve yoğunlukta kaplanmalıdır. Daha sonra, beta interferon (IFNβ) ile MHCI ekspresyonını indükleme, MHCI ve nöronal çekirdek belirteci NeuN için immünoplabeling ve akış sitometrisi ile hücreleri analiz etme adımlarını özetler. Son olarak, MHCI pozitif nöronları tanımlamak ve MHCI ekspresyonunun seviyesini ölçmek için akış sitometri verilerini değerlendirme prosedürlerini açıklar. Ayrıca bu protokolde, hipokampal nöronlara ek olarak veya bunun yerine kortikal nöronları kültüre etmek için yapılabilecek küçük ayarlamalar da belirtilmektedir. Bu protokol, genetik varyasyonlar veya farmakolojik tedaviler kullanılarak belirli hipotezleri test etmek için kolayca değiştirilebilir.

Protocol

Tüm prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerilere uygun olarak ve Hayvanları İçeren Biyomedikal Araştırmalar için Uluslararası Rehberlik İlkelerine göre gerçek gerçekleştirildi. Protokol, Charlotte Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nde (Protokol #19-020) Kuzey Carolina Üniversitesi tarafından onaylandı.

1. Kültüre hazırlık

NOT: Bu işlemler doku kültürüne göre belirlenmiş bir biyogüvenlik kabininde steril koşullarda yapılmalıdır. Medya ve çözümler için Tablo 1'e bakın.

1. Kendinden sızdırmaz sterilizasyon torbalarında otoklavlayarak tüm diseksiyon aletlerini sterilize edin.
2. 12 kuyulu kültür yemeklerinin tedavisi için poli-D-lizin çalışma stoklarını hazırlayın.
   1. Poli-D-lizini 1x borat tamponunda 100 μg/mL (10x konsantre) konsantrasyonda çözün. Yaklaşık 1 mL aliquots'u ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın.
   2. DPBS'de 10x konsantre poli-D lizin'i 10 μg/mL 'ye (1x) seyreltin ve sterilize edin.
   3. 12 kuyulu kültür plakalarını 1x poli-D-lizin kuyusu başına 0,5 mL ile oda sıcaklığında en az 1 saat veya ertesi gün kullanmak için bir gecede tedavi edin. Poli-D-lizin hacminin kültür alanının altını tamamen kaplayacak kadar yeterli olduğundan emin olun.
   4. Kullanımdan hemen önce, poli-D-lizini kültür plakasından çıkarın, steril suda 3x durulayın ve hücreleri kaplamaya hazır olana kadar steril suda saklayın. Hücreleri kaplamadan önce tüm sıvı izlerini kapsamlı bir aspirasyonla çıkarın.
3. Neuron Growth Media ve FACS tamponu hazırlayın. Sterilize edin ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın. Nöron Büyüme Ortamı yaklaşık 2 wks boyunca tutulabilir; FACS arabelleği yaklaşık 4 wks boyunca saklanabilir.

2. Embriyonik hipokampüsün diseksiyonu

NOT: Bu işlem, menenjitlerin giderilmesi ve hipokampüsün mikro diseksiyonu için stereo mikroskop kullanılmasını gerektirdiğinden tezgahta yapılabilir. Olası kontaminasyonu en aza indirmek için katı aseptik tekniğe uyun.

1. Embriyonik 18. günde co₂ odasında zamanlanmış hamile bir C57BL/6J dişi fareyi ötenazi edin.
2. Karın derisini ve kürkü % 70 EtOH ile püskürtün, ardından cildi doku asaları ile sıkıştırın ve cerrahi makasla küçük kesi yapın. İç organları ve uterusun ortaya çıkması için peritonları kuluçkaya yatırın.
3. Uterusun standart desenli tokmaklarla kavrayın, boşluktan kaldırın ve mesometrium bağlantısını ince makasla kesin. Embriyolu uterusun buza yerleştirilen 100 mm steril plastik kültür çanaklarına aktarılması.
4. İnce makas ve ince tokmaklar kullanarak uterusun dikkatlice kesilmesi ve embriyoların serbest bırakılması için embriyonik keseciklerin çıkarılması. Embriyoları buza yerleştirilen dPBS içeren 100 mm steril plastik kültür kabına aktarın.
5. İnce makas kullanarak embriyonik yavruların kafasını kopar ve kafaları buza yerleştirilmiş Hibernate-E ortamı içeren yeni 100 mm steril plastik kültür kabına aktarın.
6. Beyni çıkarmak için, bir elinde bir çift ince tokmak ile başı tutun. Kavisli Dumont #7 önps kullanarak, kafatasının tabanınaps ucunu yerleştirin ve kemiği kıstırın ve beyni delmeden ön çizgi boyunca hareket eden cildi aşırı sıkıştırın.
7. Kavisli tokalar kullanarak beyni açığa çıkarmak için deriyi ve kafatasını ayırın. Beynin altındaki kavisli tokaları açıkta kalan koku ampulünden beyinciklere süpürerek beyni kafatasından çıkar. Beyni, buza yerleştirilmiş Hibernate-E ortamını içeren 100 mm steril plastik kültür kabına aktarın. Her beyin için tekrarlayın.
   NOT: Deneye özgü amaçlar için ayrı olmak gerekmedikçe tüm beyinler tek bir kültür çanasında toplanabilir.
8. Stereo diseksiyon mikroskobu altında, aynı anda bir beyin ve iki çift steril Dumont #5 toka ile çalışmak, koku ampullerini çimdiklemek ve menenajları çekmek. Menenjitlerin iyice çıkarılması, diğer hücreler tarafından kültür kirlenmesini önlemek ve daha fazla diseksiyona izin vermek için gereklidir.
9. Menenjitler düzgün bir şekilde çıkarıldıktan sonra, korteksin üst tarafı yanal olarak açılır ve bu da hipokampusu açığa çıkarır. Dumont #5 tokalarını kullanarak hipokampusu ekli korteksten uzaklaştırın ve izole hipokampusu buz üzerinde 5 mL Hibernate-E ortamı içeren steril 15 mL konik bir tüpe dikkatlice aktarın.
10. Her embriyonik fare yavrusu için her iki beyin yarımküresi için diseksiyonu tekrarlayın ve deneye özel amaçlar için ayrı ayrı gerekmedikçe tüm hipokampileri tek bir 15 mL konik tüpte birleştirin.
    1. Kortikal nöronları kültüre etmek için korteks alt metinden ayrılabilir ve hipokampal nöronlarla aynı şekilde işlenebilir.
       NOT: Bu noktada, protokol duraklatılabilir. B27 ile desteklenmiş Hibernate-E ortamında beyinleri veya parçalanmış hipokampileri saklayın (%2) 1 aya kadar 4 °C'de, ancak uzatılmış gecikme canlı hücre sayısını tehlikeye atabilir.

3. Hipokampal nöronların ayrıştırıcı ve kültlü

NOT: Tüm işlemler steril koşullarda biyogüvenlik kabininde doku kültürüne göre yapılmalıdır.

1. Hipokampal ayrışma için embriyo başına 0,5 mL papain ayrıştırma çözeltisi hazırlayın. İhtiyaç duyulan ayrışma çözeltisinin hacmi, parçalanan embriyonik beyin sayısına bağlı olarak değişecektir.
   NOT: Kortikal nöron kültürü için embriyo başına 1,0 mL papain çözeltisi hazırlayın.
   1. Yaklaşık 3 dakika boyunca girdap yaparak Hibernate E ortamının 1 mL'si başına 20 μL papain süspansiyonu çözün.
   2. Papain çözüldükten sonra, çözeltinin 1 mL'si başına 1 μL DNase I ekleyin. Enzimi devre dışı bırakabileceğinden, I. Danoz eklendikten sonra çözeltiyi girdap etmeyin.
2. Santrifüj 15 mL konik tüp hipokampal doku içeren (adım 2.10) 1,000 x g 5 dakika boyunca. Üstnatanı çıkarın ve papain çözeltisi ekleyin. Birkaç kez ters çevirerek dokuyu yeniden dirsin. 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırarak, her 10 dakikada bir dokuyu yeniden canlandırmayı tersine çevirin.
   1. Kortikal nöronları kültlüyorsanız, tüm kortikalleri yeni bir 100 mm steril kültür çanağine aktarın, plakadan medyayı dikkatlice aspire edin ve ince makas veya jiletle kıyma dokusu. Kültür çanağına papain çözeltisi ekleyin ve steril bir transfer pipeti kullanarak papain çözeltisi ile kortikal dokuyu 15 mL konik tüpe aktarın. 37 °C'de 30 dakika boyunca her 10 dakikada bir ajite olan doku ve enzim çözeltisinin kuluçkaya yatır.
3. 30 dakikalık inkübasyon sırasında, 3 yangın cilalı cam Pasteur pipet hazırlayın: 1 tamamen açık, 1 yarı açık ve 1 çeyrek açık.
4. 30 dk inkübasyondan sonra, sindirilmiş beyin dokularını içeren 15 mL konik tüpü 10 dakika boyunca 125 x g'da santrifüj edin. Enzim çözeltisini çıkarın ve eşit miktarda taze Hibernate E ortamı ile değiştirin.
5. Tamamen açık Pasteur pipet kullanarak, dokuyu 10x üçleme. Dokunun 2 dakika yerleşmesine izin verin, ardından süpernatan hücre süspansiyonu steril 50 mL konik tüpe aktarın. Dokuya eşit miktarda Hibernate E ortamı ekleyin.
6. Yarı açık Pasteur pipet kullanarak, üçleme dokusu 10x. Dokunun 2 dakika yerleşmesine izin verin, ardından süpernatan hücre süspansiyonu önceki adımda olduğu gibi aynı 50 mL konik tüpe aktarın. Dokuya eşit miktarda Hibernate E ortamı ekleyin.
7. Çeyrek açık Pasteur pipet kullanarak, üçleme dokusu 10x. Dokunun 2 dakika yerleşmesine izin verin, ardından süpernatan hücre süspansiyonu tekrar önceki adımlarda olduğu gibi aynı 50 mL konikine aktarın. Ayrışmamış kalan dokuları atın.
8. Hücre süspansiyonundan süpernatantı içeren 50 mL konik tüpü 5 dakika boyunca 125 x g'da santrifüj edin. Henüz yapılmamışsa, poli-D-lizin kaplı plakaları steril suyla yıkayın ve santrifüjleme sırasında tüm sıvı izlerini iyice aspirasyonla temizleyin.
9. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve hücre peletini 5 mL Nöron Büyüme Ortamı'nda yeniden dirildi. Trippan mavisi ve hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.
   1. Kortikal nöronları kültlüyorsanız, daha az yoğun hücreler ve daha doğru sayım için en az 10 mL Nöron Büyüme Ortamı ekleyin.
10. Ml başına 5 x 10 5 uygulanabilir hücrenin son kaplama yoğunluğu için hücreleri Nöron Büyüme Ortamı ile seyreltin ve 12 kuyu plakasının her kuyusuna 1 mL seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin. %5 CO₂ile nöronları 37 °C'de koruyun.
    NOT: Tipik olarak, 1 embriyonik fare beyninden hipokampi, yani 2 hipokampi, yaklaşık 1 x 10⁶ canlı hücre verir. Bu sayı yalnızca deneme planlaması amacıyla sağlanır ve her kültür için hücreleri saymak için bir ikame olarak düşünülmemelidir.
11. Her kuyudan medya hacminin yarısını, yani 0,5 mL'yi kaldırarak kültürden sonraki gün büyüme medyasını değiştirin ve kültürlü hücreleri bozmamak için kuyunun kenarına eşit miktarda taze ortam ekleyin. Kültürün ömrü boyunca haftada iki kez yarım medya değişikliklerini tamamlayın.

4. MHCI ekspresyonlarının akış sitometrisi ile değerlendirilmesi

1. Interferon beta (IFNβ) veya Nöron Büyüme Ortamı'nda eşit miktarda seyrelterek tedaviyi hazırlayın. Medya değişikliği yarım hacimli bir değişiklik olacağından, 2x konsantre IFNβ ile tedavi ortamı hazırlayın. yani, 100 U/mL IFNβ ile 12 kuyu plakasının 3 kuyusunun tedavisi için, 200 U/mL IFNβ ile 1,5 mL veya medya ile tedavi edilen kontroller için eşit hacimde IFNβ seyreltici hazırlayın.
2. Her nöron kuyusundan 0,5 mL çıkarın ve her kuyuya IFNβ olsun veya olmayın 0,5 mL Nöron Büyüme Ortamı ekleyin. Deneysel koşullara ve sinyal optimizasyonuna bağlı olarak_6-72saat boyunca normal büyüme koşullarında (%37 °C, %5 CO 2) kuluçkaya yatın.
3. Tedavi süresinden sonra, tüm kültür medyasını çıkarın ve takviyeleri olmayan soğuk Nörobasal medyada bir kez hafifçe yıkayın (B27, L-glutamin, Pen-Strep).
4. Her kuyuya 1 μg/mL Fc bloğu ve 1 μg/mL floresan konjuge anti-MHCI antikoru içeren 0,5 mL takviyesiz soğuk Nörobakal ortam ekleyin. 4 °C'de kuluçkaya yatarak 45 dakika boyunca ışıktan korunsun.
5. Antikor içeren ortamı çıkarın ve soğuk dPBS'de bir kez dikkatlice yıkayın. Her kuyuya 0,5 mL oda sıcaklığı enzimsiz hücre ayrıştırma tamponu ekleyin ve hücreleri yerinden çıkarmak için ajite edin. Ters doku kültürü mikroskobu kullanarak ayrışmalara dikkat edin.
6. Hücreler kültür çanaktan ayrıldıktan sonra, her kuyuya 0,5 mL FACS arabelleği ekleyin, kümeleri dağıtmak için hücreleri üç katına çıkarın ve her kuyunun toplam hacmini tek tek 1,7 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
7. 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj. Süpernatant çıkarın, hücre peletini 100 μL FACS tamponunda yeniden çıkarın ve her tüpün toplam hacmini 96 kuyu U-alt plakasının ayrı kuyularına aktarın.
8. Her kuyuya 100 μL sabitleyici reaktif ekleyin. Hücrelerin topaklanmaması için birkaç kez tritüre edin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatsın.
9. 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj. 200 μl FACS arabelleği içinde süpernatant ve resuspend çıkarın.
10. 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj. Her kuyuya floresan konjuge anti-NeuN antikoru (1:100 seyreltme) içeren 100 μL permeabilizasyon reaktifinde süpernatantı ve resüspend'i çıkarın. İyice karıştırın, ardından 20 dakika boyunca sallanan ışıktan korunan oda sıcaklığında kuluçkaya yatın.
11. Kuluçkadan sonra, 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj. 100 μL FACS arabelleği içinde süpernatant ve resuspend çıkarın. 2x'i tekrarlayın.
12. Son yıkamadan sonra, hücreleri 100 μL%2 paraformaldehit içinde FACS tamponunda seyreltilir. Hücrelerin topaklanmasını önlemek için iyice karıştırın. Bir akış sitometresinde okumaya hazır olana kadar ışıktan korunan 4 °C'de saklayın. Örnekleri 1 hafta içinde en kısa sürede okuyun.

5. Verilerin ölçülmesi ve değerlendirilmesi

1. Her floresan boya için kompanzasyon kontrollerini ölçün ve spektral çakışmaları düzeltin. İdeal kompanzasyon kontrolleri, el altından, sadece ANTI-MHCI ile lekelenmiş ve sadece Anti-NeuN ile lekelenmiş kültürlü nöronları içerir.
2. Mümkünse, her örnek için 100.000 olay kaydedin (en az 10.000) ve FCS dosyaları olarak kaydedin.
3. Verileri analiz etmek için, uygun analiz yazılımını kullanarak, NeuN pozitif nöronları seçmek için Şekil 1A-C'de gösterildiği gibi sıralı kapılar kurun.
   1. SSC-A (günlük) ve FSC-A (doğrusal) çizin. Analizden hücresel kalıntıları ortadan kaldırmak için hücresel popülasyona (P1) bir kapı çizin.
   2. P1 hücresel popülasyonu içinde FSC-H (doğrusal) ve FSC-A (doğrusal) grafiğini çizin. Tek hücreli nüfusa bir kapı çizin.
   3. Tek hücre popülasyonu içinde, SSC-A (günlük) vs NeuN (günlük) çizin. Kılavuz olarak ellenmemiş veya yalnızca MHCI lekeli hücreler kullanarak NeuN pozitif popülasyona bir kapı çizin.
   4. Y ekseninde moda normalleştirilmiş hücresel olaylarla MHCI floresan histogramı çizin. Kılavuz olarak sadece lekelenmemiş veya NeuN lekeli nöronları kullanarak, MHCI için pozitif olan nöronların yüzdesini ölçmek için yatay bir kapı çizin.
   5. MHCI için pozitif yüzde hücrelerin yanı sıra istatistiksel değerlendirme ve grafik çizim için NeuN pozitif popülasyonda MHCI için ortanca floresan yoğunluğunu (MFI) dışa aktarın.

Results

Burada sunulan prosedür kullanılarak embriyonik 18. Doku, enzymatic ve mekanik yöntemler kullanılarak tek bir hücre süspansiyonuna ayrıştırıldı, daha sonra poli-D-lizin ile önceden tedavi edilen 12 kuyu plakasında kültürlendi. 7 günlük in vitrodan sonra, hücreler sadece 72 saat boyunca 100 U/mL IFNβ veya media ile tedavi edildi ve bu da MHCI ekspresyonunun uyarılmasıydı. Nöronlar, enzmatik olmayan bir şekilde tek bir hücre süspansiyonuna dönüşmeden önce MHCI için yerinde boyandı. Nöronlar sabitlendi ve permeabilize edildi, daha sonra nöronal çekirdek belirteci NeuN için hücre içi lekelendi. Örnekler akış sitometrisi ile değerlendirildi ve veriler ilişkili yazılım kullanılarak analiz edildi. Nöronlar, hücresel döküntüleri ve çiftleri dışlamak için toplam olayların sıralı gating yoluyla tanımlanmıştır (Şekil 1A,B). Nöronlar kesin olarak NeuN-pozitiflik ile tanımlanmıştır (Şekil 1C). NeuN⁺ hücreleri, y eksenindeki moda normalleştirilmiş hücre sayısı ve x eksenindeki MHCI floresan ile bir histogramdaki hücreler çizilerek MHCI pozitifliği açısından daha fazla analiz edildi. Pozitif ve negatif zirvelerin ayrıştığı noktada bir MHCI⁺ kapısı çizildi (Şekil 1D). Bundan, MHCI boyama için pozitif nöronların yüzdesi (Şekil 1E) ve ortanca floresan yoğunluğu (MFI; Şekil 1F) hesaplandı. Sonuçlar, IFNβ tedavisinin MHCI'nın hücre dışı lekelenme için pozitif nöron yüzdesini ve MFI tarafından belirtildiği gibi ifade seviyesini önemli ölçüde yükselttiğını göstermektedir. İstatistiksel analiz ve grafiksel gösterim, piyasada bulunan istatistiksel yazılım kullanılarak yapıldı.

Şekil 1: Temsili gating stratejisi ve MHCI nicelemesi.
Primer hipokampal nöronlar sadece IFNβ veya media 100 U/mL ile tedavi edildi. 72 saat sonra, nöronlar Pasifik Mavi konjuge MHCI (1 μg/mL H2-K^b),daha sonra PE-konjuge NeuN (1:100 seyreltme) ile hücre içi olarak etiketlendi. Hücresel floresan akış sitometrisi ile değerlendirildi ve veriler analiz edildi. (A) Toplam olaylar SSC-A (günlük) vs FSC-A (doğrusal) olarak çizildi ve hücreler (P1) enkaz dışlamak için kapılıydı. (B) P1 popülasyonu içinde, hücreler tek hücre popülasyonu geçidi için FSC-H (doğrusal) vs FSC-A (doğrusal) olarak çizildi. (C) Tek hücre popülasyonu içinde hücreler SSC-A (log) vs NeuN-PE (log) olarak çizildi. NeuN⁺ hücreleri nöronları tanımlamak için kapılıydı. (D) Nöron popülasyonu içinde hücreler x ekseninde MHCI-PacBlu ile bir histogram üzerinde çizildi ve hücre sayıları y ekseninde moda normalleştirildi. MHCI lekeleme için pozitif nöronların yüzdesini ölçmek için yatay bir kapı çizildi. (E) Sadece medyada ve IFNβ ile tedavi edilen nöronlarda NeuN⁺ hücrelerinin yüzde MHCI⁺ miktarının ölçülmesi. (F) Medya (siyah) ve IFNβ ile tedavi edilen (kırmızı) nöronlardaki NeuN⁺ hücrelerinde MHCI'nın ortanca floresan yoğunluğunun (MFI) ölçülmesi. İstatistiksel önem, eşleşmeyen t testi ile hesaplandı. **, P < 0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Nöron Büyüme Ortamı (50 ml)
reaktif	Son Konsantrasyon	Stok Konsantrasyonu	50 ml için
B27 eki	2%	100%	1,0 ml
L-glutamin	2 mM	200 mM	0,5 ml
Penisilin-Streptomisiin	100 U/ml	10.000 U/ml	0,5 ml
Nörobakal medya			48,0 ml
FACS arabelleği (500 ml)
reaktif	Son Konsantrasyon	Stok Konsantrasyonu	500 ml için
Fetal Sığır Serumu	2%	100%	10 ml
Edta	1 mM	500 mM	1 ml
dPBS			489 ml
Papain Ayrışma Çözümü
reaktif	Son Konsantrasyon	Stok Konsantrasyonu	1 ml için
Papain Süspansiyon	20 U/ml	1000 U/ml	0.020 ml
DNase I	2,5 U/ml	2500 U/ml	0.001 ml
Hazırda Beklet-E			1,0 ml
Not: İhtiyaç duyulan Papain Ayrıştırma Çözeltisi'nin hacmi, parçalanan embriyonik beyin sayısına bağlı olarak değişecektir. Hipokampal nöronlar için beyin başına 0,5 ml veya kortikal nöronlar için beyin başına 1,0 ml hazırlayın.
Not: Hibernate-E'de papain süspansiyonunu yaklaşık 3 dakika boyunca girdaplayarak ayrışma çözeltisi hazırlayın. Papain iyice çözüldükten sonra, DNase I ekleyin. Girdap DNase I.

Tablo 1: Medya ve çözümler.

Discussion

Bu protokol embriyonik 18. günde doğum öncesi fare yavrularından primer hipokampal nöronların diseksiyon ve kültürünü açıklar. Kemirgenlerden kültürlenmiş birincil nöronların kullanımı, modern nörobiyolojide geliştirilen en temel metodolojilerden biridir²². Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları nöronların belirli yönlerini modelleyebilse de, tümör türevi hücreler olarak doğaları, tanımlanmış aksonların geliştirilememesi ve hücre bölünmesinin devam etmesi, mitotik nöronların özelliklerini in vivo^23'tesadık bir şekilde yeniden toplayıp toplamadıkları konusunda şüphe uyandırır. Primer nöronlara bir diğer alternatif de insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (HiPSC) kullanılmasıdır. HiPSC'leri kullanma teknolojisi, özellikle hasta kaynaklı olanlar, son yıllarda hızla ilerlemiştir²⁴. Bununla birlikte, hücre hatları arasındaki değişkenlik, fonksiyonel olgunluk eksikliği ve epigenetik profillerdeki farklılıklar da dahil olmak üzere HiPSC'lerle çalışmanın hala sınırlamaları vardır²⁵. Birincil kemirgen nöronlarının indirgemeci modeliyle çalışmanın sınırlamaları da olsa, kültürlü nöronlar in vivo nöronların mitotik sonrası doğasını korur. Ayrıca, fareler için mevcut olan geniş moleküler biyoloji araçları ve genetik değişiklikler, birçok uygulama için HiPSC'lere göre birincil nöronların kullanılmasını tercih eder ve fare çalışmaları deneysel genetik sistemi kaybetmeden daha karmaşık in vivo organizmaya kolayca çevrilebilir. Bu nedenlerden dolayı, birçok araştırmacı, araştırmalarının toplu olmasa da temel yönlerini doğrulamak için birincil kemirgen nöronlarını kullanır.

Bazı tahliller için, nöronlar doğrudan beyin eks vivo izolasyonundan sonra analizedilebilir. Bu, belirli deneysel koşullara maruz kalabilen veya birden fazla hücre tipinin etkileşimlerine bağlı olabilecek yetişkin fareleri içeren deneyler için özellikle arzu edilir; ancak, yapılabilecek analizlerin türünü sınırlayan birkaç konu vardır. Nöronların yetişkin farelerin beyinlerinden tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak teknik olarak zordur, çünkü nöronlar benzersiz bir şekilde birbirine bağlıdır ve miyelin²⁶ile kaplanır. Doku tritürasyonunun enzymatik olmayan yöntemleri, dokuyu ayırmada ve hücre ölümüne neden olmakta verimsizdir, oysa enzymatik preparatlar genellikle hücre yüzeyi antijenlerini ayırır²⁷. Ayrıca, miyelin embriyonik farelerde büyük ölçüde bulunmamakla birlikte, yetişkin beyninin yaklaşık% 20'sini oluşturur ve canlı hücre izolasyonuna engel olabilir ve akış sitometrisi analizini²⁸. Geliştirilen tekniklerin çoğu nihayetinde sitozollerinin nöronlarını soyun ve öncelikle çekirdek^29'danoluşan küçük, yuvarlatılmış hücre gövdeleri bırakın. Bu bazı analizler için kabul edilebilir olsa da, sitoplazmik veya hücre dışı protein ekspresyonlarını ölçmek için uygun değildir. Ayrıca, indirgemeci hücre kültürü sistemi, belirli mekanistik soruların in vivo sistemle sık karşılaşılandan daha kısa bir zaman ölçeğinde test edilir.

Ayrıca bu protokolde, MHCI ekspresyonunun IFNβ ile farmakolojik olarak uyarılması ve hücre dışı MHCI ekspresyonunun akış sitometrisi ile ölçülmesi yöntemleri açıklanmaktadır. IFNβ tarafından stimülasyon diğer deneysel durumları test etmek için yararlı bir pozitif kontroldür, ancak IFNφ ve kainic asidin nöronlarda MHCI ekspresyonunu da uyarabileceği belirtilebilir^9,30, tetrodotoxin ise MHCI ekspresyonunu azaltır¹⁴. MHCI ekspresyonunu tespit etmek için önceki yöntemler in situ hibridizasyon ve immünohistokimyasal analiz^{14,15,20,31 'e}dayanıyordu. In situ hibridizasyon ve qRT-PCR gibi mRNA tabanlı tahliller mekansal lokalizasyonu, hücre tipi özgüllüğünü ve gen transkripsiyon seviyelerini belirleyebilirken, bu tahliller protein çevirisini veya plazma zarı için taşımayı değerlendiremez. İmmünistokimyasal ve batı leke analizi protein ekspresyasyonu ve potansiyel olarak hücresel lokalizasyondaki farklılıkları belirleyebilir, ancak doğru bir şekilde ölçmek zor olabilir. Ayrıca, birçok MHCI antikoru kompleksin üçüncül yapısını tanır ve konformasyonel değişikliklere karşı oldukça hassastır. Böylece permeabilizasyon veya denatüre etme koşulları MHCI immünoreaktivite kaybına neden³². Burada sunulan yöntem, proteinin doğal uyumundaki antikor tarafından tanınmasını sağlayan MHCI için yerinde immünostaining ve ardından fiksasyon ve permeabilizasyon yöntemlerini kullanır.

Hafif değişikliklerle, burada açıklanan yöntemler diğer nöronal popülasyonları kültüre etmek veya diğer hücre dışı ilgi proteinlerinin ekspresyonlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokolde kortikal nöronları kültüre etmek için yapılabilecek kolay değişiklikler olduğu belirtilmektedir, ancak burada açıklanan yöntemler striatal nöronlar³³gibi diğer nöronal popülasyonları kültüre etmek için de kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol MHCI ve NeuN'un immün yetisini belirtse de, diğer hücresel belirteçler benzer şekilde tanımlanabilir. Genel olarak, hücre dışı belirteçler MHCI gibi, hücre içi belirteçler ise NeuN gibi tedavi edilebilir. Bununla birlikte, hücresel ayrışma adımı sırasında aksonal projeksiyonların somadan koptuğu belirtilmelidir. Burada tanımlanan gating stratejisi hücresel kalıntıları elediği ve nöronal çekirdek belirteci NeuN'a odaklandığı için, sadece aksonal projeksiyonlarda ifade edilen proteinler tespit edilemeyebilir.

Yakın zamana kadar, nöronların MHCI'yı sadece sitotoksik CD8⁺ T hücrelerini meşgul etmek için hasara, enfeksiyona veya in vitro sitokin stimülasyonuna yanıt olarak ifade etmesi düşünülüyordu⁹. Yeni araştırmalar, geliştirme sırasında sinaptik bağlantıların düzenlenmesinde MHCI'nın başka bir işlevini ortaya çıkarmıştır¹³. Burada açıklanan protokol, wildtype kültürlü nöronlarda MHCI ekspresyonını uyarmak için IFNβ kullanır, ancak benzer yöntemler belirli hipotezleri test etmek için çeşitli hücresel uyaranlar veya genetik değişikliklerle kullanılabilir. Bu yöntem, araştırmacıların MHCI ekspresyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaları araştırmalarını sağlayacak ve bu da MHCI'nın bu iki farklı hücresel işlev üzerindeki iki yönlü rolünün anlaşılmasını artıracaktır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml Mikrosantrifüj Tüpleri	Fisher	05-408-129	Laboratuvar Malzemeleri
100 mm steril kültür kabı	Fisher	FB012924	Doku Kültürü Malzemeleri
15 ml Santrifüj Tüpleri	Genesee	21-103	Laboratuvar Malzemeleri
50 ml santrifüj tüpü	Genesee	21-108	Laboratuvar Malzemeleri
500 mM EDTA	Invitrogen	AM9260G	FACS Tampon Reaktifi
%70 Etanol	Fisher	BP82031Gal	Doku Kültürü Malzemeleri
96 kuyulu U-alt plaka	Genesee	25-221	Akış Sitometrisi Malzemeleri
B27	Gibco	17504044	Nöron Kültürü Reaktifi
Borat Tamponu	Thermo Scientific	28341	Doku Kültürü Malzemeleri
Borosilikat Cam Pasteur Pipet	Fisher	13 678 20C	Laboratuvar Malzemeleri
Hücre Ayrışma Tamponu	Gibco	13 151 014	Akış Sitometrisi Malzemeleri
DNase I	Thermo	90083	Ayrışma Çözeltisi Reaktifi
dPBS	Gibco	14190-235	Doku Kültürü Malzemeleri
Dumont #5 Forseps	Güzel Bilim Araçları	91150-20	Diseksiyon Aleti
Dumont #7 Forseps	Güzel Bilim Araçları	91197-00	Diseksiyon Aleti
Fetal Sığır Serumu	Gibco	26140079	Doku Kültürü Malzemeleri
İnce Forseps	Güzel Bilim Araçları	91113-10	Diseksiyon
Aleti İnce Makas	Güzel Bilim Araçları	91460-11	Diseksiyon
Aleti Düzeltme ve Perma Hücre Geçirgenlik Kiti	Invitrogen	GAS003	Akış Sitometrisi Malzemeleri
Glutamax	Gibco	35050061	Nöron Kültürü Reaktifi
Hibernate-E Ortamı	Gibco	A1247601	Nöron Kültürü Reaktifi
Anında Sızdırmazlık Sterilizasyon Torbaları	Fisher	181254	Doku Kültürü Malzemeleri
İnterferon Beta	PBL Testi Bilimi	12405-1	Akış Sitometrisi Malzemeleri
Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antikoru, klon A60	MilliporeSigma	FCMAB317PE	Akış Sitometrisi Antikoru
Nörobazal Medya	Gibco	21103049	Nöron Kültürü Reaktifi
Pasifik Mavisi anti-fare H-2Kb Antikoru	BioLegend	116513	Akış Sitometrisi Antikoru
Papain Çözeltisi Worthington		LS003126	Ayrışma Çözeltisi Reaktifi
Paraformaldehit	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15714	Fiksatif
Penisilin-Streptomisin	Gibco	15140122	Nöron Kültürü Reaktifi
Poli-D-Lizin	Sigma	P7280	Nöron Kültürü Reaktifi
Standart Model Forseps	Güzel Bilim Araçları	91100-12	Diseksiyon
Aracı Stereo diseksiyon mikroskobu	Swift	M29TZ-SM99CL-BTW1	Diseksiyon
Aleti Cerrahi Makas	Güzel Bilim Araçları	91401-10	Diseksiyon Aleti
Transfer Pipetleri	Corning	357575	Laboratuvar Malzemeleri
TruStain FcX (anti-fare CD16/32) Antikor	BioLegend	101319	Akış Sitometrisi Antikor
Tripan Blue	Sigma	T8154-100ML	Doku Kültürü Malzemeleri