Kritik Ekstre İskemisi Olan Anjiyoplasti Tedavisi Gören Hastalarda Lokal Dolaşımdaki Mononükleer Progenitör Hücreler Kullanılarak Amputasyonun Tahmin Edilmesi

Periferik Arteriyel Hastalık (PAD), kan akışının sınırlandırılması ile kronik ve ilerleyici bir damar tıkanıklığı ile karakterizedir¹. Küresel ölçekte, alt uzuvların PAD'i yaşlı nüfusun yaklaşık% 10'unu etkilerken, bu tür vakaların% 7'sine kadar uzuv amputasyon^2,3.

Kritik Uzuv İskemisi (CLI), PAD^1'inen ciddi sunumunun temsilini temsil eder. Hastalar genellikle tıkalı arterlere atfedilebilecek istirahat, ülser veya kangren ağrısı yaşarlar; klinik prognoz elverişsiz iken ve 1 yıl boyunca% 30 uzuv amputasyon ve mortalite riski ile işaretlenmiştir^3,4,5.

Anjiyoplasti, CLI'li hastalarda alt ektremiteye kan akışını geri getirebilen minimal invaziv bir endovasküler prosedürdür; bununla birlikte, bazı hastalar kaçınılmaz olarak anjiyoplasti tedavisinden sonra bile büyük uzuv amputasyonu gerektirecektir^1,5. Anjiyoplasti sonrası elverişsiz sonuçların erken tanımlanması, tedavi uygulama olasılığı nedeniyle oldukça değerlidir.

Geleneksel risk faktörleri, anjiyoplasti uygulanan hastalarda majör uzuv amputasyonu için sınırlı bir tahmin yeteneği sağlayabilir^6. Patofizyoloji odaklı biyobelirteçler, vasküler yaralanmaya bağlı hastalıklarda özellikle yararlı olabilecek potansiyel klinik uygulamalarla yeni yöntemleri temsil eder⁷. Günümüzde, aterosklerotik plak yerinde endotel onarım özelliklerine sahip hücresel popülasyonların katılımı giderek daha fazla tanınmaktadır^8,9.

Mononükleer Progenitör Hücreler (MPC' ler) kemik iliğinden türetilir ve damar rejeneratif yetenekleri olan kök hücrelerin kendi yapısal ve fonksiyonel özelliklerine sahiptir. MPC'nin çoğalma, göç etme ve damar yapışması gösterme yeteneği nedeniyle; bu hücreler iskemi 10 , 11^,12'ye yanıt olarak endotel onarımını yansıtmak için iyi adaylar^{haline gelmiştir.} Ek olarak, vasküler yaralanmanın altında kalan mekanizmalara sürekli ilgi, lokal meydana gelen biyobelirteçlerin prognostik rolünü keşfetmeye motive olmuştur, çünkü damar hasarını yansıttığı ve^{onarım 7},^13,14.

Bu çalışmanın amacı, anjiyoplasti uygulanan CLI'li hastalarda damar tıkanıklığına yakın dolaşımda olan MPC miktarının nasıl belirlendiğini tanımlamaktır; ve endotel disfonksiyonu ve uzuv amputasyon göstergeleri ile MPC'ler arasındaki ilişkinin nasıl değerlendirileceği.

Komorbiditelere ve içsel vasküler özelliklere dayalı prognoz ile karşılaştırıldığında, lokal MPC'lerin miktarı endotel disfonksiyonu ve uzuv amputasyonu ile ilgili klinik sonucu tahmin etme konusunda spesifik bir yetenek göstermektedir. Sürekli olarak, bazı çalışmalar PAD^15,16ile hastaların değerlendirilmesi sırasında benzer biyobelirteçlerin prognostik rolünü tanımlamaktadır.

Önceki sonuçlara dayanarak⁷, burada açıklanan yöntem, alt ektöz ve koroner iskemi, inme, vaskülit, venöz tromboz ve damar yaralanması ve onarımı içeren diğerleri gibi çeşitli klinik ortamlarda olumsuz vasküler sonuçlar riski altındaki popülasyonun erken tanımlanması için yararlı olabilir.

Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE'den kurumsal araştırma etik komitesi bu olası protokolü onayladı, tüm kayıtlı hastalar yazılı bilgilendirilmiş onay verdi.

1. Alt ektremite vasküler bloğun değerlendirilmesi, kan örneklemesi ve balon anjiyoplasti

NOT: Bu deney için kullanılan çalışma örneği, 68 yaşında ve 20 hastadan 10'unun erkek olduğu 20 diyabet hastasından oluşmaktadır. Örneğin yarısı sigara içenlerdi ve en yaygın ko-morbiditeler tip 2 diabetes mellitus, sistemik arteriyel hipertansiyon ve/veya dislipidemiydi. Örneklem yaş, cinsiyet ve yandaş hastalık için standart hale getirilmiştir. MPC'ler ve CLI arasındaki ilişki üzerindeki klinik-demografik etki nedeniyle olası önyargı göz ardı edilemedi.

1. Uzuv iskemisinin klinik şiddetini Rutherford^{sınıflandırması 13'e} göre değerlendirin (bkz. Ek Tablo 1).
2. Alt ektremite anjiyografisi, kan örneklemesi ve balon anjiyoplasti gerçekleştirin.
   1. Ameliyattan önce antikoagülan ve anestezik ilaçlar kullanın.
   2. Seçilen kasık yerindeki kan damarına 18 G'lik bir iğne yerleştirin.
   3. Bir indeksleyici yerleştirin ve esnek bir kılavuz tel ilerletin. Ardından, ilk kılavuz bir 6 Fr indirici için daha da değiştirilir.
   4. Arter yörüngesini ve damar tıkalı bölgeleri tanımlamak için floroskopik kılavuz altında kontrast ortam veya CO_2'nin periyodik enjeksiyonunu kullanın (Şekil 1).
      NOT: Kontrast medya 40 cc, %0,9 tuzlu suda 1:1 seyreltilmiş veya₁₂ psi basınçta atış başına 10 ila 20 mL'de CO 2 kullanın.
   5. Gemiye iki adet 0.014 Fr navigasyon kılavuz teli ve iki adet 0.014 Fr destek kılavuz teli tanıtın ve bunları engellenen bölgeye kadar ilerletin.
      NOT: Navigasyon için iki adet 0.014 Fr kılavuz tel (260 cm uzunluğunda) ve tek bir işlem sırasında destek için iki adet 0.014 Fr kılavuz tel (260 cm uzunluğunda) kullanılır.
   6. 5 Fr ve 3 Fr kateterleri sırayla tanıtın ve damar tıkanıklığına en yakın yerden 10 mL kan toplayın. Kan örneklerini buzda tut.
      NOT: Kateter boyutları 5 Fr ve 3 Fr olabilir ve işlem sırasında değiştirilir.
   7. Kılavuz teli tekrar ilerletin. Ardından, kateterin ucunda bulunan şişme bir balon içeren anjiyoplasti balon kateterini tanıtın. Anjiyoplasti balon kateterini ilerletin ve balonu lezyon bölgesine yerleştirin. Balonu damar duvarında bulunan blokaj plağı ile şişirerek anjiyoplastiyi gerçekleştirin. Kan akışı restorasyonu doğrulayın.
      NOT: İşlemden sonra atardamarın açık kalmasına yardımcı olmak için tıkalı bölgeye stent yerlenebilir.
   8. Bir kateter tanıtın ve damar bloğuna en yakın bölgeye ilerleyin. Anjiyoplastiden sonra 30 dakika zaman aralığında 10 mL kan toplayın. Kan örneklerini buzda tut.
      NOT: Anjiyoplasti öncesi ve sonrası kan örneklerinin toplanması, anjiyoplasti'nin MPC sayısı üzerindeki etkisini daha fazla değerlendirmek için önerilir.
   9. Floroskopik rehberlik altında tüm telleri çıkarın.
   10. Her 12 saatte bir 1 mg/kg deri altı, aspirin 100 mg, statin ve analjezi kullanarak anti-koagülasyon tedavisi de dahil olmak üzere ameliyat sonrası bakım prosedürleri sağlayın. 24 saat boyunca vasküler delinme yerinde sıkıştırın.

2. Dolaşımdaki mononükleer progenitör hücrelerin (MPC' ler) nicelleştirilmesi (Şekil 2)

1. Taze bir 15 mL konik tüpe, toplanan kanın 6 mL'lik kısmını aktarın ve PBS ile 1:1 (v/v) seyreltin.
   NOT: Kanı toplama işleminden itibaren 1 saat içinde işleyin.
2. Her biri 3 test tüpüne 2 mL yoğunluk degrade ortası ekleyerek yoğunluk degrade ayrımına hazırlanın. Ardından, her test tüpüne seyreltilmiş kanın 3 eşit hacimli aliquots ekleyin.
   NOT: Test tüpü maksimum kapasitesinin dörtte üçünü aşmayın.
3. 4 °C'de 30 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüj. Pipet kullanarak halka olarak mevcut arayüz katmanını toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. 2 mL PBS ekleyin ve 4 °C'de 6 dakika boyunca 1.800 x g'da döndürün. Bu MPC'ler içereceği için peleni kaydedin.
4. MPC'ler içeren peleti, 2.3. Her yıkama için taze PBS kullanın ve 4 °C'de 2 dakika boyunca 1.800 x g'da döndürün. İşlemi 6 kez tekrarlayın.
5. Son yıkamadan sonra, hücre peletini yeniden kullanmak için 1 mL PBS kullanın. Hücre süspansiyonunun 20 μL'sini % 0,4 trippan mavisi, 1:1 (v/v) 20 μL ile seyreltin. Hemositometre ve hafif mikroskop kullanarak hücre sayımı için bu hücre süspansiyonunun 10 μL'liğini kullanın.
6. Aliquot 1 x 10^{6 MPC'ler} daha önce etiketlenmiş 5 mL akış sitometri tüplerinde.
   NOT: karşılık gelen izotip uyumlu kontrol antikorlarını hazırlayın.
7. Tüpleri 4 °C'de 6 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüj edin. Aspirat ve üstnatant atmak.
8. Birincil antikoru 100 μL antikor inkübasyon çözeltisinde seyreltin [1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA% 0.05] ve tüpe ekleyin. 10 sn için yeniden satın ve karanlıkta 4 °C'de 20 dakika kuluçkaya yaslanın.
   NOT: Mevcut protokolde kullanılan primer antikorların son konsantrasyonları CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50 olarak belirlendi. PBS'de %4 paraformaldehitte lenfositler sabitlenerek ve numuneler 4 °C'de 24 saate kadar depolanarak protokol bu adımda durdurulabilir.
9. 4 °C'de 2 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüj ve süpernatantı atın. 500 μL 1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM'de yeniden biriktirin.
10. Akış sitometrisi analizi gerçekleştirin.
    1. Arka planı izotiple eşleşen kontrol antikorlarıyla ayarlayın. Daha sonra, FSC / SSC arsasında, hücresel kalıntıları, artık granülositleri ve diğer parçacıkları dışlamaya çalışan lenfositleri seçin. Bu tür bir dağılım% 100 olarak kabul edilir.
       NOT: Lenfositler genellikle arsanın sol alt bölgesinde yayılır.
    2. Yüksek sayıda CD45 + ve^CD34+ içeren ortak immünofenotip içeren bir kapı kullanın. Ardından, daha önce CD45 + , CD34⁺'yı tanımlayan kapıyı kullanarak ve KDR (VEGFR-2)⁺, CD133 + veya CD184⁺ ekleyerek çift pozitif immünofenotipler için seçin. MPC alt nüfuslarını belirli hücre yüzeyi işaretçilerine göre tanımlayın. Geçişli olayların yüzdesi olarak raporla.
11. MPC'lerin ana alt nüfuslarını tanımlayın. Bu çalışmada analiz edilen immünofenotipler CD45⁺CD34⁺CD133⁺; CD45⁺CD34⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺ ve CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184^7,17.
    NOT: Çalışma için bu hücre yüzey belirteçleri kullanılmıştır: CD45 (lenfositler), CD34 (endotel ve/veya vasküler hücreler), KDR (VEGFR-2) (endotel hücrelerinin zar belirteci), CD133 (endotel progenitör hücreler) ve CD184 (hematopoetik kök hücreler ve endotel hücreleri).

3. MPC'lerin endotel fonksiyonunun ve hemodinamik testin (FMD) değiştirilmesiyle ilişkisi

1. Akış aracılı genişlemeyi (FMD), anjiyoplasti öncesi ve sonralarını belirleyin.
   1. Brakial arterin çapını ölçmek için vasküler doğrusal dönüştürücü kullanın.
   2. Sfigmomanometrenin manşetini ön koldaki ölçüm alanının üzerine yerleştirin ve sistolik kan basıncının 5 dakika boyunca 50 mmHg üzerinde insufflate edin ve söndürün.
   3. Sonraki 60 s içinde brakial arterin çapını tekrar belirleyin. FMD'yi tahmin etmek için aşağıdaki denklemi kullanın.
      NOT: 100 / bazal çapı × denklemi (%) = (geçici iskemi sonrası maksimum çap - bazal çap) kullanarak dilatasyon derecesini hesaplayın.
2. MPC sayısını FMD'nin temel FMD değeri ve anjiyoplasti sonrası deltası ile ilişkilendirin.

4. MPC'lerin uzuv amputasyonu için prognostik yeteneği

1. Balon anjiyoplasti ve hasta taburcu olduktan sonra, alt ektriğe kan akışının kalitesini değerlendirmek için periyodik tıbbi randevular planlayın.
2. Anjiyoplastiden 2 hafta sonra uzuv iskemisinin klinik şiddetini değerlendirin. Rutherford sınıflandırmasına göre istirahat ağrısını, daha düşük iskemiyi ve fonksiyonel bir ayağın korunmasını değerlendirin¹³.
3. Uzuv iskemisinin klinik şiddetini taban çizgisine ve takibe karşı karşılaştırın. Elverişsiz sonuç nedeniyle büyük amputasyon gerektiren vakaları tanımlayın.
4. MPC sayısını alt ekstremitenin majör amputasyonu gerektiren hastaların oranı ile ilişkilendirin.

Tıkalı arterlerden alınan kan örnekleri, anjiyoplasti için ele alınan yerde, 68 yaşında ve 20 hastadan 10'unun erkek olduğu 20 diyabet hastasından alındı. Örneklem nüfusunun yarısı sigara içenlerdi. Vasküler lezyonlar esas olarak Rutherford sınıf VI olarak puanlandı; hastalar tip 2 Diabetes Mellitus (0), hipertansiyon (p) prevalansı daha yüksekti. ve dislipidemi (U).

Alt ektremite anjiyoplasti sonrası 30 günlük klinik takip yapıldı. Anjiyoplasti sonrası taban çizgisi veya dinamiklerdeki MPC alt nüfuslarının yüzdesi, FMD tarafından değerlendirildiği gibi endotel disfonksiyon derecesi ile ilişkiliydi (Spearman analizi); ve mpc'lerin temel sayısı anjiyoplasti sonrası uzuv amputasyonu geçiren veya olmayan hastalar arasında karşılaştırıldı (U-Mann Whitney). Çalışma, temel MPC'lerin alt nüfus CD45+CD34+KDR+ fmd ile negatif korelasyon gösterdiğini göstermiştir (Şekil 3A, sol), MPC'lerin değişimi CD45+CD34+CD133+CD184+ anjiyoplasti sonrası FMD gelişimi ile önemli ölçüde ilişkilidir(Şekil 3B, sağ). Ayrıca, uzuv amputasyonuna evrilen hastalarda CD45+CD34+KDR+ (Şekil 4A,B, solda) mpc alt nüfus sayısının arttığı gözlenmiştir; MPC alt nüfus CD45 + CD34 + CD133 + CD184+(Şekil 4A,C, sağ) anjiyoplasti sonrası azaltma yanı sıra.

Şekil 1: Alt ektremite anjiyografisi ve kan toplanması. (A) Floroskopi altında kontrast ortam ile kanıtlanan vasküler yörünge. (B) Anjiyoplasti öncesi damar tıkanıklığı. (C) Anjiyoplasti sonrası damar tıkanıklığı. (D) Vasküler cerrah, damar tıkanıklığı ve aterom plağında en yakın yerden kan toplamak için kateter kullanır ve Laboratuvar araştırmacısı kan örneğini almaya hazırdır. Oklar damar tıkanıklıklarının olduğunu gösteriyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kan örneği hazırlama ve mononükleer progenitör hücrelerin (MPC) belirlenmesi. (A) Yoğunluk gradyan hazırlığı. (B) Lenfositler kan santrifüjlemeden sonra halka ayrımı. (C) Lenfosit fazının toplanması. (D) Santrifüjleme. (E) Test tüpünün alt kısmında pelet oluşumu. (F) Hücre süspansiyon sayısı. (G) Lenfositlerin akış sitometrisi için hazırlanması. (H) Hücre alt nüfuslarının akış sitometrisi ile belirlenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: MPC'lerin hemodinamik göstergelerle ilişkisi. (A) FMD ve temsili sonuçlar elde etmek için ultrasonun konumu. (B) Temel %MPC alt nüfusları (sol, CD45+CD34+KDR+; sağ, CD45+CD34+CD133+CD184+) ve taban çizgisi FMD değerleri arasındaki ilişki; anjiyoplasti sonrası(C) %MPC'lerin anjiyoplasti sonrası FMD gelişimi ile ilişkisi. Kısaltmalar: MPC'ler, Mononükleer Progenitör Hücreler; FMD, Akış Aracılı Genişleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: MPC'ler ve anjiyoplasti sonrası alt ektremite amputasyon prognozu. (A) MPC alt nüfuslarının temsili akış sitometri görüntüleri. (B) Temel %MPC alt nüfuslarının ilişkisi (sol, CD45+CD34+KDR+; sağ, CD45+CD34+CD133+CD184+) veya (C) %MPC'ler anjiyoplasti sonrası, anjiyoplasti sonrası alt ekstremite amputasyonu ile 30 günlük takip sırasında. Kısaltmalar: MPC'ler, Mononükleer Progenitör Hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Rutherford'un uzuv iskemisinin şiddetinin sınıflandırılması. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.