Hipokampal nörogenezi incelemek için bir araç olarak kablosuz elektrofizyoloji ve hafıza davranış testinin eşzamanlı izlenmesi

Davranış testi, in vivo bağlamda üretilen büyük miktarda bilgi için sinirbilim araştırmalarında çok önemlidir. Bu bağlamda, araştırmacılar duyusal-motor fonksiyonu, sosyal etkileşimleri, anksiyete benzeri ve depresif benzeri davranışları, madde bağımlılığını ve çeşitli bilişsel işlev biçimlerini analiz etmek için farklı davranış testlerini yaygın olarak kullanmaktadırlar¹. Davranış testlerinin manuel olarak kaydedilmesi, çoğu uzman gözlemci için bile zor, yorucu ve yanlış olabilir. Davranış kaydı için özgür ve açık kaynaklı yazılım geliştirmek için bazı çabalar sarf edilmiş olsa da (örneğin, cinsel davranış için sexrat male² uygulaması), çeşitli alternatifler balık^3'ten kemirgenlere kadar farklı hayvan türlerinin otomatik ve gerçek zamanlı davranışsal kaydına izin verir ^4,5,6. Video izleme, çok çeşitli uygulamalarda kullanılan hızlı ve doğru davranış kaydı için değerli bir yöntemdir⁷. Davranışsal kayıt alanındaki daha potansiyel bir özellik, davranışsal tezahür sırasında sinirsel aktiviteyi araştırmaktır. Nöronal aktivitenin (tek hücrelerden büyük beyin bölgelerine) ve davranışsal görevlerin eşzamanlı olarak kaydedilmesi, beynin belirli davranış kalıplarını nasıl oluşturduğunu bize gösterebilir⁸. Davranışlar, nöral aktivite ile hareketler veya eylemler arasındaki korelasyonları ortaya çıkarabilecek küçük bileşenlerin bir dizisidir. Nöronal aktivite ve davranış kalıpları aynı anda birden fazla zaman ölçeği ile kaydedilebiliyorsa, her beyin durumunun her bir belirli davranışla nasıl ilişkili olduğunu açıklayabilirler (davranışsal kaydın daha derinlemesine bir incelemesi için^bkz. Bu nedenle, davranışsal ve nöronal aktivitenin istenen ölçekte (nöronlardan beynin geniş alanlarına kadar) senkronize olarak kaydedilmesi son derece yararlı bir araç olarak kabul edilir. Davranışsal kayıtları nöral aktivite ^4,5 olarak diğer ölçümlerle bütünleştirmeyi amaçlayan birkaç sistem vardır.

Elektroensefalografi, klinik ve araştırma sinirbilimi alanında en yaygın kullanılan tekniklerden biri olarak kabul edilmesine rağmen, nispeten yüksek hareketliliğin yanı sıra EEG kayıt cihazının boyutu, bu tekniği in vivo modellerde tespit için benzersiz ve zor kılmaktadır⁹. Bu soruna bazı çözümler geliştirilmiştir, örneğin, hayvanların arenada serbestçe hareket etmelerini sağlayan kabloların ve döner cihazların kullanılması. Bununla birlikte, kablo tabanlı sistemler genellikle çalışma yapmak için problemler ortaya çıkarır, örneğin, bir hayvanın bir kafesten diğerine aktarılması sırasında, hayvanın kablolarla engellenmesi veya dolaşması gözlenir. Kayıt durumunun esnekliğini artırmak için kablosuz elektrofizyolojik kayıtlar için telemetrik cihazlar geliştirilmiştir^10,11. Bununla birlikte, bu tür sistemler düşük kayıt kanalı sayısı ve düşük örnekleme oranları nedeniyle önemli sınırlamalar göstermiştir¹¹. Bu çalışmada, serbestçe hareket eden bir kemirgen sistemi¹² ile bir Wi-Fi bağlantısı üzerinden hayvandan EEG sinyalleri gönderen ticari olarak temin edilebilen bir kablosuz sistem kullandık. Cihaz 6 gram ağırlığındadır ve 1 kSps'de kaydedilen 16 kanala kadar ayakta durur. Bu sistem, hayvan ortamında EEG veya başak kaydına izin verir, daha az rahatsızlık verir ve piyasadaki geleneksel elektrofizyolojik sistemlere kıyasla ekonomik bir çözüm olarak hizmet eder. Ek olarak, EEG ve davranış kalıpları arasında korelasyon sağlamak için bu verileri bir video izleme yazılımı kullanarak senkronize ettik. Bu eşitleme, her iki sistem tarafından oluşturulan zaman damgalarına dayalı veri ve olayların hizalanması ve enterpolasyonu ile çevrimdışı olarak yapılır ve MATLAB'da işlenir.

Erişkin nörogenezi, hayvanların dentat girusunda yeni oluşan hücrelerin nöronlarında çoğalma, hayatta kalma ve farklılaşma olarak tanımlanır^13,14. Bu sürecin, zenginleştirilmiş çevre (EE) koşulları yoluyla kemirgenlerde yetişkin nörogenezini artıran hafıza ve öğrenme gelişimi ile ilişkili olduğu bilinmektedir¹⁵. EE, hayvanların yeni ve karmaşık olduğu, ancak biyolojik olarak hiçbir ilgisi olmadığı oyuncaklar ve tüplerle donatılmış büyük bir kafes içinde küçük gruplar halinde kemirgenleri barındırmaktan oluşur¹⁵. EE, hipokampal nörogenezi uyarmasına rağmen, yaş, hayvan suşu, spesifik stimülasyon koşulları veya nörojenez tespit prosedürü gibi birçok faktöre de göre değişir. Yedi gün boyunca EE muhafazasına maruz kalan orta yaşlı farelerde, hipokampal dentat girusta (DG) yeni granüler hücrelerin (GC) doğumu bildirilmiştir¹⁶. Erişkin sıçanlarda erişkin nörogenezini seçici olarak ablate etmeye çalışan çalışmalar, öğrenilen yanıtta yaklaşık 1-2 haftalık yeni granüler hücrelerin gerekli olduğunu ileri sürmüştür¹⁷. GC'nin yetişkinlerde DG'de doğmasından yaklaşık 2 veya 3 hafta sonra, uyarıcı sinaptik iletim¹⁸ için gerekli olan dendritik dikenler gibi çeşitli karakteristik özellikler ortaya çıkmaya başlar. Zhao ve ark., omurga büyümesinin zirvesinin ilk 3-4 hafta boyunca gerçekleştiğini göstermek için nicel bir analiz yaptılar¹⁹. Birkaç elektrofizyolojik in vivo çalışma, sadece üç haftalık EE barınma koşullarının DG'nin sinaptik iletiminde değişiklikler yarattığını ve hücre uyarılabilirliğini arttırdığını göstermektedir²⁰. Ayrıca, BrdU enjeksiyonlarından 1-4 hafta sonra zenginleştirilmiş bir ortama maruz kalmanın, farelerde DG granüler tabakasındaki BrdU / NeuN hücrelerinin yoğunluğunu önemli ölçüde arttırdığı bildirilmiştir²¹. Bu yazarlar, EE maruziyetinden bir ila üç hafta sonra kritik bir dönemin var olduğunu, çünkü yeni nöronların sayısında önemli bir artış gözlendiğini öne sürmektedir²¹. İnsanlarda yetişkin hipokampal nörogenez (AHN) çalışmaları, doğrudan kanıt bulunmadığından tartışmalıdır. Bununla birlikte, yakın tarihli bir rapor, AHN'nin insan yetişkin beynindeki gelişim aşamalarını tanımladı, DG'deki binlerce olgunlaşmamış nöronu tanımladı ve böylece insanlarda yaşlanma sırasında AHN'nin önemini gösterdi²². Daha önce bahsedilen kanıtlara dayanarak, AHN'nin hayvan modellerinde incelenmesi her zamankinden daha önemlidir (AHN'nin daha derinlemesine bir incelemesi için bkz. Leal-Galicia ve ark., 2019 inceleme¹⁵).

Daha önce de belirtildiği gibi, hipokampus öğrenme ve hafıza kapasitelerinde temel bir işleve bağlanmıştır. Anıların oluşumu üç ayrı süreçten geçer: kodlama (bellek edinimi), konsolidasyon (bellek depolama) ve geri alma (bellek tanıma)²³. İnsanlarda tanıma hafızası, görsel eşleştirilmiş karşılaştırmalar görevi²⁴ kullanılarak test edilir. İnsan ve hayvan hafıza ve amnezi modellerinin temelleri, görsel eşleştirilmiş karşılaştırmalar görevinin insanlarda yaptığı gibi, daha önce sunulan bir uyaranı^25,26 tanıma yeteneğini değerlendiren davranışsal testlerdir. Bu nedenle, bir kemirgenin daha önce sunulan bir uyaranı, yani öğrenme ve hafıza kapasitesini tanıma yeteneğini değerlendirmek için en çok kullanılan davranış testlerinden biri, kendiliğinden yeni nesne tanıma görevidir (NORT)^23,27. NORT protokolü, edinme denemesinde 10 dakika boyunca tanıdık bir arenada iki özdeş yeni nesneden oluşur. 0²⁸ ila 48 saat²⁹ arasında belirli bir süre sonra (her protokole göre değişken zaman), hayvan aynı tanıdık nesnelerden birini ve bir yeni nesneyi içeren aynı arenaya geri döndürülür. Hayvan, tanıdık nesne ezberlenmişse yeni nesneyi kendiliğinden araştırır²⁶. Tercih oranı, keşif performansının değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılır. Toplam nesne keşif süresinin, romanın veya tanıdık nesnenin keşif süresine bölünmesiyle belirlenir. NORT'un diğer tanıma belleği testlerine göre bazı avantajları vardır. En önemlisi, hiçbir dış motivasyon, ödül veya ceza gerektirmez. Stresli koşullar yaratmaz. Son olarak, nesneleri keşfetme davranışını uyandırmak için herhangi bir eğitime gerek yoktur (NORT'un daha derinlemesine bir incelemesi için bkz. ^ref.23).

Bu nedenle, çoklu veri modalitelerinin eşzamanlı olarak kaydedilmesi ve yetişkin hipokampal nörogenezin bir etkisi olarak öğrenme ve hafıza çalışmalarına entegrasyonu oldukça caziptir ve alandaki araştırmacılar için zorlayıcı bir çözüm sunmaktadır. Bu çalışma, eşzamanlı davranışsal video izleme değerlendirmesi (yeni nesne tanıma görevi) ve kablosuz elektroensefalografi kaydında yer alan tüm süreçleri ortaya çıkaracaktır. Burada elektrot üretim süreci, epidural (kafatası vidası) elektrot implantasyon cerrahisi, çevresel zenginleştirme protokolü (hipokampal nörogenez indüksiyonu için), NORT protokolünü takiben, BTS kurulumu, gerçek zamanlı eşzamanlı izleme için EEG – BTS kuplajını ve MATLAB hesaplama ortamında yürütülen EEG ve davranış verileri analizini gözden geçirdik.

Tüm prosedürler, Ulusal Sağlık Kurumları ve yerel Meksika yasaları tarafından hayvan refahı için kullanılan hayvan sayısını azaltmak ve hayvanların acı çekmesinin yasaklanması için uygulanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nu (NIH Yayınları N°. 8023, 1978'de gözden geçirilmiştir) takip etmektedir. Universidad Iberoamericana Etik Kurulu, bu çalışmada hayvanların kullanımı için deneysel protokolleri onayladı.

1. Genel kurulum

1. Davranış İzleme Yazılımını üretim talimatlarına göre bir bilgisayara kurun.
2. Kamerayı doğrudan cihazın üstüne, aşağı bakacak şekilde monte edin. Fotoğraf makinesi bilgisayara bağlı olmalıdır.
3. Fotoğraf makinesinin gerektirdiği sürücü yazılımını yükleyin (üretim talimatlarını izleyerek).
4. Fotoğraf makinesinde yakınlaştırma lensi varsa, bunları fotoğraf makinesinin ekranına mükemmel şekilde sığacak şekilde ayarlayın.
5. Üretim yazılımını takiben fotoğraf makinesi otomatik netleme (AF) modunu kapatın.
6. Kameranın gerçek zamanlı olarak düzgün çalıştığından emin olun ve kullanıma hazır olana kadar video çekim modunu test edin.

2. Çevresel zenginleştirme protokolü (bkz. Şekil 1)

NOT: Bu deney için üç aylık erkek Wistar sıçanları kullanıldı ve doğal karanlık ışık koşullarında muhafaza edildi.

1. Talaş yataklarını şeffaf bir akrilik kare arenaya (500 x 500 x 500 mm) yerleştirin.
2. Kemirgenlerin etkileşime girmesi için arenaya üç farklı türde oyuncak koyun (örneğin, aktivite tekerlekleri, çift güverte, merdivenler vb.).
3. Dört adet 2 inç ve dört kavisli gri opak PVC tüp ekleyin.
4. Yiyecek ve su sebillerine hayvanlara ad libitum erişimi sağlayın.
5. Vivarium odasının içine kafes başına üç kemirgen düzenli koşullar altında yerleştirin.
6. Hayvanları bu arenada ilgili protokole göre gereken süre boyunca bırakın. Bu deneyde, hayvanlar 20 gün boyunca arenanın içinde kalmalıdır.
   NOT: Elektrot implantasyon ameliyatından sonra hayvanlar çevresel zenginleştirme tedavisine geri dönmezler. Bunun yerine, yeni nesne tanıma testi tamamlanana kadar tek kafeslere konuldular.

3. Elektrot üretim süreci

1. Bir parça bakır teli yaklaşık 2 cm'de kesin ve her iki ucundan yaklaşık 0,5 cm ovalamak için bir zımpara kağıdı kullanın.
2. Bakır telin bir ucunu küçük boyutlu bir vidanın (elektrotlar) kafasına yuvarlayın ve bu çok önemli bir adım olduğu için sıkıca sabitlendiğinden emin olun. EEG sinyallerindeki artefaktları önlemek için her iki malzeme arasında doğru temas garanti edilmelidir.
3. Diğer ucu konektörün terminal ucuna yerleştirin ve ince forseps kullanarak takviye edilerek düzgün bir şekilde sabitlendiğinden emin olun. Bu uç bir amplifikatör kablosuyla bağlanmalıdır.
4. Bir multimetre kullanarak uçtan vidaya uygun iletkenliği ölçün. Bu işlem, elektrot bağlantısının düzgün bir şekilde takıldığını garanti eder.

4. Epidural (kafatası vidası) elektrot implantasyon cerrahisi

NOT: 20 günlük çevresel zenginleştirme işleminden sonra, hayvanlar aşağıda açıklanan prosedürü izleyerek ameliyata tabi tutulacaktır:

1. Hayvana bir Ketamin / Ksilazin kokteyli (90/10 mg / kg, i.p.) enjekte edin.
   NOT: Hava yolu tıkanıklığını önlemek için, sıçan hareket etmeyi bırakana kadar bekleyin, ardından muhafaza kafesinden çıkarın ve hayvanı düz bir yüzeye yerleştirin. Önleyici analjezi olarak steroid olmayan bir anti-enflamatuar (meloksikam 1 mg / kg, s.c.) ve bir antibiyotik (enrofloksasin 2.5 mg / kg, p.o.) enjekte edin.
2. Sıçan tamamen uyuşturulduktan sonra, sıçanın baş bölgesini tıraş edin.
   NOT: Ameliyata devam etmeden önce hayvanın tamamen uyuşturulduğundan emin olun. Bacaklardan birini veya kuyruğu dikkatlice sıkıştırın. Hayvan uyarana tepki verirse, birkaç dakika daha bekleyin ve tekrar çimdikleyin. Hayvan tutamağa tepki vermezse, bir sonraki adıma geçin. Gerekli ekipman mevcutsa, güvenlik için daha kolay titre edildiğinden, gaz anestezisinin (izofluran gibi) kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
3. Her iki kulağı da önce kulak çubuklarıyla sabitleyerek hayvanı stereotaksik aparata yerleştirin (hayvanın iç kulağına zarar vermemeye dikkat edin). Son olarak, ön dişleri ısırık çubuğunun üzerine yerleştirin ve burun çubuğunu sabitleyin.
   NOT: Hayvana tüm ameliyatlar için bir ısıtma yastığı sağlayın, çünkü bu prosedürde kullanılan anestezi genellikle hipotermiye ve solunum problemlerine neden olur.
4. Baş bölgesinin üst kısmını, üç alternatif tur Klorheksidin veya iyot bazlı ovma ve ardından tuzlu su veya alkol durulaması kullanarak temizleyin.
5. Lidokaini deri altından (20 mg / mL) baş bölgesinin derisinin altına (0.5 mL) uygulayın.
6. Kurumamasına yardımcı olmak için her hayvanın gözlerine her 5-10 dakikada bir damla oftalmik çözelti veya salin damlatın.
7. Bir neşter kullanarak, kafatasının üst bölgesini düzgün bir şekilde ortaya çıkarmak için anteriordan posterior yöne yaklaşık 2 cm'lik bir kesi yapın.
8. Bulldog kelepçelerini kullanarak cildi geri çekin ve kafatasının üstündeki dokuyu kazıyın.
9. Elde edilen bregma koordinatlarını tanımlayın ve kaydedin.
10. Bregma'dan başlayarak, stereotaksik Paxinos ve Watson Atlas^30'u kullanarak, elektrotların sabitleneceği yedi noktanın (koordinatların) her birinin konumunu bulun ve işaretleyin.
    NOT: Bu deneyde, F3, F4 vidaları (+Bregma'dan 2,0 mm, orta hattan 2,25 mm yanal); C3, C4 vidalar (Bregma'dan -3,0 mm, orta hatta 2,75 mm yanal); ve P3, P4 vidaları (Bregma'dan -7.0 mm, orta hattan 2.75 mm yanal) takıldı. Zemin referansı olarak burun kemiğinin (NZ) arka kısmında yedinci bir vida yerleştirildi (bkz. Şekil 2).
11. Değişken hızlı bir matkap aleti kullanarak, işaretlerin her birinde uç boyutu 2 (uzunluk 44,5 mm) olan bir delik açın, kafatasına tam olarak nüfuz etmemeye dikkat edin.
12. Elektrodu deliğe yerleştirin ve kafatasına dikkatlice vidalayın.
13. Yedi vidanın tümü uygun şekilde sabitlenene kadar 4.10 ve 4.11 adımlarını tekrarlayın.
14. 7 vidanın hepsini ilk kat diş çimentosu ile sabitleyin. Her elektrodu bir konektöre yerleştirin. Telleri tamamen ikinci bir diş çimentosu tabakası (hayvanın vidaları çekmesini önleyecektir) ve konektörün tabanı ile örtün. Gerekirse, EEG cihazının uygun şekilde bağlanabilmesi için EEG konektörünü uygun bir bağlantı için temiz bırakarak üçüncü bir diş çimentosu tabakası ile örtün (bkz. Şekil 3).
    NOT: Her bir çift çift vidayı yerleştirdikten sonra, bunlar diş çimentosu ile sabitlenebilir (isteğe bağlı adım).
15. Sıçanı gece boyunca ameliyat sonrası bakımda bırakın. Hayvanı gözlemleyin ve ameliyattan sonra 1-2 saat boyunca hayvana bir ısıtma yastığı sağlayın, çünkü bu prosedürde kullanılan anestezi genellikle hipotermiye ve solunum problemlerine neden olur.
16. Dehidrasyonu önlemek için deri altından 50mL / kg / 24h (bakım dozu) salin çözeltisi uygulayın. Ameliyattan sonra ve sonraki 24 saat boyunca steroid olmayan bir anti-enflamatuar (meloksikam 2 mg / kg, s.c.) ve bir antibiyotik (enrofloksasin 5 mg / kg, p.o.) enjekte edin.
17. Ameliyattan sonra, davranış testlerini yapmadan önce yedi gün boyunca tam iyileşme için sıçanları tek kafeslerde tutun.
18. Gelecekteki manipülasyonlarda stresi azaltmaya yardımcı olmak için hayvanı periyodik olarak (günde en az bir kez) yavaşça manipüle edin. Sıçanı bir elinizle tutarken, parmakları kürkten kaydırarak hayvanın arkasına hafifçe parmak basıncı uygulanır. Kafa yarasını, sağlık durumunu, genel olarak davranışı ve vücut ağırlığını ameliyattan sonraki bir hafta boyunca kontrol edin.
    NOT: Hayvanda herhangi bir anormallik veya hastalık / stres belirtisi bulunursa, sorumlu veteriner hekime bildirin. Bu süreden sonra Novel nesne tanıma testi ve EEG kayıt tekniğini uygulayın.

5. Yeni nesne tanıma testi (NORT)

NOT: Ameliyattan yedi gün sonra davranış testlerine geçin. Sunulan deneydeki tüm davranışsal prosedürler, sıçanın ışık döngüsüne karşılık gelen 14 saat 00 dakika ile 16 saat 00 dakika arasında gerçekleştirilmiştir.

1. Sıçanın üzerine yumuşak kumaştan yapılmış bir yelek (EEG cihazının davranış testi sırasında yerleştirileceği) yerleştirin. Davranış testini yapmadan önce 2-3 gün boyunca alışkanlığa izin verin.
2. Loş ışıkla aydınlatılmış bir kayıt odasına siyah akrilik kare bir arena (500 x 500 x 500 mm) yerleştirin.
3. İki özdeş yeni nesneyi çift taraflı bant kullanarak arenanın taban merkezine sabitleyin (hayvanlar tarafından yer değiştirmesini önlemek için). Nesneler birbirinden ve arena duvarlarından eşit uzaklıkta olmalıdır.
4. Her nesneyi önceden %50 etanol ile ve her denemeden sonra arenanın zeminini iyice temizleyin (koku alma ipuçlarını önlemek için).
   NOT: Her seansa başlamadan en az yarım saat önce hayvanları daima barınak odalarına (vivaryum odasından deney odasına) aktarın. Kayıt oturumunu tamamladıktan sonra, hayvanları deney odasında bir saat daha bırakın. Bu, bu testin performansını etkileyebilecek stresten kaçınmak içindir.
5. Her teste başlamadan önce EEG cihazını bağlayın. Hayvanı nazikçe dizginleyin ve EEG kiti hayvanın sırtına takılı olarak kabloyu hayvanın kafasındaki konektöre sıkıca takın (bkz. Şekil 4). Yalnızca bir konuma izin verilir.
   NOT: Hayvanın nazikçe önceki manipülasyonu, bağlantı prosedürü sırasında hayvanlardaki stresi azaltmaya yardımcı olabilir. Aksi takdirde, cihaza veya hayvanlara zarar verme riski artar. Bir USB Bağlantı Noktası kullanarak cihazın pilini tamamen önceden şarj edin.
6. Yeni nesne tanıma testleri aşamaları
   1. Alışkanlık: Hayvanı art arda iki gün boyunca 5 dakikalık aralıklarla tutun ve hemen ardından hayvanı arenaya yerleştirin (herhangi bir nesne olmadan) ve 10 dakika boyunca özgürce keşfetmelerine izin verin.
      NOT: Herhangi bir edinme ve hafıza testi seansı yürütmeden önce, sıçanlar dikkatli bir şekilde ele alındı ve teste başlamadan önce uygun şekilde sabitlenen ilgili EEG cihazına bağlandı.
   2. Edinme Oturumu: Hayvanı, nesnelerin karşısındaki duvarlardan birine bakan arenaya yerleştirin. Hayvanların 10 dakika boyunca özgürce keşfetmelerine izin verin. Davranışsal İzleme Yazılımını kullanarak test kaydı için adım 6.13'e gidin.
      NOT: EEG cihazının yeleği farenin arkasına tuttuğundan emin olun (hayvanın uygun şekilde izlenmesini sağlamak için). Ek takviye için, maskeleme bandı kullanın.
   3. Kısa süreli bellek testi (SMT): Nesnelerden birini şekil, renk ve doku bakımından tamamen farklı herhangi biriyle değiştirin. Hayvanı, edinme oturumundan 2 saat sonra, nesnelerin karşısındaki duvarlardan birine bakan arenaya yerleştirin. Hayvanın 10 dakika boyunca serbestçe keşfetmesine izin verin. Davranışsal İzleme Yazılımını kullanarak test kaydı için adım 6.13'e gidin.
   4. Uzun süreli bellek testi (LMT): Kullanılan nesneyi, kısa süreli bellek testinden şekil, renk ve doku bakımından tamamen farklı herhangi biriyle değiştirin. Hayvanı, edinme oturumundan 24 saat sonra, nesnelerin karşısındaki duvarlardan birine bakan arenaya yerleştirin. Hayvanın 10 dakika boyunca özgürce keşfetmesine izin verin Davranışsal İzleme Yazılımını kullanarak test kaydı için adım 6.13'e gidin.

6. Davranış izleme yazılımı kurulumu

1. Davranış İzleme Yazılımı'nı açın.
2. Kurumun kullanıcı adını ve parolasını kullanarak hesapta oturum açın.
3. "Yeni boş deneme"ye dokunun ve protokol için bir ad seçin (ör. "NORT").
4. "Video izleme modu"nu seçin.
   NOT: Bu denemede, kamera video izlemeyi canlı olarak yayınlamak üzere ayarlanmıştır. Ancak, önceden kaydedilmiş videoları seçmek için ek bir seçenek vardır.
5. "Cihaz" a gidin. Turuncu dikdörtgeni yansıtılan arenanın sınırlarına ayarlayarak arena alanını tanımlayın. Nesnenin bölgesini belirleyin, ekrandaki kameradan yansıtılan arenanın içindeki nesne sınırındaki turuncu daireleri sığdırın.
6. Ölçeği hareket ettiren cetvel çizgisini görüntünün bilinen uzunluğu (arena) boyunca bir konuma ayarlayın. Nesnenin uzunluğunu milimetre cinsinden Ayarlar panelindeki "Cetvel çizgisinin uzunluğu" seçeneğine girin. Bu durumda, arena 500 x 500 mm ölçülerindedir.
7. "İzleme ve davranış"a gidin. "Bölgeler"e devam edin. "Öğe ekle" menüsünü tıklayın ve "Yeni Bölge" yi seçin. Arena alanını seçin ve yeni bölgeyi adlandırın (örneğin, "Alan").
8. Önceki adımı nesnelerin alanıyla tekrarlayın ve yeni bölgeyi adlandırın (örneğin, "Nesneler").
9. "Hayvan rengi" ne gidin ve "Hayvanlar cihaz arka planından daha hafif" seçeneğini seçin.
   NOT: Bu deney için beyaz (Wistar) sıçanlar kullanılmıştır. Bununla birlikte, yazılımın siyah ve benekli sıçanlar kullanan araştırmacılar için ek seçenekleri vardır. Her iki hayvan ırkı da aynı deneyde kullanılabilir.
10. "Hayvanın başını ve kuyruğunu izleme" ye gidin ve "Evet, hayvanın başının ve kuyruğunun izlenmesini istiyorum" u seçin.
11. "Test" bölümüne gidin | "Aşamalar" ve "Öğe ekle" menüsünden "Yeni aşama" yı seçin. Yeni aşamayı "Edinme" olarak adlandırın. Aşamanın süresini tanımlayın (örneğin, 600 sn).
12. "Kısa süreli hafıza testi" ve "Uzun süreli hafıza testi" aşamalarının önceki adımını tekrarlayın.
    NOT: Bu protokolde, tüm aşamalar aynı süreye sahiptir (10 dakika).
13. "Prosedürler"e gidin. Her aşama için izlenecek olayları tanımlayın (edinim, kısa süreli hafıza testi ve uzun süreli hafıza testi).
14. Teste başlayın (her hayvanla). "Testler"e gidin (üst menü çubuğunda) ve "Test ekle (+)" seçeneğini seçin. Test edilecek hayvan için bir sayı atayın (örneğin, "1").
15. "Kaydet"i seçin ve hayvanları ve oturumu adlandırın (örneğin, "M1 Acq").
16. Hayvanı arenaya yerleştirmeden önce, "Oyna" düğmesine bir kez tıklayın. "Başlamak için bekliyor" mesajı görüntülenecektir.
17. Hayvanı arenaya yerleştirdikten sonra, "Oyna" düğmesine ikinci kez tıklayın. Test otomatik olarak başlayacak ve bitecektir.
18. Kısa süreli hafıza testi (edinme oturumundan 2 saat sonra) ve uzun süreli hafıza testi (edinme oturumundan 24 saat sonra) için 6.13-6.16 arasındaki adımları tekrarlayın.

7. Kablosuz elektrofizyoloji cihazı kurulumu

1. Modemi bir bilgisayar ana bilgisayarına bağlayın ve açın. Bilgisayardaki diğer tüm ağ cihazlarını kapatın. Tercihen, kayıt odasındaki Bluetooth, cep telefonları, diğer modemler ve hatta kablosuz telefonlar gibi diğer kablosuz iletişimleri susturun.
2. Amplifikatörü adım 5.5'te belirtildiği gibi sıçanın sırtına takın.
3. Pili takarak EEG cihazını açın.
   NOT: Cihazı bağladıktan 2 s sonra, EEG amplifikatörü üzerindeki kırmızı bir led yanıp sönerek modemle iletişimin aktif olduğunu gösterir ve ardından yeşil led yanar. İletişim başarılı olursa, modem üzerindeki LED'ler sürekli yanıp sönmeye başlayacaktır. Amplifikatör artık modeme bilgi göndermeye hazırdır.
4. EEG yazılımını başlatın ve kablosuz EEG alma cihazına entegre etmek için üretici talimatlarına göre ayarlayın
5. "Ekranı Başlat" düğmesine basın. EEG yazılımı gerçek sinyal alımını gösterecektir.
   NOT: Deneme sırasında eksik bilgileri önlemek amacıyla "Gerçek zamanlı" öncelik modunu atamak için "Windows Görev Yöneticisi"ni kullanın.

8. Elektroensefalografi (EEG) sinyal kaydı

1. EEG yazılımının veri topladığını doğruladıktan sonra, Davranışsal İzleme yazılımını başlatın ve hayvanın gözlem bölgesinde olduğunu ve kurulumun doğru çalıştığını doğrulamak için deneysel protokol ayarlayın.
2. Bu noktada, "Kaydı Başlat" düğmesine basarak EEG yazılımı kaydını başlatın. Alma sinyalinin çalışıp çalışmadığını kontrol ettikten sonra, BTS'de denemeye başlayın.
3. Deney bittikten sonra, EEG yazılımına geri dönün ve kayıt işlemini durdurun. Kayıt, aşağıdaki biçim kullanılarak kayıt tarihinden oluşan varsayılan bir ad kullanılarak kaydedilir: "yyyy-mmdd-hhmm_SubjectID_Ephys.plx". Varsayılan olarak, tüm kayıtlar EEG yazılımı (NeurophysData) klasörüne kaydedilir.
4. Her iki veri dosyasının da oluşturulup oluşturulmadığını denetleyin. Karışıklığı önlemek için deneme günlüğünü kaydedin veya adı değiştirin.

9. Davranışsal görev ve EEG sinyal senkronizasyonu

1. MATLAB'ı açın ve şu komutu yürütün: convert_plx2mat. Bu işlev bir tarayıcı kutusu açacaktır. Dönüştürme işlevleri üretici tarafından sağlanır ve MATLAB'ın yoluna eklenmelidir.
2. Dönüştürmek için *.plx'i seçin ve varsayılan parametrelere dönüştürmek için MATLAB'ın komut satırındaki "Enter" tuşuna basın.
3. BTS deneme dosyasını açın ve "Protokol"e gidin. "Sonuçlar, raporlar ve veriler" seçeneğine tıklayın, her iki nesnenin tüm olaylarını seçin ve "Raporun saat biçimini seçin" e tıklayın, üçüncü seçeneği seçin: "Olay zamanlarını HS: MM: SS.sss'de gerçek zamanlı olarak göster - örneğin 13:20:14.791."
4. Şimdi "Dosya" ya gidin ve "Dışa Aktar" ve "Denemeyi XML Olarak Dışa Aktar" ı tıklayın, "Testin tarihi ve saatini" işaretleyin, son olarak "XML Oluştur" u tıklayın.
5. "Test verilerini dışa aktar" a gidin ve "Verileri Kaydet" e tıklayın. Olay saatlerini içeren bir .csv dosyası oluşturulur.
6. Her dosya için 9.1 ile 9.5 arasındaki adımları yineleyin. Bizim durumumuzda, üç deney şunlardı: ACQ, STM ve LTM.
7. EEG ve davranış dosyaları dönüştürüldükten sonra, bunları tek bir klasörde toplayın. Klasörde sırasıyla altı dosya, üç .mat dosyası ve üç .csv bulunmalıdır. Bizim durumumuzda dosyalar çağrıldı: PID_01_ACQ_N.mat, PID_02_STM_N.mat, PID_03_LTM_N.mat, PID_01_ACQ_M.csv, PID_02_STM_M.csv ve PID_03_LTM_M.csv. Kimlik, bir hayvanın kimlik numarasını ifade eder.
8. MATLAB kullanarak "procesa_sujeto.m" işlevini açın ve ikinci satırı hayvanın kimliğine ayarlayın.
9. Şimdi MATLAB'ı bu klasöre taşıyın ve ACQ, STM ve LTM aşamalarında nesne tanıma ile ilişkili güce alfa ve beta göreli bant figürleri oluşturmak için "procesa_sujeto" komutunu çalıştırın.
   NOT: "procesa_sujeto", birkaç sinyal işleme analizini yürüten/çalıştıran bir işlevdir. Bu analizler 9.10 ila 9.15 arasındaki adımlarda aşağıdaki gibi özetlenmiştir.
10. Her EEG sinyalini, faz düzeltmeyi kullanarak [5-40] Hz'de 4. dereceden bir Butterworth bandpass filtresi ile filtreleyin.
11. Aşağıdaki analizden önce Sinyalleri görsel olarak inceleyin ve kusurlu elektrotların yerleştirilmesinden veya hayvan hareketleriyle yanlış ayarlanmasından türetilen artefaktlara sahip kanallar daha fazla analizden çıkarıldı.
12. Hareket artefaktlarını hafifletmek için sinyalleri ortak ortalamaya referans verin.
13. BTS'den türetilen zaman damgalarıyla senkronize edilen 4 s uzunluğunda dönemler oluşturmak için EEG sinyallerini segmentlere ayırın. Hedef olaylar, hayvanın nesne sınırına olan uzaklığı ile işaretlenmiş nesnenin araştırılmasıydı. Bu olaylar BTS zaman damgalarında işaretlenir ve tanımlayıcılar pencerelerin konumlarını düzeltirken kullanılır. Bu nedenle, EEG dönemleri, keşif başlamadan önce 1 s ile 3 s sonra sınırlandırılmıştır. Bu noktada, keşif uzunluğu hakkında herhangi bir doğrulama kullanılmamıştır, ancak gelecekteki araştırmalar için dikkate alınacaktır.
14. Welch'in periodogram yöntemini kullanarak bu çağlardaki spektral güç yoğunluğunu 1 s pencere uzunluğunu,% 90'lık bir örtüşmeyi, Fourier dönüşüm tahmininden önce Hanning penceresini kullanarak tahmin edin, bu parametrelerle 1 Hz'lik bir çözünürlük elde edildi.
15. Periodogram altındaki alanı değerlendirerek her banttaki güç spektralini değerlendirin ve sunulan değerler göreceli enerjiye karşılık gelir, bu da her EEG bandının enerjisinin çağın toplam enerjisine bölündüğü anlamına gelir. Bu prosedür aynı zamanda EEG sinyalleri üzerindeki artefaktlardan kaynaklanan hatalı tahminleri de azaltır.

Yukarıda açıklanan yöntemler, çevresel zenginleştirme işleminden sonra EEG ve sıçan aktivitesini aynı anda kaydetmek için uygulanmıştır. Üç aylık erkek Wistar sıçanları, 20 gün boyunca orta vadeli bir çevresel zenginleştirme tedavi protokolü altındaydı ve NZ'de bulunan yedinci bir elektroda atıfta bulunulan ön, merkezi ve parietal bölgelerde eşleştirilmiş altı kafatası vida elektrodunu sabitlemek için ameliyat edildiler. Hayvanlar, doğal karanlık ışık koşulları altında, yiyecek ve suya ad libitum erişimi ile korundu. Bu çalışma, eşzamanlı canlı kayıt için EEG sistemi ve davranışsal izleme yazılımı arasındaki entegrasyonu göstermektedir. Sadece EE protokolü altında tedavi edilen hayvanları kullandık, çünkü tedavinin etkinliğini karşılaştırıyormuş gibi davranmıyoruz, sadece ekipmanın avantajlarını örnekliyoruz. Kullanılan 20 günlük çevresel zenginleştirme konut protokolünün yetişkin nörogenezini uyardığının kanıtı olarak, EE altındaki hayvanlardan BrdU pozitif hücre sayımı verilerini ve standart koşullar altında barındırılan hayvanları laboratuvarımızdan yayınlanmamış verilerden sunuyoruz. Üç aylık erkek Wistar sıçanları kullanıldı. Aralarında 12 saat olacak şekilde BrdU ile üç kez enjekte edildiler. Hayvanlar anestezi uygulandı (pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) ve transkardiyal perfüzyon ile ötenazi yapıldı (bkz. Şekil 5). EEG cihazına takılan yeleğin hayvan hareketlerini sınırlamadığından emin olmak için açık alan testini (OFT) iki gruba ayırdık, bir grup ekipmanı giyerken ameliyat oldu (yelek ve EEG amplifikatörü) ve diğer grup hayvanlar donanımı giymeden bozulmadan sağlam kaldı. 10 dakikalık testte hayvanlar tarafından kat edilen mesafede anlamlı farklılıklar bulamadık (bkz. Şekil 5). Tipik NORT protokolü, iki nesnenin sunumundan ve bunlardan birinin yeni bir nesneyle değiştirilmesinden oluşur. Davranışsal izleme yazılımı keşif süresini izledi.

Davranışsal İzleme Yazılımı, temel performans parametrelerini değerlendirmek için bir grup hayvanı kaydetti. Bu nedenle, keşif performansını değerlendirmek için üç parametre kullandık. Tercih oranı, hayvanların kafasının her bir nesnede harcadığı toplam süreyi bildiren nesne bölgesinde geçirilen hayvanların kafa süresi kullanılarak hesaplanmıştır. Ayrıca, nesnelere doğru hareket etmek için harcanan zaman için bir tercih oranı hesapladık, bu da her nesne bölgesine doğru hareket eden her hayvana harcanan toplam süreyi gösterir. Ek olarak, her nesneye ziyaret başına harcanan süre hesaplandı. Şekil 6 , yukarıda belirtilen üç parametreli sonuçları göstermektedir. Edinme denemesinde, değerlendirilen üç parametredeki nesneler arasında hiçbir ayrım yoktu: üç deneme için nesne bölgesinde kafa zamanı, üç deneme için nesnelere doğru hareket eden zaman ve her nesnede ziyaret başına süre. STM denemesinde hiçbir farklılık yoktu. Bu arada, LTM denemesinde, yeni nesne için önemli ölçüde daha yüksek bir keşif tercihli oranı görülmüştür. Ek olarak, LTM denemesinde, ziyaret başına harcanan sürede (panel C) yeni nesne için bir tercih de görülebilir. Video 1 , deneyde kaydedilen bir sıçanın temsili bir örneğini gösterirken, Video 2 , eşzamanlı EEG ve davranışsal kaydın temsili bir örneğini göstermektedir.

İzlenen zaman olaylarını, bilgisayarın saatini kullanarak Davranışsal İzleme ve EEG yazılımı kaydı ile eşleştirmek mümkündü. Şekil 7 ve Şekil 8 , alfa ve beta bantları üzerindeki EEG göreceli gücündeki değişiklikleri göstermektedir. Bunlar motor kontrol, konsantrasyon ve hafıza ile ilgilidir, bu da keşfin sadece bu işlevlerle ilgili olduğunu düşündürmektedir. Hayvan 3'ün sonuçları, alfa gücünün ACQ ve LTM ile ilgili STM'de azalma eğiliminde olduğunu ve keşif veya bellek alımı ile ilgili bir senkronizasyon bozukluğu olduğunu göstermektedir. Nesne tanıma sayısı (işlenmiş çağlar) düşüktü. Bu noktada, istatistiksel bir testin böyle bir farkın gerçek olup olmadığını veya bir eserin böyle deneysel koşullar üretip üretemediğini doğrulayacağını belirlemek mümkün değildir. Bununla birlikte, çağların segmentasyonu, etiketlemesi ve analizi, hayvanlarda eşzamanlı işaretleme olaylarının ve gelecekteki araştırma projeleri için üretilen EEG sonuçlarının zaman çizelgesi ile mümkün hale gelmiştir. Bu sistemlerin birleştirilmesi, hayvan deneyleri amacıyla önemli bir sorun haline gelen manuel işaretleme işlemi ile olayların yanlış tanımlanmasını önler. BTS ve elektrofizyolojik (EP) aktivitenin kombinasyonu hayvan davranışı ile doğru bir şekilde ilişkilendirilebilir; Bununla birlikte, deneysel koşullar, hareket artefaktlarını ortadan kaldırmak ve deney kurulumunda etkili bir şekilde iyileştirmeler yapmak için gelişmiş sinyal işleme tekniklerinin kullanılmasını gerektirir.

Şekil 1: Zenginleştirilmiş çevre (EE) koşulları kafesi örnekleri. Barınağa, hayvanların yeni ve karmaşık buldukları, ancak biyolojik olarak hiçbir ilgisi olmayan oyuncaklar ve tüpler sağlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Epidural elektrotların sıçan kafatasındaki konumları. Vidalar aynı anda kulaklık için ankraj ve elektrot olarak kullanıldı. F = ön; C = frontoparietal; P = parietal; 3 = sol; 4 = doğru; NZ = zemin referansı olarak. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bir epidural (kafatası vidası) elektrot implantasyon ameliyatının temsili görüntüleri. İmplante edilmiş kafa içi elektrotları, ameliyatın farklı aşamalarında sıçanlarda vidaları gösteren görüntü. Bu prosedürü uygularken aseptik tekniklerin takip edildiğinden emin olun. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Deney düzeneği ile birlikte bir sıçanın temsili görüntüleri. Sıçan, EEG cihazına bağlı yeleği, NORT protokolü için kullanılan arenanın içinde, gömülü bir batarya ile giymek için yapıldı. Resimde kulaklık seti ve kafanın sıçanına takılı kablo konektörü gösterilmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: EE protokolü ile hareket kabiliyeti kanıtı ve yetişkin nörogenez stimülasyonu. (A) Açık Alan Testinde (OFT) 10 dakika boyunca hayvan aktivitesinin temsili görüntüleri ve ekipmanı/ameliyatı giyen hayvanların kat ettiği ortalama mesafe ve ekipmanı olmayan/ameliyat olmayan hayvanlar. (B-E) EE ve standart gövde grupları için BrdU etiketli hücrelere (yoğun karanlık) sahip temsili DG bölümü. B ve D panelleri DG'nin düşük bir büyütme oranını gösterir ve C ve E panelleri kutu alanını daha yüksek büyütmede gösterir. B ve C panelleri EE gövde grubundan, D ve E panelleri standart gövde grubundan dokulardır. İç kısım, her iki gruptaki etiketli hücrelerin ortalama sayısını gösterir. ML - moleküler tabaka; GCL – granüler hücre katmanı; SGZ – tanecik altı bölge; oklar - BrdU+ hücreleri. Grafikler SEM'± ortalamasını göstermektedir. Grupları karşılaştırmak için T-student testi kullanıldı. * s≤0.05. Açık Alan Testinde gruplar arasında anlamlı fark bulunmamıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: NORT değerlendirmesinde keşif performansı. (A) Üç deneme için nesne bölgesinde baş zaman. (B) Üç deneme için nesnelere doğru ilerleyen zaman. (C) Her nesnede ziyaret başına süre. Grafikler SEM'± ortalamasını göstermektedir. Tüm parametrelerde Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi ile iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA kullanılmıştır. * p≤0.05, ** p≤0.01 ilgili denemedeki nesneler arasında. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Keşif ile ilişkili alfa EEG bant gücü üzerindeki değişiklikler. Bu şekil, hayvan nesnelerin keşfine başladıktan sonra yarım saniyeden 2,5 saniyeye kadar göreceli alfa gücündeki değişiklikleri göstermektedir. Altı grafik Frontal, Central ve Parietal elektrotlara (yukarıdan aşağıya) ve sol ve sağ taraflara karşılık geldi. Kutu grafikleri, bir Nesnenin her koşul kombinasyonu için bu tür zaman serilerinin dağılımını gösterir: "Tanıdık" ve "Yeni" ve aşama: "ACQ", "STM" ve "LTM". Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Keşif ile ilişkili beta EEG bant gücü üzerindeki değişiklikler. Bu şekil, hayvan nesnelerin keşfine başladıktan sonra yarım saniyeden 2.5'e kadar göreceli beta gücündeki değişiklikleri göstermektedir. Altı grafik Frontal, Central ve Parietal elektrotlara (yukarıdan aşağıya) ve sol ve sağ taraflara karşılık geldi. Kutu grafikleri, bir Nesnenin her koşul kombinasyonu için bu tür zaman serilerinin dağılımını gösterir: "Tanıdık" ve "Yeni" ve aşama: "ACQ", "STM" ve "LTM". Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Deneyde kaydedilen bir sıçanı gösteren temsili video. Sıçan, NORT protokolü için kullanılan arenanın içindeydi. Sıçan, gömülü bir batarya ile EEG cihazına bağlı yeleği giyiyordu. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 2: Eşzamanlı EEG ve davranışsal kaydı gösteren temsili video. EEG sinyali sol tarafta, davranış testi (NORT) ise videonun sağ tarafında görüntülendi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Dr. Sylvia Ortega-Martinez, bu makaleye üretim ve açık erişim sağlayan ve sponsor olan bir şirket olan Stoelting Co.'nun bir çalışanı olarak çalışmaktadır.