Makalede, 1) odak yapışıklıklarının büyüklüğü ve sayısı ile 2) hücre şekil indeksi ve MCF7 hücrelerinin eşzamanlı monolayers konfokal görüntülerinden dağılımının nicelikselleştirilmesi açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
MCF7 HücreLi Monokatmanlarda Hücre-Substrat Adezyon Alanı ve Hücre Şekli Dağılımlarının Ölçülmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Burada sunulan yöntemler, birden fazla uygun şekilde boyanmış konfokal görüntülerden konfluent yapışık hücre monolayers bazı parametreleri ölçmek: odak yapışıklıkların sayısı ve boyutu bir fonksiyonu olarak substrat yapışma, ve hücre şekli, hücre şekli indeksi ve diğer şekil tanımlayıcıları ile karakterize. Fokal yapışıklıklar paxillin boyama ile görselleştirildi ve hücre-hücre sınırları birleştiğinde plakoglobin ve aktin ile işaretlendi. Hücre kültürü ve boyama yöntemleri standarttı; görüntüler tek odak düzlemlerini temsil; görüntü analizi kamuya açık görüntü işleme yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sunulan protokoller, odak yapışıklıklarının sayısını ve boyutunu ve monokatmanlarda hücre şekli dağılımındaki farklılıkları ölçmek için kullanılır, ancak boyanabilir (örneğin, mitokondri veya çekirdek) diğer farklı hücresel yapının boyut ve şeklinin ölçülmesi için yeniden kullanılabilir. Bu parametrelerin değerlendirilmesi, hücre adezyonu ve hücre şeklini etkileyen actomiyozin kontraktürü de dahil olmak üzere yapışık hücre tabakasındaki dinamik kuvvetlerin karakterizasyonunda önemlidir.
Giriş
Epitel hücre monolayers hücre-hücre ve hücre-substrat adezyon yanı sıra kontraktil kuvvetler ve gerginlikler önemli parametreleri temsil ve uygun denge birim1,2,3genel bütünlüğüne katkıda bir kolektif olarak hareket . Bu nedenle, bu parametrelerin değerlendirilmesi hücre tabakasının geçerli durumunu belirlemek için bir yol temsil eder.
Burada açıklanan iki yöntem yapışık, epitel hücrelerinin (bu durumda MCF7 meme kanseri hücre hattı) konfluent monolayers iki boyutlu bir analizitemsil eder. Analiz, Z ekseninde farklı bölgelerden gelen konfokal görüntüler (tek Z dilimleri) kullanılarak gerçekleştirilir; odak yapışma (FA) ölçümleri için bir substrata yakın bazal bölge ve hücre şekli ölçümleri için apikal bölge. Sunulan yöntemler nispeten basit ve standart laboratuvar teknikleri ve açık kaynak yazılım gerektirir. Konfokal mikroskopi bu protokol için yeterlidir, bu nedenle daha özel TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) mikroskopi sayılmadan yapılabilir. Böylece protokol nispeten standart bir laboratuvar ortamında uygulanabilir. Yöntemlerin doğruluğu sınırlı olsa da, odak yapışması ve hücre şeklindeki temel farklılıkları ayırt edebilirler.
Burada açıklanan her iki yöntem de ImageJ kullanılarak yapılan hücre culturing, immunostaining, confokal görüntüleme ve görüntü analizi gibi standart deneysel prosedürlerden oluşmaktadır. Ancak, uygun işlevlere sahip herhangi bir görüntü işleme yazılımı kullanılabilir. Sunulan yöntemler farmakolojik tedavi veya minimal genetik modifikasyon tarafından meydana gelen değişiklikleri izleyebilir ve karşılaştırabilirsiniz. Bu yöntemlerin sınırlı hassasiyeti nedeniyle kesin değerlerin elde edilmesi önerilmez. Birçok görüntünün ölçümlerini kolaylaştırmak için iki otomatik makro dahil edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hazırlık adımları
- Enfluent monolayers elde etmek için hücre tohumlama
- Tohumlamadan önce, kollajen I (veya tercih edilen diğer ECM bileşeni) ile 4-wells oda slayt kuyuları kat. Kollajen I kaplama için ticari bir protokoluygulayın: 8 μg/cm2konsantrasyonda https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html.
- Tohum 400.000 hücreleri bir kuyuya 4-iyi oda slayt.
- Kültür hücreleri için 24 saat (veya daha uzun, deneysel uç noktalara bağlı olarak) boyama önce, bir kuvözde 37 °C, 5% CO2. Bu adım hücre-hücre temaslarının olgunlaşmasını ve monolayers oluşumunu sağlar.
- &W
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Odak yapışma analizi
HAX1 geninin nakavt daha önce fokal yapışıklıkları etkilediği gösterilmiştir6. Hücreler kollajen I-kaplı yüzeyde 48 saat boyunca kültürlendi. Fokal yapışma proteini paxillin ile boyanmış üç bağımsız deneyden(HAX1 KD) MCF7 kontrol hücrelerinin ve MCF7 hücrelerinin görüntüleri konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi (bazal bölgeden tek odak düzleminden/Z-diliminden görüntü). Her hücre hattından yaklaşık 2.000-2.500 hücreden fa'l...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hücre-hücre ve hücre-substrat adezyonu epitel hücrelerinin doğal özelliklerini oluşturur ve doku morfogenezi ve embriogenezinde kritik rol oynar. Erişkin dokularda hücre tabakasının mekanik özelliklerinin uygun şekilde düzenlenmesi homeostazı korumada ve tümör progresyonu ve metastaz gibi patolojik yanıtların önlenmesinde çok önemlidir. Fokal yapışıklıkların boyutu ve sayısı hücre-substrat yapışıklığı gücüne bağlıdır, hücre şekli ise kontraktil kuvvetlere bağlıdır ve hücre-hücre temaslarının durumuyla ilişkilidir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Polonya Ulusal Bilim Merkezi tarafından 2014/14/M/NZ1/00437 sayılı hibe kapsamında desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | keçi tavşan önleyici, 1:500 |
| Amonyum klorür | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Baldır derisinden kollajen | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (H2O'da 1 mg / mL stok), nükleik asit boyama |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glikoz, Piruvat | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Bağlantı plakoglobin | Hücre Sinyalizasyonu | 2309S | tavşan, 1:400 |
| Laminer akış kabini sınıf 2 | Alpina | standart ekipman | |
| MCF7 tabanlıHAX1KD hücre hattı | Varşova Ulusal Onkoloji Enstitüsü'nde kurulan hücre hattı, Balcerak ve ark., 2019 | MCF7 hücre hattı ileHAX1knockdown | |
| MCF7 hücre hattı (KONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epitelyal, yapışık meme kanseri hücre hattı |
| Olympus CK2 ışık mikroskobu | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | tavşan, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC konjuge | Sigma | P1951 | 1:400 (DMSO'da stok 5 mg / mL), aktin etiketleme |
| PTX Sigma | T7402-1MG | ||
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma tabanı | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Konfokal mikroskop | Zeiss |
Kaynaklar
- Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006(2016).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122, Pt 18 3203-3208 (2009).
- Ladoux, B., Mege, R. M. Mechanobiology of collective cell behaviours. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).
- Stossi, F., et al. High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator. Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Balcerak, A., et al. HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).
- Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology. PLoS One. 13 (3), 0195201(2018).
- Fokkelman, M., et al. Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour. Scientific Reports. 6, 31707(2016).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Kim, D. H., Wirtz, D. Focal adhesion size uniquely predicts cell migration. FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. Journal of Microscopy. 227, Pt 2 140-156 (2007).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images. Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).
- Tong, J., et al. Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients. Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).
- Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
