Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

İnsan implantasyonu ve erken plasentanın ortaya çıkması tarihsel olarak araştırmak zordur ve büyük ölçüde bilinmemektedir çünkü gebelik klinik olarak saptanamayan bu aşamada insan dokularına erişilemez. Hayvan modelleri yetersizdir, çünkü insan plasentasyonu diğer öther memelilere göre kendine özgü özelliklere sahiptir. Örneğin, insan plasenta diğer hücreler rahim spiral arterler remodel ise bazı trofenlast hücreleri rahim miyometrium en az iç üçte ulaşan ile yaprak içine derinden işgal. Hatta en yakın evrimsel atalarımız, insan olmayan primatlar, plasental morfoloji ve trofenlast etkileşimleri maternal desidual^dokular1,2,3ile farklılıklar göstermektedir. 1980'li yıllarda klinik insan in vitro fertilizasyon (IVF) kısırlık tedavisinde rutin bir uygulama olarak başlayana kadar in vitro pre-implantasyon insan embriyolarının in vitro elde edilmesi mümkün değildi⁴. Şimdi, insan blastosistleri transfer için daha uygun embriyoların seçimi için izin vermek için in vitro yetiştirilebilir, hem de güvenli genetik test sağlamak. Embriyo kültürü tekniklerinde iyileşme, hem de IVF artan kullanımı hastanın tedavi döngüleri tamamlandıktan sonra kalır birçok artı blastosistler vermiştir. Hastanın onayı, IRB onayı ve bazı kısıtlamalar ile bu blastosistler araştırma çalışmaları için kullanılabilir. Onlar insan embriyonik kök hücrelerin türevi için kullanılan paha biçilmez bir kaynak haline gelmiştir⁵, embriyonik kök hücrelere iç hücre kütlesinin geçiş anlayışı^6,7, ve daha yakın zamanda, başarıyla güne kadar kültürlü olmuştur (D) 13 insan^{implantasyonu}remodel 8^,9. Son zamanlarda geliştirilen tek hücreli omik yaklaşımlar kullanarak, Bu implantasyon aşamasında insan embriyo dokularına erişim daha önce¹⁰keşfetmek imkansız olan bu son derece dinamik hücre farklılaşma sürecini düzenleyen moleküler mekanizmaları tanımlamak için benzersiz fırsatlar sunmuştur 10^,11,12,13.

Burada, insan implantasyonu sırasında trophoblast farklılaşmasının dinamiklerini karakterize eden son yayınımızda kullanılan yöntemleri açıklıyoruz¹². Bu protokol vitrifiye blastosistlerin ısınmasını, D12 sonrası IVF'ye kadar uzatılmış embriyo kültürünü, embriyonun tek hücrelere enzimatik sindirimini ve aşağı akım tahlilleri için hücre toplamayı içerir (Şekil 1). Bu genişletilmiş kültür sistemi anne girişi olmadan peri-implantasyon aşamasında insan embriyo gelişimini destekler ve yıllar önce histolojik örneklerden yapılan gözlemler ile tutarlı görünen trophoblast farklılaşması özetler^14,15,16,17. İmplantasyon sırasında trofoblast popülasyonu en az iki hücre tipinden oluşur: mononükleli progenitor benzeri sitotrophoblast (CTB) ve ölümcül diferansiye, multinükleatlı sintiyotrophoblast (STB). Tripsin sindirimi üzerine, CTB morfolojik olarak diğer hücre soylarından ayırt edilemeyen küçük yuvarlak hücrelerdir(Şekil 2A, sol panel). CTB'nin epiblast ve ilkel endoderm gibi diğer hücre soylarından ayrılması, tek hücreli RNA dizilimi ile ortaya çıkan farklı transkripsiyon profilleri ile elde edilebilir. Syncytiotrophoblast hücreleri kolayca diğer hücre tiplerinden önemli ölçüde daha büyük ve esas olarak embriyo nun çevresinde bulunan düzensiz şekilli yapılar olarak tanımlanabilir (Şekil 2A, orta panel; Şekil 2B, sol panel). Göçmen trofoblast hücreleri (MTB) embriyo genişletilmiş kültür sırasında bulunan başka bir trofoblast alt çizgi ve görünüşte embriyoana gövdesinden hareket olarak kabul edilebilir(Şekil 2A, sağ panel, Şekil 2B, sağ panel). Göçmen trofoblast, ekstra villous trofoblast (EVT) ile aynı belirteçlerin çoğunu ifade etmesine rağmen, plasentadaki villous yapılar gelişmenin bu çok erken evresinde ortaya çıkmadığından, EVT olarak adlandırılmamalıdır.

Deneysel olarak, embriyolar D8, D10 ve D12'de tek hücrelere sindirildikten sonra kolayca ayırt edilebilen küçük CTB ve büyük STB'yi toplayabildik(Şekil 2A,B). Göçmen trofoblastlar genişletilmiş embriyo kültürünün ileri evrelerinde ortaya çıkar ve tüm embriyonun enzimatik sindiriminden önce D12'de toplanabilir(Şekil 2A,B). Bu üç trofoblast alt çizgisini tek hücre analizinden önce fenotipik olarak ayırarak, spesifik transkripsiyonel belirteçleri ve her hücre türünün biyolojik rolünü tanımlayabiliriz. Sitotrophoblast son derece proliferatif ve STB ve MTB farklılaştırılmış soy^10,11,,12,13temininde progenitor hücreleri olarak hareket. Syncytiotrophoblast gebelik korumak için plasental hormonlar üretiminde yer alan ve aynı zamanda endometrium içine oyuk embriyolar sorumlu olabilir^10,11,12,13. Göçmen trofoblast bir invaziv, göçmen fenotip daha güçlü özelliklere sahiptir ve muhtemelen rahim endometrium^10,11,,12,13daha derin ve daha geniş kolonizasyon sorumludur. Her hücre tipinin transkripsiyon analizi, her hücre tipinin transkripsiyon izini tanımladıktan sonra, ctb'den morfolojik olarak ayırt edilemeyen ve sırasıyla^12'de STB ve MTB özelliklerine sahip transkripsiyonlara sahip iki ek hücre alt kümesini ortaya çıkarmış bulunmaktadır. Bu ara evre hücreler, CTB'den MTB veya STB alt geçitlerine ayırt etme sürecinde dir ve embriyolar körü körüne sindirilseydi ve hücreler tek başına transkripsiyonla ayrılsaydı gözden kaçırılırlardı.

Burada açıklanan protokol iki boyutlu (2D) kültür sistemi kullanır ve yeni geliştirilen 3D kültür sistemi¹³açıklayan yeni bir yayın tarafından önerilen üç boyutlu (3D) yapısal gelişimi desteklemek için en uygun olmayabilir. Yine de, bu 2D sistemde erken trofoblast farklılaşması in vivo örnekleri^14,15,,16,17yapılan gözlemler ile tutarlı gibi görünüyor. Bu protokol, en az değişiklikle en son tanımlanan 3B kültür sistemi^13'teki kullanıma da kolayca uyarlanabilir. Tüm adımlar, ticari olarak kullanılabilen tek kullanımlık uçlar veya kauçuk boru, filtre ve ağızlık bağlı ince çekilmiş cam pipet bir ağız pipet ile bir el mikromanipülasyon pipet ile gerçekleştirilir.

Tüm insan embriyoları araştırmada kullanılmak üzere rıza ile bağışlanmıştır. Genişletilmiş insan embriyosu kültürü için protokoller Batı Kurumsal İnceleme Kurulu (çalışma no. 1179872) tarafından onaylanmıştır ve uluslararası yönergeleri izleyin. İnsan embriyolarının herhangi bir şekilde kullanımı, bu protokolü kullanarak araştırma kurumuyla ilişkili uygun etik ve yönetim organları tarafından gözden geçirilmelidir.

1. Hazırlık

1. Steril laminar akış kaputunda embriyo ısınmasına bir gün önce ortam ve iyileşme plakaları hazırlayın.
   1. %10 v/v serum protein ikame (SPS) ile 2 mL blastosist kültür ortamı (BM) hazırlayın.
      NOT: Blastosist kültür ortamı ilave protein içerebilir veya içermeyebilir. Burada, belirtilen albumin proteininin %10'u ile takviye edilmesi gereken bir ortam kullandık. Bu ek varyasyon için üretici kılavuzunu kontrol edin. Tüm ortamlar, dengelemeden önce steril bir şırıngaya bağlı steril 0,22 μM filtre kullanılarak filtrelenmelidir.
   2. İki merkez-iyi organ kültürü yıkama bulaşıklarını 500 μL BM ile %10 v/v SPS ile doldurun ve 500 μL embriyo kültürü sınıfı yağ ile kaplayın.
   3. 60 mm'lik doku kültürü çanak kısmında, 8 mL'lik embriyo kültür yağı katmanı ve ardından kültür plakasının altına %10 v/v SPS ile 20 μL BM damlası çapalayın. Isınan her embriyo için 1 damla olun.
      NOT: Gerektiğinde daha fazla ortam, damla ve yıkama yemeği yapılabilir. Damlalar da yağ katmanlı önce çanak eklenebilir. Yağın altına demirleme damlaları buharlaşmayı ve osmolalitedeki sonraki değişiklikleri azaltmaya yardımcı olur.
   4. BM'yi 37 °C, %6 CO_2, %5 O₂ ve en az 4 saat boyunca bir kuluçka makinesinde %10 v/v SPS yıkama tabaklarını ve geri kazanım plakasını dengeleyin.
   5. Genişletilmiş kültür medyasının (IVC1) ilk adımının bir şişesini 4 °C'de veya bankın üstünde eritin.
   6. 500 μL IVC1'lik bir yıkama kabını yağ kaplaması olmadan hazırlayın. Aliquot yaklaşık 4 mL IVC1 5 mL snap kap tüp içine.
   7. IVC1 yıkama kabını ve IVC1'in küçük snap kap tüpünü 37 °C,%6 CO₂ ve atmosferik O_2'yi en az 4 saat eve yerleştirin.
2. Steril laminar akış kaputunda embriyo ısınmabir gün önce genişletilmiş kültür plakaları hazırlayın.
   1. Fosfat tamponlu salin (PBS) ile 30 μg/mL arasında insan serumundan gelen fibronektinseyreltin. Odaları kaplamak için embriyo başına 250 μL 30 g/mL fibronektin gerekli olacaktır.
   2. Kuyulara dokunmamaya özen verirken kaputun altındaki 8 kuyu odalı kapak paketini açın. Hafifçe pipet 250 μL 30 g/mL fibronectin her kuyuya.
   3. Kapağı odalı kapak kaymasına geri döndürün ve 4 °C'ye 20-24 saat süreyle yerleştirin.
3. Embriyo ısınma sabah genişletilmiş kültür plakası hazırlayın.
   1. Fibronektin ile odacıklı coverslip alın ve laminar akış kaputuna yerleştirin. 1 mL pipet ile fibronectin karışımı çıkarın ve atık kabına atın.
   2. Küçük 5 mL snap kap tüpten ısıtılmış, dengelenmiş IVC1 ortamını alın.
   3. Pipet 300 μL'lik ivc1 her kuyuya. Bu kontaminasyon riskini artıracak gibi herhangi bir sıvı kapağı dokunmasına izin vermemeye dikkat edin.
   4. IVC1 ile odacıklı kapak kaymasını 37 °C, %6 CO₂ ve atmosferik O_2'yi 4.

2. Isınma vitrifiye D5 insan embriyoları

NOT: Diğer üreticilerin kendi vitrifikasyon teknolojisine göre biraz farklı protokolleri olabilir. Gerektiğinde üreticinin kullanım talimatlarına bakın.

1. 35 mm çanak ila 37 °C arasında 3,0 mL erime çözeltisi (TS) sıcak. 300 μL seyreltme çözeltisi (DS) ve 300°L yıkama çözeltisi (WS) kuyusu 6 kuyulukta oda sıcaklığına getirin.
2. Forceps kullanarak, vitrifiye embriyo her zaman sıvı azot altında kalır sağlarken dikkatle kriyo cihaz kol çıkarın.
3. Kriyo cihazını sıvı nitrojenden hızlıca hareket ettirin ve 37 °C'de TS'deki kriyo cihazının ucunu daldırın. 1 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ve embriyo TS içine ayrılır kadar cryo cihazı batık tutun.
   NOT: Sıcak embriyolar, alt akım analizinde hasta demografik bilgileriyle ilgili olabilecekleri için embriyo kimliklerini takip etmek için birer birer.
4. TS 1 dk kuluçka sırasında, dikkatle kriyo cihazı kaldırmak ve yavaşça embriyo almak ve TS çanak karşı tarafına taşımak.
   NOT: Birden fazla embriyo kültüre, uygun kimlikleri nisbete tutulmasını sağlamak için embriyoları ayrı tutmak için gayretli olun.
5. 1 dakika sonra, yavaşça TS küçük bir miktar ile embriyo almak, yaklaşık 2 μL. Embriyoyu pipetten ince bir TS tabakası nda ts ile kaplarken embriyoyu 300 μL DS'nin altına taşıyın. 3 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ve oda sıcaklığında tezgah üst 6 iyi plaka yerleştirin.
6. 3 dakika sonra, embriyoyu az miktarda DS, yaklaşık 2 μL ile toplayın ve embriyoyu 300 μL WS içeren bir sonraki kuyunun dibine taşıyın. Yine, yavaşça embriyo üzerinde pipet DS küçük bir miktar katman. 5 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ve tezgah üst dönün.
7. 5 dakika sonra, WS en az hacimli embriyo almak ve 300 μL WS son kuyunun üstüne taşımak. Embriyo yavaş yavaş düşecek ve bünyeden dibe doğru yıkayın. Tutulan herhangi bir WS'yi pipetten boş bir kuyuya at.
8. Embriyoyu minimum hacimle toplayıp aynı 300 μL'lik WS kuyusuna geri dönün. Embriyo bir kez daha kuyunun dibine düşecek. 1 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ve tezgah üstüne 6-iyi plaka dönmek.

3. Isınmış embriyoların geri kazanımı

1. Birer birer, ısıtılmış embriyoları 500 μL'lik eşitlenmiş embriyo kültürü sınıfı yağın %10 v/v SPS'si ile 500 μL'lik dengelenmiş BM içeren merkezi bir organ dokusu kabına taşıyın.
2. Her embriyo yutarak embriyoları yıkayın ve hareket arasında eski medya üfleme sırasında çanak çeşitli alanlara hareket ettirerek. Embriyoyu al ve %10 v/v SPS yağ altında dengelenmis BM'nin 20 μL kültür damlasına taşıyın.
3. Isınan embriyolar 37 °C, %6 CO_2, %5 O 2'de bir kuvözde 2 saat boyunca_iyileşin.

4. Zona kaldırma

1. 2 saatlik bir iyileşmeden sonra, embriyoları yeniden genişleme için değerlendirin ve her embriyonun fotoğrafını çekin.
2. Embriyoları tek tek 3-(N-morpholno)-propansülfonik asit (MOPS)-tamponlu işleme ortamı ile %5 (v/v) fetal baldır serumu (FCS) ile asidik Tyrode solüsyonu ile tedaviden önce hareket ettirin.
3. Mikroskoptan aktif olarak izlerken bir embriyoyu 300 μL ısıtılmış asidik Tyrode çözeltisi boyunca hızlı bir şekilde hareket ettirin. Zona pellucida görsel olarak erimeye başlayacak. Bu yaklaşık 5 s sürer.
4. Hemen 300 μL ısıtılmış MOPS tamponlu orta asit Tyrode çözeltisi söndürmek için zona eriterek embriyo hareket ettirin.
5. MOPS tamponlu orta minimal hacmi ile embriyo taşımak bir merkezi iyi organ dokusu çanak içeren 500 μL dengelenmiş BM içeren 10% v / v SPS altında 500 μL dengelenmiş embriyo kültür sınıf yağ yıkamak için.
6. Embriyoyu adım 3.2'den 20 μL'lik iyileşme düşüşüne geri döndürün.
   NOT: Zona çıkarılmasını takiben yapılan görsel incelemede, zona pellucidae'li embriyolar gerekirse asidik Tyrode çözeltisi ile 4.2-4.6 adımlarını tekrarlayarak daha fazla tedavi edilebilir. Tyrode'un çözeltisine en aza indirgin bir şekilde istenir.

5. Blastosist genişletilmiş kültür

1. Embriyoları tek tek yıkama kabına, 1.1.6 adımdan eşitlendirilmiş IVC1 ortamıyla taşıyın. Bir embriyoyu, elenmiş IVC1 ile odalı kapaklı bir kuyuya dikkatlice taşıyın ve embriyo tanımlamasını koruyun.
   NOT: Orta buharlaşmayı en aza indirmek için bu adımın mümkün olan en kısa sürede tamamlanması gerekir.
2. 37 °C, %6 CO_2, atmosferik O₂ 2 gün boyunca 37 °C'ye ayarlanmış bir kuluçka makinesine döndürül.
   NOT: 37 °C, %6 CO_2, atmosferik O₂ ortam değişimi için 4 saat önceden ortamları eritmeye ve dengelemeye dikkat edin.
3. D2 'de (D7 sonrası döllenme) embriyoların mikroskop altında eki dikkatle inceleyin ve medya alışverişi gerçekleştirin.
   1. Ortam alışverişinden önce hangi embriyonun yemeğe bağlı olduğunu unutmayın. Plakaya hafifçe dokunun ve bir embriyonun mikroskop altında plakaya güvenli bir şekilde bağlanıp bağlanmadığını inceleyin.
   2. Kapağı çıkarın ve 150 μL'lik IVC1'i dikkatlice çıkarın ve bağlı embriyoyu rahatsız etmemek için atın. Eğer bir embriyo henüz plakaya bağlı değilse, IVC1'deki serum embriyo ekinde yardımcı olacağı için ortam değiştirmeyin.
   3. Pipet 150 μL denli genişletilmiş kültür ortamı, IVC2, yavaş yavaş her kuyuya ve odacıklı kapak kapağı kapağı na geri dönün.
      NOT: Orta buharlaşmayı önlemek için kapağın odalı kapak tan çıkarılmasının en aza indirilmesini sağlayın.
4. Odacıklı kapak kapağını, kapağın üzerine herhangi bir ortam sıçramadan kuvöze dikkatlice geri döndürün. Embriyolar fiksasyon veya tek hücreli sindirim için hazır olana kadar genişletilmiş kültürün her gün medya değişimi ve eki kontrol tekrarlayın.

6. Harcanan ortamın isteğe bağlı olarak toplanması

1. İsteğe bağlı olarak, D7'den sonra veya sonraki herhangi bir gün kültür ortamı alışverişi sırasında harcanan medyayı toplayın. Adım 5.3.2 sırasında, orta snap-freeze 150 μL çıkarılan IVC1 steril, düşük bağlayıcı 0,5 mL tüp içine atmak yerine ileride analiz için.

7. İmmünfluoresans için isteğe bağlı fiksasyon

1. Herhangi bir hücre dışı enkaz kaldırmak için fiksasyon önce 3x için PBS 1/2 medya alışverişi ile embriyoyıkamak için 200 μL pipet kullanın. Aşırı enkaz ve proteinin yıkanması, netliği optimize etmeye ve immünoresans ile elde edilen görüntülerde arka planı azaltmaya yardımcı olacaktır.
2. Tüm ortamları çıkarın ve pbs'deki %4 paraformaldehitin (PFA) 200 μL'sini yavaşça kuyuya ekleyin. Embriyo sıvının yüzeyine yapışmak isteyecektir. Tüm sıvıyı çıkarmadan önce %4 PFA ile birden fazla 150 μL yıkayarak embriyodaki hasarı en aza indirmeye yardımcı olur.
3. Fiksasyon için 20 dakika için% 4 PFA embriyolar inkübasyon.
4. Embriyoları yıkama başına 10 dakika boyunca 3x yıkayın ve 200 μL %0,1 v/v polisorbat 20 taze PBS'de.
5. Sabit embriyoları immünoresans protokolüne geçmeden önce 4 °C'de PBS'de %0,1 v/v polisorbat 20 olarak saklayın.

8. Trypsin ile tek hücreli sindirim

NOT: Taze (sabit olmayan) embriyolar tek hücreli sindirim için kullanılır.

1. Embriyoyu 200 μL PBS ile bir kez yıkayın ve her kuyuya 200 μL tripsin çözeltisi ekleyin. Odacıklı kapak lını 5 dakika boyunca kuvöze geri döndürün.
2. Odacıklı kapak kapağını kuvözden çıkarın ve embriyoları stereoskop altında inceleyin. Embriyonun çevresinde bulunan hücreler geri çekilmeye başlar ve MTB yine de embriyodan uzakta bulunan tabağa iliştirilmelidir.
3. Tüm embriyo parçalamadan önce tek tek MTB almak için küçük bir pipet veya ince çekilmiş ağız pipet kullanın. MTB'yi kurtarmak için adım 9.1'e geçin ve adım 9.3'ten sonra adım 8.4'e dönün.
4. Embriyoyu hafifçe aşağı yukarı keserek ayrıştırmak için el yapımı mikromanipülasyon pipetveya ağız pipeti kullanın.
5. Hücreler tüm embriyodan ayrışmaya başlayacak. Embriyo tripsin toplam 10 dakika kuluçkaya yatırılanakadar daha küçük çaplı pipet ucu veya ağız pipetini kullanarak embriyoyu nazikçe ve tekrar tekrar aspire etmeye devam edin.

9. Tek hücre seçimi ve örnek toplama

1. Minimal tripsin ile, herhangi bir hücre kaybetmemek için bakım ile bakım ile embriyo kültürü yağı altında 20 μL PBS + 0.1% polivinilpyrrolidone (PVP) üç yıkama damla ile ayrışmış hücreleri hareket ettirin.
2. Hücreleri yıkadıktan sonra, bir hücre seçmek için ince çekilmiş cam pipet kullanın. Tek hücreyi pbs+%0,1 PVP hacmien az olan steril 0,2 mL düşük bağlamalı bir tüpe dikkatlice pipetlayın.
3. Tek hücreleri sıvı nitrojende (LN₂₎tutturun ve ileride kullanım için -80 °C'de saklayın.

Sağlıklı embriyolar genişletilmiş kültür boyunca sürekli çoğalma sergilediler (Şekil 2B). Anormal embriyolar dış kenarlarından geri çekilmeye ve parçalanmaya başladılar (Şekil 2C

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.