Yöntem makalesi

Akut İzole Edilmiş Erişkin Mikroglia ve Beyin Makrofajlarının Fagositik Özelliklerini İn Vitro Karakterize Etmek İçin Flow Sitometri Yaklaşımı

3.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61467

⸱

23 Haziran 2020

 ,  , 
1Department of Neurology, Emory University

Bu makalede

Özet

Mikroglia ve beyin makrofajlarının fagositik özelliklerinin değerlendirilmesi, moleküler profilleme çalışmalarına değerli bir fonksiyonel boyut sağlayabilir. Fare modellerinden akut izole edilmiş mikroglia ve beyin makrofajları ile floresan mikrokürelerin ve amiloid beta fibrillerin fagositozunu hızlı ve güvenilir bir şekilde ölçmek için akış sitometrisi kullanan doğrulanmış bir protokolü tanımladık.

Özet

Topluca CNS mononükleer fagositleri (CNS-MP'ler) olarak adlandırılan mikroglia ve merkezi sinir sistemi (MSS) infiltre eden makrofajlar, nörodejenerasyon ve inme dahil olmak üzere nörolojik hastalıklarda merkezi rol oynar. CNS-MP'ler, her biri farklı altta yatan moleküler yollara sahip patolojik proteinlerin, döküntülerin ve nöronal sinapsların fagositik klirensinde rol oynar. Bu fagositik özelliklerin karakterize edilmesi, geleneksel akış sitometrisi, transkriptomik ve proteomik yaklaşımlar kullanılarak mikroglianın moleküler profilini tamamlayan fonksiyonel bir okuma sağlayabilir. Mikroglianın fagositik profili, fare neonatal mikrogliasının mikroskobik görüntülemesine ve in vitro kültürlerine dayanmaktadır. İlk yaklaşım sınırlı örneklemeden muzdaripken, ikinci yaklaşım doğası gereği yetişkin CNS-milletvekillerinin gerçek in vivo durumunu zayıf bir şekilde yansıtmaktadır. Bu makale, akut izole fare CNS-MPS'lerinin fagositik özelliklerini akış sitometrisi ile fenotiplemek için optimize edilmiş protokolleri açıklamaktadır. CNS-MP'ler, mekanik ayrışma ve ardından yoğunluk gradyan santrifüjlemesi kullanılarak yetişkin fare beyninden akut olarak izole edilir, floresan mikroküreler veya floresan Aβ fibrilleri ile inkübe edilir, yıkanır ve daha sonra yüzey belirteçlerine karşı antikor panelleri ile etiketlenir (CD11b, CD45). Bu yaklaşımı kullanarak, beyinde yerleşik mikrogliaların fagositik özelliklerini CNS infiltre eden makrofajlarla karşılaştırmak ve daha sonra yaşlanma ve hastalık patolojisinin bu fagositik fenotipler üzerindeki etkisini değerlendirmek mümkündür. Bu hızlı yöntem aynı zamanda, ölüm sonrası veya cerrahi beyin örneklerinden akut olarak izole edilmiş insan CNS-MP'lerini işlevsel olarak fenotip potansiyeline sahiptir. Ek olarak, CNS-MP alt kümeleri tarafından spesifik fagositoz mekanizmaları, belirli fagositik yolakların inhibe edilmesiyle araştırılabilir.

Giriş

Merkezi sinir sisteminin (CNS) doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ağırlıklı olarak mikroglia ve sızan monositler / makrofajlardan oluşur ve birlikte CNS-mononükleer fagositler (CNS-MPS) olarak adlandırılır1. CNS-MP'ler, Alzheimer hastalığı (AD), nöroinflamatuar bozukluklar ve inme gibi nörodejeneratif hastalıklarda rol oynar 2,3,4. CNS-MP'ler, astrositler, perisitler ve ependimal hücreler ile birlikte fagositik fonksiyonlara sahiptir 5,6. Homeostatik durumlarında, CNS-MP'ler, apoptotik hücre kalıntılarının ve proteinlerin fagositik klerensi ve nöronal bağlantıları yeniden modellemek için sinaptik budama ile birlikte yerel mikro çevrenin sürekli gözetiminde yer alırlar 7,8,9,10. AD gibi nörodejeneratif durumlarda, CNS-MP'ler, agrega agregalı amiloid-beta (Aβ) ve nöronal elementlerin temizlenmesinin yanı sıra inflamatuar sitokin ve faktör salınımı dahil olmak üzere patolojik roller oynayabilen farklı hastalıkla ilişkili moleküler ve fonksiyonel fenotipleri benimser ve bu da karmaşık pro-inflamatuar, zararlı ve aynı zamanda anti-inflamatuar, koruyucu rollerle sonuçlanır 11,12,13,14. Makropartiküllerin, hücresel döküntülerin, proteinlerin ve diğer enfeksiyöz partiküllerin CNS-MP'ler tarafından fagositozuna, yüzeylerinde eksprese edilen farklı reseptörler aracılık eder9. Bu fagositik yollardaki bozulma, kusurlu klerense ve ilerleyici Aβ birikimine yol açabilir ve sonuçta AD4,9'da ilerleyici nöronal hasara yol açabilir. Transkriptomik ve proteomik yaklaşımlar kullanılarak CNS-MP'lerin moleküler profillemesindeki ilerlemeler, nörolojik hastalıklarda CNS-MP'ler içindeki moleküler heterojenlik hakkında paha biçilmez bilgiler sağlamış olsa da15,16, CNS-MP'lerin ve alt kümelerinin fagositik özelliklerinin fonksiyonel karakterizasyonu şu anda eksiktir. CNS-MP'lerin fagositik özelliklerinin fonksiyonel karakterizasyonu, moleküler profilleme stratejilerini tamamlayabilir, daha iyi fonksiyonel fenotiplemeyi kolaylaştırabilir ve hastalık modellerinde kusurlu fagositozu düzeltebilecek terapötiklerin etkinliğinin değerlendirilmesine yardımcı olabilir17.

CNS-MP'ler için geleneksel fagositoz deneyleri, Aβ veya lateks / polistiren parçacıkları gibi floresan substratlarla birlikte birincil mikroglia'nın inkübe edilmesini içerir. Fagositoz daha sonra immünofloresan mikroskobu 18,19,20 kullanılarak floresan substratın alımının bir fonksiyonu olarak incelenir. CNS-MP'lerin uzun kültürlerde tutulduğunda morfolojilerini ve transkripsiyonel profillerini önemli ölçüde değiştirebildiği iyi bilinmektedir21,22. Bu, CNS-MP'lerin fagositik özelliklerinin CNS'deki temsili durumlarında incelenmesini engellemektedir. Akut olarak izole edilmiş canlı CNS-MP'lerin profilini çıkarmak için fonksiyonel bir akış sitometrisi testi, fagositik özelliklerin hızlı bir değerlendirmesini sağlayabilir ve mikroskopi yaklaşımlarından çok daha büyük bir CNS-MP havuzunu örnekleyebilir 9,23. Ayrıca, akış sitometrisi, CNS-MP'lerin kültürde muhafaza edilmesi ihtiyacını ortadan kaldırır ve CNS-MP'lerin farklı alt popülasyonlarında fagositotik özellikleri incelemek için bir platform sağlar. Bu makale, akut izole fare CNS-MPS'lerinin fagositik özelliklerini akış sitometrisi ile fenotiplemek için optimize edilmiş protokolleri açıklamaktadır. Akış sitometrisi kullanılarak fagositoz testlerinin uyarlanması, immün fenotipleme ile birlikte CNS-MP'lerin fagositik fenotipinin hızlı bir şekilde çoğullanmasına izin verir, böylece tek hücre çözünürlüğünde CNS-MP'ler içindeki fagositik özelliklerin heterojenliği hakkında bilgi sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm fare çalışmaları, Emory Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nden (IACUC) onay alındıktan sonra ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir.

1. İzolasyon gününde hazırlık

  1. İzolasyon prosedürü boyunca tüm reaktifleri, tamponları ve hücre süspansiyonlarını soğuk tutmak için bir buz kovası hazırlayın.
  2. 1× fosfat tamponlu salin (PBS) (en az 1 L) şişesini perfüzyondan önce 30 dakika ila 1 saat boyunca 4 ° C'de yerleştirin ve perfüzyon ve izolasyon prosedürü sırasında 1× PBS'yi buz üzerinde tutun.
  3. Yoğunluk gradyan ortamının çalışma konsantrasyonunu hazırlayın (%35 SIP olarak adlandırılır, Malzeme Tablosuna bakın).
  4. İşlem sürelerindeki gecikmeleri önlemek için hücre izolasyonundan önce deneyde kullanılan tüm konik ve akış sitometri tüplerini etiketleyin. Ek olarak, 40 μm hücre süzgeçleri, şırıngalar ve iğneler gibi perfüzyondan önce izolasyon için gerekli diğer tüm malzemeleri toplayın.

2. Yetişkin fare mikrogliasının akut izolasyonu

  1. Yetişkin bir fareyi, fare nefes almayı bırakana ve arka bacak pençe sıkışmasına yanıt vermeyene kadar fareyi izofluran (5 mL) içeren bir cam indüksiyon odasına yerleştirerek uyuşturun.
  2. Görsel kan olmayana kadar 30 mL buz gibi 1× PBS ile kardiyak perfüzyon yapmak için 26 G iğne ve 10 mL şırınga kullanın.
  3. Farenin kafasını cerrahi makasla kes. Cildi kesmek için küçük bir makas kullanın ve kafatasını açığa çıkarın. Beyin dokusuna zarar vermeden kafatasını tarif edildiği gibi çıkarın24. Beyni hemen çıkarın ve 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş steril bir 40 μm hücre süzgecine aktarın.
  4. Beyni süzgeçten geçirmek ve tüm beyin dokusunu mekanik olarak ayırmak için 3 mL'lik bir şırınganın pistonunun arka tarafını kullanın. Tüm dokunun süzgeçten geçtiğinden emin olmak için hücre süzgecini ve pistonu ayrışma sırasında aralıklı olarak 2 mL buz gibi 1× PBS ile yıkayın.
  5. Kalan süspansiyonu konik içinde toplamak için hücre süzgecinin altını pistonla kazıyın. Hücre süzgecini buz gibi soğuk 1× PBS ile iyice yıkayın ve süspansiyonu 50 mL konik tüpe dökün.
    NOT: Birden fazla hayvanı seri olarak işlerken, hücre süspansiyonlarını daha sonraki işlemlere kadar buzun üzerine yerleştirin.
  6. Hücre süspansiyon hacmini 30 mL'ye getirmek için buz gibi soğuk 1× PBS ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin.
  7. Peteli rahatsız etmeden süpernatanı dökün ve peleti 10 mL'lik bir serolojik pipet ile 6 mL %35 SIP'de yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonu +% 35 SIP karışımını yeni bir 15 mL konik tüpe aktarın ve frensiz olarak 15 ° C'de 25 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin.
    DİKKAT: Yeniden süspansiyon sırasında kabarcıkların girmesini önlemek için özel dikkat gösterin. Aşırı kabarcıklar hücre verimi için zararlı olabilir.
  8. 15 mL'lik konik tüpü, katmanları rahatsız etmeden santrifüjden dikkatlice çıkarın ve üst yüzen miyelin katmanını aspire edin.
  9. Hücre süspansiyonu +% 35 SIP karışımını 10 mL serolojik pipet kullanarak 30 mL buz gibi soğuk 1× PBS içeren yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın ve 800 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice dökün ve 500\u2012800 μL 1× PBS ile birlikte hücre peletini geride bırakın.
  10. Bir p1000 pipet ile hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini yeniden süspanse edin ve 5 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Yuvarlak tabanlı tüpe 2 mL buz gibi soğuk 1× PBS ekleyin ve 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1.400 × g'da santrifüjleyin. CNS-MPS içeren hücre peletini yaklaşık 100 μL 1× PBS'de bırakarak süpernatanı hızla dökün (Şekil 1).

3. Fagositoz kurulumu ve akış sitometrik boyama

  1. Yeniden askıya alınmış CNS-MP'lerin 20 μL'sini (≈200.000 hücre) 5 mL'lik yeni bir yuvarlak tabanlı tüpe aktarın ve 80 μL buz gibi soğuk 1× PBS ekleyin. Bu tüpe herhangi bir floresan substrat veya akış sitometrisi antikoru eklemeyin. Bu hücreler, akış sitometrisi analizleri için CNS-MP'lerin arka plan floresansını belirlemek için negatif bir kontrol görevi görür.
  2. İzole edilmiş CNS-MP'lerin yaşayabilirliğini belirlemek için amin bazlı canlı/ölü boyalar (örn. Sabitlenebilir Mavi UV) kullanın.
    1. Hücre peletinin geri kalanını 500 μL 1× PBS'de yeniden süspanse edin ve negatif kontrol hariç her numune tüpüne 1 μL sulandırılmış boya ekleyin.
    2. Yavaşça girdap yapın, tüpleri folyo ile örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, her tüpe 1 mL 1× PBS ekleyin ve yavaşça girdap yapın.
    3. Hücreleri 1.400 × g'da 4 ° C'de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı hızlı bir şekilde dökün ve hücre peletini 100 μL 1× PBS'de yeniden süspanse edin.
      NOT: Amin bazlı boyalar, hücre dışı Aβ fibrillerine bağlanarak fagositozun sonuçlarını karıştıracaktır. Diğer canlı/ölü göstergeler, Aβ fibrillerinin/mikro küreciklerinin floresansını etkileyebilir. Bu nedenle, izole edilmiş CNS-MP'lerin yaşayabilirliğini belirlemek için yalnızca ön deneylerde Canlı/ölü göstergesinin kullanılması tavsiye edilir.
  3. PE-polistiren mikroküreler içeren tüpü iyice vorteksleyin ve negatif kontrol dışında akış tüplerinde 100 μL hücre süspansiyonuna 2 μL (≈200 mikroküre / hücre) ekleyin. Substratın hücrelerle eşit dağılımını sağlamak için her bir tüpü nazikçe vorteksleyin ve yuvarlak tabanlı tüpleri% 5 CO2 ile 37 ° C'de 30 dakika boyunca steril bir nemlendirilmiş inkübatöre yerleştirin.
    1. Pozitif ve negatif numuneler arasında benzer deney koşullarını sağlamak için negatif kontrol tüpünü nazikçe girdaplayın ve inkübe edin.
      NOT: PE mikrokürecikler yerine Aβ fibrilleri kullanılıyorsa, daha önce9 tarif edildiği gibi floresan HiLyte488 Aβ fibrilleri hazırlayın. Aβ fibrillerinin nihai konsantrasyonu 200 μM'dir ve daha sonra floresan Aβ monomerlerinin PBS'sinde taze 20 μM stoğu hazırlamak için seyreltilir. İzole edilmiş hücreler içeren her tüpe 12.5 μL 20 μM stok Aβ monomeri ekleyin.
  4. Hücreleri inkübatörden çıkarın ve her tüpe 1 mL 1× PBS ekleyin ve hafifçe girdap yapın. Hücreleri 1.400 × g'da 4 ° C'de 2 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı hızla dökün. Yıkamayı 1 mL 1× PBS ile tekrarlayın, 1.400 × g'da 2 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dökün ve hücre peletini 100 μL 1× PBS'de yeniden süspanse edin.
    NOT: Her dönüşten sonra, devam eden fagositik alımı engellemek için hücreleri buz üzerinde tutmak önemlidir.
  5. Akış sitometrisi antikorlarını girdap haline getirin ve 10 saniye boyunca bir mikrosantrifüjde santrifüjleyin. Her hücre süspansiyon tüpüne, Aβ fagositoz testi için CD11b-APC / Cy7 ve CD45-PE / Cy7'nin her birine 1 μL veya PE-mikroküre fagositozu için CD45-FITC ekleyin. Her tüpü nazikçe girdap haline getirin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Kullanıcılar ayrıca pozitif kontrol olarak kültürlenmiş BV2 mikroglia veya peritoneal makrofajlar gibi güçlü fagositik hücreler içeren ayrı bir tüp içerebilir ve bunları PE-mikroküreler ve yukarıda tarif edildiği gibi akış sitometrik antikorları ile tedavi edebilir. Bu örnekten elde edilen veriler, ön deneylerde gerçek fagositozu gösteren pozitif kontrolü tanımlamak için kullanılabilir.
  6. Hücreler inkübasyondayken, dört yuvarlak tabanlı 5 mL akış tüpü kullanarak kompanzasyon tüpleri kurun. Dengeleme boncuklarını iyice girdaplayın ve her tüpe 1 damla ekleyin. İlk tüpe 1 μL CD11b-APC / Cy7 ve ikinci tüpe CD45-FITC ekleyin. Üçüncü tüpe 1 μL PE-polistiren ekleyin ve lekelenmemiş dengeleme boncuklarını dördüncü tüpte tutun. Akış sitometresinde bir kompanzasyon paneli kurmak için bu dördüncü tüpü negatif kontrol olarak kullanın.
    NOT: Fagositozu incelemek için Aβ fibrilleri kullanıldığında, CD45-FITC yerine ikinci tüpe CD45-PECy7 ekleyin. Üçüncü kompanzasyon tüpüne 1 μL ayrı FITC etiketli akış sitometrisi antikoru veya FITC-ikincil antikor (herhangi bir tür) ekleyin. Bu önemlidir, çünkü boncuklar Aβ fibrillerine bağlanamaz ve kompanzasyon tüplerinin yıkanması üzerine yıkanır.
  7. Kompanzasyon boncuklarının ilgili antikorları ile en az 10 dakika inkübe etmesine izin verin. İnkübasyondan sonra, her tüpe 1 mL 1× PBS ekleyin, 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1.400 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı hızla dökün. Kompanzasyon tüplerini buzun üzerine yerleştirin ve akış sitometrisi olana kadar folyo ile örtün.
  8. Akış sitometrisi antikorları ile inkübasyonun ardından, lekeli hücreleri 1 mL 1× PBS ile yıkayın. Hücreleri 1.400 × g'da 4 ° C'de 2 dakika boyunca nazikçe girdap yapın ve santrifüjleyin. Süpernatanı hızlı bir şekilde dökün ve yıkamayı 1 mL 1× PBS ile tekrarlayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dökün ve hücre peletini 100 μL 1× PBS'de yeniden süspanse edin.
  9. Numune tüplerini buzun üzerine yerleştirin ve akış sitometrisi olana kadar üzerlerini alüminyum folyo ile örtün.
    NOT: Deney boyunca akış tamponu olarak Ca1× / Mg7.0+ olmadan 2 PBS (pH 2) kullanın. Olası mikroglial aktivasyonu önlemek için akış tamponunda fetal sığır serumunu (FBS) dışladığınızdan emin olun.

4. Akış sitometrisi ve analizi

  1. Cihaz kurulumu ve kompanzasyon
    NOT: Bu yazıdaki deneyler ultraviyole, mor, mavi, sarı-yeşil ve kırmızı lazerli bir akış sitometresi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu deney aynı zamanda sadece mavi, sarı-yeşil ve kırmızı lazerli üç lazerli akış sitometrelerine de uyarlanabilir. Kullanıcıların cihazı kullanmadan önce resmi bir eğitimden geçmeleri gerekir.
    1. Akış kılıfı tampon tankını yeniden doldurun ve sitometreyi açın. Sitometreyi ddH2O içeren 5 mL'lik yuvarlak dip akış tüpü ile "astarlayın". Akış sitometresine bağlı bilgisayardaki analiz yazılımına giriş yapın. Bir "deney" oluşturun ve parametreler olarak FSC, SSC, FITC, PECy7 ve APC-Cy7'yi seçin. PE mikroküreleri kullanıyorsanız, parametre panelinde PECy7 yerine PE'yi seçin.
    2. Uygun bir ücretlendirme paneli oluşturun.
      NOT: Deneylerimizde, tipik olarak kompanzasyon boncukları için FSC/SSC voltajları 350/280 civarındayken, CNS-MP'ler için FSC/SSC voltajları 320/260 civarındadır. Bu değerler herhangi iki farklı sitometre arasında değişebilir ve gerçek deneyden önce kalibre edilmeleri gerekir.
    3. Her bir kompanzasyon ve hücre süspansiyon tüpünü 500 μL 1× PBS ile sulandırın, kısaca girdap yapın ve buz üzerine yerleştirin. Her bir florofor histogramındaki tepe noktası 102'nin altında olacak şekilde uygun voltajları ayarlamak için negatif kontrol/lekesiz boncuk tüpünü çalıştırın. Farklı pozitif tepe noktalarını belirlemek için diğer tek renkli kompanzasyon tüplerini çalıştırın.
      NOT: Her floroforun pozitif ve negatif tepe noktaları arasında en az yarım log (taban 10) fark olmalıdır.
    4. Bilgisayarın kompanzasyon kurulumunu otomatik olarak hesaplamasını sağlamak için her kompanzasyon tüpünden 5000 olay kaydedin. Kompanzasyon kurulumunu mevcut deneyebağlayın 25.
    5. Örnek sekmesi altında yeni bir "tüp" oluşturun. Lekelenmemiş CNS-MP'ler içeren negatif kontrol tüpünü nazikçe girdaplayın ve çalıştırın. İlgilenilen popülasyonu yakalamak için ileri ve yan saçılma voltajlarını ayarlayın. Olayları kaydedin ve aşağıda belirtildiği gibi canlı CNS-MP'lere alt kapı ekleyin.
    6. Parametreleri ve voltajları tutarlı tutarak, sonraki tüm tüplerden olayları ayrı dosyalar olarak yakalayın ve kaydedin. Akış sitometresinde çalıştırmadan önce her bir tüpü hafifçe girdaplayın.
  2. Geçit stratejisi ve fagositoz ölçümü
    1. Tüm CNS-MP'leri yakalamak için ilk mononükleer kapıyı çizin. Bu canlı mononükleer hücreler, beyitler ve üçüzler hariç, yalnızca tek hücreleri içerecek şekilde aşağıdaki grafikte kapılanmalıdır.
    2. Kapılı tek, canlı CNS-MPS popülasyonunu, CD11b ve CD45 floroforlarını gösteren sonraki bir grafiğe yansıtın.
      NOT: Beyinde yerleşik mikroglialar tipik olarak CD11b + CD45ara maddesidir, sızan makrofajlar ise CD11b + CD45yüksekliğindedir. İnflamatuar monositleri (Ly6cyüksek ve CD45yüksek) mikrogliadan (Ly6cdüşük , CD45ara maddesi) daha güvenli bir şekilde ayırmak için Ly6c gibi ek belirteçler panele dahil edilebilir.
    3. Şekil 2F'de gösterildiği gibi ilgili popülasyonlarda fagositozu daha fazla incelemek için uygun kapıları uygulayın.
      NOT: CNS-MP'lerdeki fagositoz, Hilyte488 / Alexa488 (Aβ) veya PE (mikroküre) floresan alımının bir fonksiyonu olarak ölçülür. İlgili histogramlarındaki belirgin pozitif pik, CNS-MP'lerin substratı fagositoz ettiğini gösterir. Fagosite edilen materyal miktarı, floresanın yoğunluğu ile doğru orantılıdır. Bu nedenle, birden fazla pikin varlığı daha yüksek fagositoz olarak yorumlanmalıdır. Bunlar daha sonra immünohistokimya ile doğrulanabilir.
    4. Tüm numune tüplerini akış sitometresine kaydettikten sonra, daha fazla analiz için veri dosyalarını .fcs formatında dışa aktarın.
  3. İstatistiksel veri analizi
    1. Tüm veri analizleri için elektronik tablolar ve istatistiksel analiz yazılımı ile birlikte herhangi bir akış sitometrisi analiz yazılımını kullanın.
    2. .fcs dosyalarını analiz yazılımına ekleyin ve ilk dosyaya çift tıklayın. Tüm kayıtları gösteren bir grafik
      Olaylar görünecektir. Daha sonra tek, canlı mononükleer hücreleri kapılamak ve örneğin CD11b + CD45ara mikroglial hücreleri (Şekil 2H) belirli popülasyonda fagositozu incelemek için Şekil 2'de gösterildiği gibi benzer geçit stratejisini izleyin.
      NOT: Fagositik indeks, floresan Aβ fibrillerini veya ≥1 mikroküre(ler)i içselleştiren hücrelerin oranına göre değerlendirilir. Daha önce tanımlandığı gibi, düşük seviyeli fagositoz en az 1 mikroküre alımıdır ve yüksek seviyeli fagositoz >1 boncuk alımıdır 8,9. Önceki deneylere dayanarak, aktin bağımlı süreçlerin sitokalasin D tarafından inhibisyonu, >1 boncuk alımını tamamen inhibe eder ve 1 boncuk alımını9 kısmen inhibe eder, ayrıca Aβ alımını tamamen inhibe eder, bu da hücre yüzeyine pasif bağlanma yerine aktine bağımlı fagositik alımı doğrular. İmmünositokimya ayrıca, mikroküre tahlilindeki her bir ardışık zirvenin, fagositozluboncuk sayısındaki üniter bir artışı temsil ettiğini doğrulamaktadır 8,9.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Akut izole CNS-MP'ler tarafından mikrokürelerin ve Aβ42 fibrillerinin fagositik tutulumunun tipik sonuçlarını örneklemek için, geçici orta serebral arteriyel oklüzyonu (MCAO) takiben ipsilateral hemisferden akut izole CNS-MP'ler elde edildi8. MCAO modelindeki CNS-MP'lerin fagositik özellikleri ile ilgili ayrıntılar için lütfen önceki yayınlarabakın 8. Kısaca, 72 saatlik bir iyileşmeden sonra, CNS-MP'ler mekanik ayrışma ve ardından yoğunluk gradyan santrifüjleme ve floresan ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Akış sitometrisi, bu ilgili belirteçleri etiketlemek için floresan etiketli problar (tipik olarak antikorlar) kullanarak hücre yüzeyinde veya hücre içi bölmelerde ilgilenilen proteinlerin veya belirteçlerin ekspresyonunu tespit edebilen bir tekniktir. Hücre yüzeyi veya hücre içi antikorlar tipik olarak benzersiz emisyon spektrumlarına sahip lazerle uyarılabilir florokromlarla konjuge edilir. Bu antikorlarla inkübe edilen hücreler, bu belirteçlerin ekspresyon modellerine dayalı olarak bir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Çalışma, Dr. Rangaraju (NINDS K08 NS099474-1 ve R01 NS114130-01A1) ve Dr. Rayapolu'ya (NIA F32AG064862) NIH ödülleri ile desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Emory Entegre Çekirdek Tesislerinden (EICF) biri olan Emory Akış Sitometri Çekirdeği (EFCC) tarafından desteklenmiştir ve Emory Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından sübvanse edilmektedir. NIH'nin Georgia Clinical & Translational Science Alliance (UL1TR002378) tarafından ek destek sağlandı. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini yansıtmak zorunda değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10x Hank'in dengeli tuz çözeltisi (10x HBSS)ThermoFisher140650564 ° C'de saklayın. Protokolde açıklandığı gibi SIP yapmak için kullanılır
1x Hank'in dengeli tuz çözeltisi (1x HBSS)ThermoFisher14175095
protokolünde açıklandığı gibi% 35 SIP yapmak için kullanılırhttps://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html 10xPBS'yi Oda sıcaklığında saklayın. Bir kısım 10xPBS'yi dokuz kısım MilliQ dH20 ile seyrelterek taze 1xPBS hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın; Kullanmadan önce bir saat boyunca C. Buzdolabından önce 1xPBS'nin pH'ının 7.0 olduğundan emin olun.
%35 SIP20 mL %35 SIP yapmak için 7 mL SIP ve 13 mL buz gibi 1 kez kullanın; HBSS'yi seçin.
APC-Cy7 sıçan anti-CD11bBD Pharmingen557657&° C'de saklayın; C veya kullanım sırasında buz üzerinde tutun. Işıktan saklandı. Akış sitometrisi seyreltme - 1:100
FITC sıçan anti fare CD145BD Pharmingen5530804 &°C'de saklayın; C veya kullanım sırasında buz üzerinde tutun. Işıktan saklandı. Akış sitometrisi seyreltme - 1:100
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Mavi Ölü Hücre Leke KitiThermoFisherL34961-20 ° C'de saklayın. Boyanın bir tüpüne 50ul DMSO ekleyin, baştan sona girdap yapın ve maksimum hızda 1 dakika santrifüjleyin. 10 mikro yapın; Her deney için taze bir alikot kullanın ve numunelere 1:500 seyreltmede ekleyin.
OneComp eBeads kompanzasyon boncuklarıThermoFisher01-1111-424 > C, numune tüplerine (tüplerine eklemeden önce tüpü iyice girdaplayın, kullanım sırasında buz üzerinde tutun.
PE-Cy7 sıçan anti fare CD145BD Pharmingen5528484 & deg; C veya kullanım sırasında buz üzerinde tutun. Işıktan saklandı. Akış sitometrisi seyreltmesi - 1:100
Percoll pH8.5-9.5SigmaP16444 ° C'de saklayın. 10 mL Standart İzotonik Percoll (SIP) yapmak için: 9 mL soğuk Percoll ve 1 mL soğuk 10× kullanın; HBSS'yi seçin.
Fikoeritrin konjuge mikro kürelerThermoFisherF130834 &°C'de saklayın; C veya kullanım sırasında buz üzerinde tutun.
β-Amiloid (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - etiketli, İnsanAnaSpecAS-60479-01Ab fibrillerinin nihai konsantrasyonu 200 mikrodur; M daha sonra kullanımdan önce seyreltilir. -20 ° C'de saklayın Her deney için taze çalışma çözeltisi hazırlayın.
4 ° C'de saklayın. 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) Daha fazla işlenene kadar buz üzerinde tutun 4

Kaynaklar

  1. Jordan, F. L., Thomas, W. E. Brain macrophages: questions of origin and interrelationship. Brain Research. 472 (2), 165-178 (1988).
  2. Heneka, M. T., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. Lancet Neurology. 14 (4), 388-405 (2015).
  3. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. Journal of Leukocyte Biology. 87 (5), 779-789 (2010).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  5. Bellesi, M., et al. Sleep Loss Promotes Astrocytic Phagocytosis and Microglial Activation in Mouse Cerebral Cortex. Journal of Neuroscience. 37 (21), 5263-5273 (2017).
  6. Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 6(2013).
  7. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial Phagocytosis and Its Regulation: A Therapeutic Target in Parkinson's Disease. Frontiers in molecular neuroscience. 11, 144(2018).
  8. Gao, T., et al. Temporal profiling of Kv1. 3 channel expression in brain mononuclear phagocytes following ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 116(2019).
  9. Rangaraju, S., et al. Differential Phagocytic Properties of CD45(low) Microglia and CD45(high) Brain Mononuclear Phagocytes-Activation and Age-Related Effects. Frontiers in Immunology. 9, 405(2018).
  10. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  11. Dubbelaar, M. L., Kracht, L., Eggen, B. J. L., Boddeke, E. The Kaleidoscope of Microglial Phenotypes. Frontiers in Immunology. 9, 1753(2018).
  12. Ransohoff, R. M., El Khoury, J. Microglia in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (1), 020560(2015).
  13. Venegas, C., et al. Microglia-derived ASC specks cross-seed amyloid-beta in Alzheimer's disease. Nature. 552 (7685), 355-361 (2017).
  14. Sarlus, H., Heneka, M. T. Microglia in Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).
  15. Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  16. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  17. Rangaraju, S., et al. Identification and therapeutic modulation of a pro-inflammatory subset of disease-associated-microglia in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 24(2018).
  18. Mutzke, E., Chomyshyn, E., Nguyen, K. C., Blahoianu, M., Tayabali, A. F. Phagocytosis-coupled flow cytometry for detection and size discrimination of anionic polystyrene particles. Analytical Biochemistry. 483, 40-46 (2015).
  19. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. Journal of Neuroscience. 25 (36), 8240-8249 (2005).
  20. Pul, R., Chittappen, K. P., Stangel, M. Quantification of microglial phagocytosis by a flow cytometer-based assay. Methods in Molecular Biology. 1041, 121-127 (2013).
  21. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  22. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  23. Grasse, M., Rosenkrands, I., Olsen, A., Follmann, F., Dietrich, J. A flow cytometry-based assay to determine the phagocytic activity of both clinical and nonclinical antibody samples against Chlamydia trachomatis. Cytometry A. 93 (5), 525-532 (2018).
  24. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, (2011).
  25. Szalóki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 982-985 (2015).
  26. Chen, M. J., et al. Microglial ERK activation is a critical regulator of pro-inflammatory immune responses in Alzheimer's disease. J bioRxiv. , 798215(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikroglia zolasyonuMSS Monon kleer FagositlerMekanik DisosyasyonYo unluk Gradyan Santrif gasyonuFloresan Mikrok relerY zey Mark r EtiketlemesiCD11b CD45
Video yakında

İlgili makaleler