Bu el yazması, olgunlaşmamış kedi yumurtalarının ticari destekler de laboratuvar yapımı ortamla minimum hacimli vitrifikasyonuna ilişkin bir protokolü açıklamaktadır. Oosit izolasyonundan ex vivo gonadlardan vitrifikasyon ve ısınmaya kadar her adımı kapsar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Olgunlaşmamış Kedi Yumurtalarının Minimum HacimVitrifikasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Vahşi hayvanların koruma programlarında, gamet bankacılığı değerli bireylerin ve nadir türlerin genetik kaynaklarını korumak ve biyolojik çeşitliliğin korunmasını teşvik etmek için çok önemlidir. Felids, çoğu tür yok olma tehlikesiyle karşı karşıya, ve yerli ırklar germplasm bankacılık için protokollerin verimliliğini artırmak için bir model olarak kullanılır. Oosit kriyoprezervasyon teknikleri arasında, vitrifikasyon insan ve veteriner destekli üreme daha popüler. İlk olarak insan yumurtaları ve embriyolar için geliştirilen cryotop vitrifikasyon, kedi yumurtaları için çok uygun olduğunu göstermiştir. Bu yöntem, alan koşullarındafizibilite ve yordamın hızı gibi çeşitli avantajlar sunar ve bu da birkaç numunenin işlenmesi gerektiğinde yararlı olabilir. Ancak, verimlilik güçlü operatörün becerilerine bağlıdır ve intra-ve laboratuvarlar arası standardizasyon yanı sıra personel eğitimi gereklidir. Bu protokol, yumurta koleksiyonundan ısınmaya kadar, adım adım alan dostu protokolile ticari destek te olgunlaşmamış kedi yumurtalarının minimum hacimli vitrifikasyonu dur. Protokolün ardından, yumurta bütünlüğünün ve ısınmada canlılığın korunması (%90'a kadar) ısınma sonrası olgunlaşma ve embriyonik gelişim sonuçlarında iyileşme için hala yer olmasına rağmen, beklenebilir.
Giriş
Kriyopreservation destekli üreme teknikleri (ARTs) önemli bir adım haline gelmiştir. İnsanlarda, bu tıbbi veya kişisel nedenlerle doğurganlık korunması veya ebeveynlik ertelenmesi sağlar. Hayvanlarda, özellikle çiftlik hayvanları ve evcil hayvanlarda, planlanan çiftliklerde mesafe ve zamanın üstesinden gelmek ya da özellikle nesli tükenmekte olan vahşi türler olmak üzere koruma programlarındaki değerli deneklerin genetik materyallerini korumak gereklidir. Gamet kriyoppreservation bireylerin henüz seçilmiş değil ya da amacıyla embriyo dondurma ile ilgili etik sorunları önlemek için, özellikle insan tıbbı1en iyi seçimdir. Spermatozoakorumak ve er....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu vesileyle yapılan işlemler, kedi yumurtalıkları veteriner kliniklerinde sahibinin istediği rutin ovariektomi veya ovariohysterektomiden elde edilen ürünler olarak toplandığı için etik onaya tabi tutulmadı.
1. Yumurta toplama
- Deneylere başlamadan önce, yumurtalık ve yumurta toplama için çözümler hazırlayın. Antibiyotik ve antimikotikkarışımı (100 IU/mL penisilin G sodyum, 0.1 mg/mL streptomisin sülfat, 0.25 μg/mL amphotericin B) karışımı ile fosfat tamponlu salin (PBS) ile yumurtalık toplama çözeltisi hazırlayın. 100 IU/mL penisilin G sodyum, 0.1 mg/mL streptomisin sülfat ve %0.1 (w/v) polivinil alkol (PVA) ile PBS ile oosit top....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Mevcut protokole göre kedi yumurtası vitrifikasyonve ısınmasını takiben(Şekil 1 ve Ek Şekil 1),gametlerin büyük çoğunluğu hayatta kalır. Vitrifikasyon sonrası, diğer tekniklerin yanı sıra, canlılık optik mikroskopta morfolojik bütünlük22 veya hayati lekelerin kullanımı ile değerlendirilebilir. İkincisi floresan diasetat / propidium iyodür (FDA / PI), hangi canlı (parlak yeşil floresan) ve ölü hücrelerin (kırmızı floresan) belirlenmesini sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Oosit kriyoprezervasyon felidae ailesi gibi birçok türün nesli tükenmekte olan taksonlarda özellikle önemli bir germplazm koruma tekniğidir. Bu yazıda, olgunlaşmamış kedi yumurtalarının vitrifikasyonu için basit ve alan dostu bir protokol sunulmuştur. Laboratuvar yapımı ortam, minimum hacim vitrifikasyon destekleri ve eğitimli personel, bu yöntemin başarısı için önemli faktörlerdir, bu da temsili sonuçlarda gösterildiği gibi sürekli ve sürekli olarak canlı yumurtaların elde edilmesine olanak sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen EVSSAR (Avrupa Küçük Hayvan Üreme Derneği) Grant 2016 ve Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Dr. MariaGiorgia Morselli'ye burada betimlenen deneylere ve görüntü edinimine olan katkıları için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Amfoterisin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Otomatik pipetler ve uçlar | / | / | 20, 100, 240 ve 300 ve mikro pipetlemek için gerekli; L |
| Cerrahi neşterler | / | / | Boyut 10 genellikle tamam |
| Bunsen gagası | / | / | / |
| Kelepçeler | / | / | Yumurtalık izolasyonu için bazı küçük (Sivrisinek kelepçesi), sıvı nitrojen Cryotop Kitazato'da çalışmak için daha büyük (Klemmer kelepçesi |
| ) (distribütör: MBT - Tıbbi Biyolojik Teknolojiler) | 01.CR | Distribütörler ve katalog numarası farklı ülkelerde değişebilir | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Etilen glikol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Cam Pasteur pipetleri | / | / | Tavsiye edilen uzunluk 230 mm (100 + 130) |
| Gobeletler | / | / | Depolama tankının bidonları göre |
| Isıtma aşaması | / | / | Tüm ısıtma aşamaları, 38º'yi tutabildikleri sürece tamam; C |
| Sıvı azot | / | / | / |
| Orta 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penisilin G sodyum | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polivinil alkol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plakası | Kitazato (distribütör: MBT - Tıbbi Biyolojik Teknolojiler) | 01.K-2 | Distribütörler ve katalog numarası farklı ülkelerde değişebilir |
| Stereomikroskop | / | /Operatör | oositleri seçebildiği sürece diğer stereomikroskoplar uygundur |
| Depolama tankı | / | / | Düzenli olarak doldurulan herhangi bir tank tamam |
| Streptomisin sülfat | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Strafor/nitrojene dayanıklı kutu | / | /Operatör | rahat ettiği sürece sıvı nitrojen içerebilen tüm kutular uygundur. Kitazato kutusu "Soğutma Rafı" olarak |
| adlandırılırSucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Zamanlayıcılar | / | / | 9 dakikaya kadar sürelere ayarlanabilen tüm zamanlayıcılar tamam |
Kaynaklar
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
