Entegre Canlı Hücre İzleme ile İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kortikal ve Dopaminerjik Nöronların Otomatik Üretimi

Summary

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kültürlerinin otomasyonu ve otomatik görüntüleme ve analiz ile uyumlu nöronal farklılasyonlar gösteriyoruz.

Abstract

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC) manuel kültür ve farklılaşma protokolleri standartlaştırmak, yüksek değişkenlik göstermek ve istenmeyen hücre tiplerine spontan farklılaşmayatkındır. Yöntemler emek yoğundur ve büyük ölçekli deneylere kolayca uygun değildir. Bu sınırlamaları aşmak için, yüksek iş letimatif görüntüleme sistemiyle birleşen otomatik bir hücre kültür sistemi geliştirdik ve paralel ve nöronal farklılaşmada birden fazla hiPSC hattını korumak için protokoller uyguladık. 6\u20128 gün içinde hiPSC kaynaklı kortikal nöronlar üretmek için Neurogenin-2 (NGN2) aşırı ekspresyonu kullanarak kısa süreli bir farklılaşma protokolünün otomasyonunu ve 65 gün içinde hiPSC kaynaklı orta beyin dopaminerjik (mDA) nöronları üretmek için uzun vadeli bir ayırım protokolünün uygulanmasını tanımladık. Ayrıca, GFP lentivirus ile transekküçük bir molekül türevi nöral öncül hücrelere (smNPC) NGN2 yaklaşımını uyguladık ve canlı hücre otomatik neurite outgrowth testi oluşturduk. Rutin hiPSC kültürüne ve kortikal ve dopaminerjik nöronlara farklılaşmaya uygun protokollere sahip otomatik bir sistem salıyoruz. Platformumuz, yeni hastalık mekanizmalarını ve ilaç hedeflerini belirlemek için uzun vadeli eller serbest kültür ve yüksek içerikli/yüksek içerikli hiPSC tabanlı bileşik, RNAi ve CRISPR/Cas9 gösterimleri için uygundur.

Introduction

İnsan indüklenen pluripotent kök hücreler (hiPSC) kendi kendini yenileyen ve hemen hemen her yetişkin hücre tipinde ayırt edebilirsiniz. Bu özellikler hiPSC temel araştırma ve ilaç keşif¹hastalık modelleme için yararlı bir araç olun. İnsan iPSC en çok etkilenen / hastalık ders dahil hastalık ile ilgili hücre tipleri türetilmesi sağlayan donör genetik arka plan korur, örneğin, nörodejeneratif hastalıklar için farklı nöronal alt tipleri^2,3. Ayrıca, hiPSC bir insan bağlamında ve fizyolojik protein ekspresyonu düzeyleri hastalıkları modelleyerek hayvan ve hücresel aşırı ekspresyon modellerinin bazı sınırlamalar üstesinden gelir ve monojenik arasında değişen hastalıkların modelleme değerli bir varlık olduğu kanıtlanmıştır, karmaşık ve epigenetik bozukluklar yanı sıra geç başlangıçlı hastalıklar⁴.

Bu avantajlara ve fırsatlara rağmen, hiPSC'nin çeşitli sınırlamalarının hala ele alınması gerekmektedir. Mevcut hiPSC kültürü ve farklılaşma protokolleri uygun maliyetli değildir, standartlaştırılması zordur ve emek yoğundur. Manuel kültür adımları, büyüme deki farklılıklar ve hiPSC'nin spontan farklılaşması nedeniyle verimve fenotiplerde yüksek değişkenliğe neden olabilir. Bu nedenle, daha standart işleme teknikleri uygulanarak ve otomasyon⁵kullanılarak elde edilebilen protokolleri basitleştirerek deneyciye bağımlı varyasyonun azaltılması gerekmektedir. Otomatik hiPSC kültürünün ve farklılaşma protokollerinin oluşturulması hem akademik hem de endüstriyel araştırma projeleri için ortak standartlar belirleyecek ve biyolojik olarak ilgili hastalık modellerinin ve daha tekrarlanabilir sonuçların oluşturulmasına olanak sağlayacaktır.

Önceki çalışma hiPSC kültürlerin otomasyon çalıştı^6,7,8 ama protokolleri sisteme bağlı belirli hücre kültürü plaka biçimleri ile sınırlı ve farklı test biçimlerine adaptasyon yoksun. Bu tür sistemler hücrelerin şişirilmesinde yararlıdır, ancak istenilen hücre tipleri, hastalık fenotipleme ve tarama amaçlarına otomatik farklılaşma için uygun olmayabilir. Ayrıca, fibroblast türevi, hiPSC üretimi ve farklılaşması için büyük ölçekli bir otomatik platform⁹ tarif edilmiştir ama sadece çekici görünüyor ama birçok akademik laboratuvarlar için karşılanamaz olabilir hatların üretimine adanmış yüksek iş gücü laboratuvarları tarafından elde edilebilir bir ölçekte.

Yüksek Verimli Partikül Hava (HEPA) filtreli bir ortamda, büyük kapasiteli CO₂ kuluçka makinesi, parlak alan görüntüleme sitometresi ve plaka taşıma için robotik bir kol ile birlikte sıvı taşıma istasyonuna dayalı tam otomatik bir hücre kültür sistemi geliştirdik. Bu bileşenler kararlı ve tekrarlanabilir hiPSC kültürü ve farklılaşması için temel sağlar. Sistemi bileşik veya virüs depolama için otomatik -20 °C depolama sistemi ve yüksek hızlı dönen disk konfokal canlı hücre görüntüleyicisi ile tamamladık. Özel yapım protokoller otomatik hücre tohumlama, medya değişiklikleri, birleştirme kontrolleri, hücre genişletme ve numune tedavisi ve plaka görüntüleme ile test plakası üretimi, sistem yüksek içerik / yüksek iş letimatları ile uyumlu hale izin oluşturuldu. Otomatik hücre kültürü ve görüntüleme sistemi, kontrol yazılımı ve özel yapım grafik kullanıcı arabirimi (GUI) kullanılarak işletilmektedir. GUI, kullanıcıların yöntem yürütülmesi için gereken hücre satırına özgü parametreleri içeren CSV dosyalarını almalarına olanak tanır. Ayrıca GUI, yerleşik takvim görünümünü kullanarak herhangi bir dizide çok sayıda deneme zamanlamasını sağlayarak her yöntemin başladığı zaman tam denetimini sağlar.

Otomatik hücre kültür sistemimiz, çeşitli plaka formatlarında (96-, 48-, 24-, 12-, 6- veya 1-well plaka formatında) kültür hücrelerine esneklik ile standartlaştırılmış pipetleme hızları, geçiş süreleri, birleştirme eşikleri, tohumlama yoğunlukları ve orta hacimler kullanır. Biz 6 gün içinde TUBB3 pozitif nöronlar verebilir nöronlar içine hiPSC dönüştürmek için yeni yayınlanan kısa vadeli farklılaşma protokolü uyarlanmış^10,11. Ayrıca, ef1a promotörü¹² ve iPSC altında GFP'yi orta beyinli dopaminerjik (mDA) nöronlara dönüştüren ve 65 gün içinde mDA nöronlarını veren daha önce yayınlanmış çift SMAD inhibisyonu protokol^13'ü uyarlayan nöronlara (smNPC) otomatik farklılaşma ve görüntüleme yi kurduk.

Protocol

1. Hücre kültürlerini otomatikleştirmek ve görüntüleme için temel prosedürler

1. Yeni kültür plakaları ve ipuçları yükleyin
   1. GUI'yi açın ve Kaynak/Enstrüman işlem görünümü düğmesine tıklayın. Herhangi bir kaynak/enstrüman işlemini çalıştırmak için kaynak/enstrüman işlemini seçin ve Çalıştır Enstrümanı işlem düğmesini tıklatın.
   2. Kaynak işlemini RunHepaHood ve Yeniden Yükleme çalıştırın (bkz. adım 1.1.1). Kapıyı açın, hücre kültür plakalarını ve tek kullanımlık ipuçlarını kontrol eden bilgisayardaki açılır görüntüde belirtildiği gibi ilgili konuma yükleyin.
   3. Dekontaminasyon için kapıyı %70 etanolile silin ve kapatın. Gösterge probu DEkontaminasyonunu GUI'den çalıştırın (bkz. adım 1.1.1). Sistem 30 dakika uv radyasyonu ile sterilize olur.
2. Kültür ortamını ve/veya dissociation reaktifini yeniden doldurun
   1. Enstrüman adımını RunHepahood'u uygulayın (bkz. adım 1.1.1). Sıvı taşıma istasyonunun ön kapısını açın. %70 etanol içeren rezervuarları (ortam, PBS ve/veya dissosilasyon reaktifi içeren) dekontamine edin ve güverteye atanan pozitona yerleştirin (cfg.csv dosyasında tanımlandığı şekilde). Rezervuarların kapağını kapatın.
   2. Kapıyı %70 etanolle dezenfekte edin ve kapatın. GUI'den kaynak/enstrüman işlemini "InitHepaHood" çalıştırarak HEPA kaputunu güçle.
3. GUI'de yeni bir "Hücre hattı" oluşturma ve proje oluşturma
   1. Config (*.cfg.csv), alma (*.imp.csv), kaynak (*.rsv.csv) ve iş akışı (*.wfl.csv) dosyalarından oluşan kullanıcı tanımlı "Hücre satırı" dosyalarını oluşturun/değiştirin.
   2. GUI'yi açın ve "Hücre satırı düzenleyicisi" görünümünde hücre satırı ekle düğmesini tıklatarak yeni bir "Hücre satırı" oluşturun. Config dosyasının seçilmesi gereken bir sihirbaz açılır ve kısa açıklamalı bir proje adının girilmesi gerekir.
   3. Yeşil ok ucunu kullanarak bu sihirbazda gezinin ve yeşil onay işaretini tıklatarak ayarları onaylayın. Proje Ekle düğmesini tıklatarak oluşturulan "Hücre satırı" için yeni bir proje oluşturun.
   4. Bir proje adı ve açıklaması girin ve GUI'nin takvim görünümünde görünür olacak bir proje rengi tanımlayın. Ok ucuna tıklayarak sihirbazın bir sonraki sayfasına gidin.
   5. Toplu iş ekle düğmesine tıklayarak ve açılan pencerede kısa bir ad ve açıklama vererek yeni bir toplu iş oluşturun. Tüm işlem adımlarını seçin ve her işlem adımı için başlangıç saatini zamanlayın. Tamam'atıklayarak pencereyi kapatın.
4. GUI kullanarak otomatik bir yöntem yürütme
   1. GUI'nin takvim görünümüne gidin ve Ekle işlemi adımı düğmesini tıklatın.
   2. Hücre satırını seçin ve sihirbazın bir sonraki sayfasına geçtikten sonra projeyi seçin. Kullanılacak toplu işlemi işaretleyin ve sağa işaret eden ok ucuna tıklayın. Kullanılan yönteme bağlı olarak, toplu işlemler in boş (yeni plakalar almak için) veya kültür plakaları veya deneme plakaları (diğer tüm işlemler) içermelidir.
   3. Sihirbazın bir sonraki sayfasına gidin ve yürütülecek işlem adımını seçin. Bu sihirbazın son sayfasına gidin ve denemeyi zamanlayın. "Parametre Ayrıntıları" bölümünde metodun çalıştırılması için gereken değişkenler değiştirilebilir. Tamam'ıtıklatarak onayla.
5. CO₂ kuluçka makinesine kültür ve deneme plakalarının yüklenmesi
   NOT: 1-kuyu plakaları genellikle toplu hücreler için kullanıldığından kültür plakaları olarak tanımlanır. Tüm çok kuyulu plakalar, adak plakaları olarak tanımlanır.
   1. Adım 1.1.1'de açıklandığı gibi GUI'den "RunHepaHood" enstrüman işlemini gerçekleştirin. ve robot kolunun önündeki kapıyı açın.
   2. Plakalar otomatik görüntüleme için yüklenirse, %70 etanol ve tüy bırakmayan bir doku ile hesap plakalarının alt kısmını silin. Kültürü veya deneme plakalarını sol rafa yerleştirin. Plakanın yönünün doğru olduğundan emin olun. Araştırma plakaları için, kültür plakalarının kenarları sağa işaret ederken, iyi A1 robot koluna doğru işaret etmek zorundadır.
   3. Dekontaminasyon için kapıyı %70 etanolile silin ve kapatın.
   4. Adım 1.4'te açıklandığı gibi, 1 kuyulu plakaların ithalatı için "Kültür Plakalarının Yüklenmesi" veya çok kuyulu plakaların ithalatı için "Asa Plakalarının Yüklenmesi" yöntemini uygulayın. Her iki yöntemi çalıştırmak için boş bir toplu iş kullanın. Bu toplu iş partisinde plaka barkodları zaten mevcutsa, onay kutularına tıklayarak bunları seçin.
   5. Robot kolu kullanarak raftan CO₂ kuluçka platformuna tek tek plakalar taşıyın. Dahili plaka servis istasyonu plakayı alır ve co₂ kuluçka raflarından birinde saklar. Hücreler 37 °C ve %5 CO_2'detutulur.
6. CO₂ kuluçka makinesinden plakaların boşaltılması
   1. "Plakaları boşalt" yöntemini uygulayın (bkz. adım 1.4). Dışa aktarılması gereken plakaları içeren toplu işlemi seçin. Tek tek plakalar barkodları ile seçilebilir.
   2. Plakaları CO₂ kuluçka makinesinden robot kolu kullanarak sol rafa taşıyın.
   3. Adım 1.1.1'de açıklandığı gibi "RunHepaHood" enstrüman işlemini kullanarak HEPA kaputunu başlatın. ve robot kolunun önündeki kapıyı açın. Plakaları çıkarın, kapatmadan önce kapıyı %70 etanolle dezenfekte edin ve HEPA kaputuna güç koyun.

2. Otomasyon protokolleri

1. Tüplerden tabak ların tohumlanması
   1. Enstrüman işlemi RunHepaHood'u çalıştırarak HEPA kapağını başlatın (bkz. adım 1.1.1). Sıvı taşıma istasyonunun önündeki kapıyı açın. Hücre süspansiyonu içeren 50 mL'lik tüpü giriş ve tüpün kapağını kapatın.
   2. Robot kolunun önündeki kapıyı açın ve raftaki hücreleri almak için kaplamalı kültür plakaları yükleyin. Dezenfekte edin ve her iki kapıyı da kapatın. "Tüplerden plaka tohumlama" yöntemini uygulayın (bkz. adım 1.4).
   3. Doğrudan hücre sayma işlevini kullanarak brightfield görüntüleme sitometresindeki hücreleri sayın. Hücre sayımı için, 384 kuyulu plaka biçiminde çoğaltma olarak 16 kuyu kullanın.
   4. 384 kuyulu sayma plakasını robot kolu kullanarak pikap üzerinden güverteden brightfield görüntüleme sitometresine taşıyın ve görüntüleme işlemini başlatın. Sitometre mililitre başına hücre numarasını otomatik olarak belirler. Robot kolu kullanarak sayma plakasını orijinal konumuna getirin.
   5. Robot kolu kullanarak raftan boru lama güvertesine kaplamalı bir kültür veya deneme plakası taşıyın. Kaplama ve tohum hücrelerini kullanıcı tarafından tanımlanan sayı ve plaka biçimine uygun hacimolarak kaldırın (bkz. Tablo 1). Hücre dağıtımı ve CO₂ kuluçka makinesine aktarmak için plakayı 500 rpm'de 10 s'lik güverteshaker'a taşıyın.
2. Otomatik kesişme değerlendirmesi
   1. Adım 1.4'te açıklandığı gibi "Birleşimi Denetle" yöntemini uygulayın. En az bir kültür plakası ve hiçbir deneme plakası içeren bir toplu iş seçin. Görüntü edinme ve görüntüleme analizi ayarları için "Parametre Ayrıntıları" girişi "iPSCf_2020" bölümünde.
   2. Co₂ kuluçka makinesinden ilk plakayı robot kolu kullanarak pikap aracılığıyla brightfield görüntüleme sitometresine taşıyın.
   3. HiPSC kolonilerinin birleşimi kontrolü için brightfield görüntüleme sitometresindeki hücrelerin görüntülenmesi. 1-iyi pate "birleştirme" uygulaması ve görüntü 13 alanları kullanın ve otomatik olarak hücrelerin kaplar tarafından işgal ortalama alanı hesaplamak.
   4. Plakayı robot kolu kullanarak CO₂ kuluçka makinesine geri götürün. Adımları 2.2.2'yi yineleyin. 2.2.4'e kadar. kalan plakalar için.
3. Kültür plakalarının veya deneme plakalarının medya değişikliği
   1. Adım 1.4'te açıklandığı gibi "Kültür Plakalarının Medya Değişikliği" yöntemini uygulayın. ve yalnızca kültür plakaları içeren bir toplu iş seçin. "Parametre Ayrıntıları" bölümündeki pipetleme adımları için uç veya iğne kullanıp kullanmadığını belirten değişkeni ayarlayın. Herhangi bir çok kuyulu plakanın ortam değişikliği için "Ataşe Plakalarının Medya Değişimi" yöntemini uygulayın ve test plakaları içeren bir toplu iş seçin.
   2. Robot kolu kullanarak CO₂ kuluçka makinesinden tek tek plakaları güverteye taşıyın ve plakaların kapağını kapatın. Plakaları otomatik olarak yatırın ve eski ortama aspire edin ve atık toplama modülüne atın. 12 mL taze ortam ekleyin. Plakayı yeniden kapatın ve robotik kolu kullanarak plakaları CO₂ kuluçka makinesine geri götürün.
4. Alt Tarım
   NOT: 1.1.1'de açıklandığı gibi GUI'den "RunHepaHood" enstrüman işlemini gerçekleştirin. ve sıvı taşıma istasyonunun ön kapısını açın. Gerekli konumlara ortam ve dissosiasyon reaktifi yükleyin (bkz. adım 1.2). İpuçlarının yeniden doldurulması gerekiyorsa, adım 1.1'de açıklandığı gibi "Yeniden Yükleme"yi kullanın. Hücre süspansiyonu almak için 50 mL'lik bir tüp giriş ve tüpün kapağını kapatın.
   1. "Yapışık Hücrelerin Alt Ekimi" yöntemini uygulayın (bkz. adım 1.4). Alt ekimi gereken kültür plakaları içeren toplu işlemi seçin.
   2. Robot kolu kullanarak co₂ kuluçka makinesinden güverteye plakaları taşıyın ve plakaların kapağını kapatın. Plakaları otomatik olarak yatırın ve eski ortamı çıkarın ve atık toplama modülüne atın. 8 mL PBS ile hücreleri bir kez yıkayın. Küme tabanlı geçiş için 0,5 mM EDTA 8 mL ekleyin. 8 dakika güvertede kuluçka.
   3. EDTA çözeltisini plakalardan çıkarın ve atık toplama modülüne atın. 12 mL taze orta ekleyin ve plakaları çalkalayıcıya taşıyın. Kolonileri yerinden çıkarmak için 1 dakika için 2000 rpm çalkalayın.
   4. iPSC kolonilerini daha küçük bir boyuta (~50\u201280 μm) kırmak için hücre süspansiyonuna beş devre boru lama için triturate. Hücre süspansiyonuna güvertedeki 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Tohum hücreleri otomatik olarak adım 2.1.5 olarak 7 1 bir split oranı kullanarak açıklandığı gibi.
      NOT: İsteğe bağlı, tek hücreli geçiş. Tek hücreli dissosasyon reaktifini kullanarak tek hücreli süspansiyon oluşturun (bkz. Adım 2.4.2'de 0.5 mM EDTA yerine, tek hücreli ayrışma reaktifinin 8 mL'sini kullanın ve 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpe toplayın ve eşit hacimli ortam ekleyin. Tek hücreli ayrışma reaktifini kullanarak ayrıştırma, hücreleri peletlemek için manuel bir adım gerektirir. 3 dk için 300 x g santrifüj hücreleri. Supernatant çıkarın ve gerekli ortam 12 mL hücre pelet resuspend ve "Tüplerden plakaların tohumlama" ile devam (adım 2.1 bakınız). HiPSC'lerin tek hücreli süspansiyonu kullanırken tohumlama gününde medyayı 2 μM tiazovivin ile tamamlayın.
5. Otomatik yüksek içerikli, yüksek iş elde görüntüleme
   NOT: Ölçüm ayarı kullanılabilir olmalıdır (bkz. Ek Dosya 1: adım 1.1). Görüntülenecek teşp plakaları kuvözde mevcuttur.
   1. "Görüntüleme" yöntemini uygulayın (bkz. adım 1.4). En az bir deneme plakası ve kültür plakası içermeyen bir toplu iş seçin. "Parametre Detayları" bölümünde plaka tipini, plaka tanımlarını (standart 96-iyi görüntüleme plakaları için: "Plate-96-2017091813842") ve ölçüm ayarının adını girin.
   2. Görüntüleme işlemini başlatmak için robotik kolu kullanarak otomatik konfokal mikroskoba pikap üzerinden hesap plakası taşıyın. Görüntülemenin sonundaki plakayı mikroskoptan kurtarın ve CO₂ kuluçka makinesine geri götürün. Kalan plakaların toplu olarak işlemini tekrarlayın.

3. HiPSC'nin otomatik bakımı ve genişletilmesi

1. Otomatik birleştirme denetimleri, ortam değişiklikleri ve alt ekimi sırası
   1. "Tüplerden tabak ların tohumlanması" yöntemini kullanarak 1 kuyu plakalı tohum hücreleri (bkz. adım 2.1). Alternatif olarak, "Kültür plakasının yüklenmesi" yöntemini kullanarak elle tohumlanmış 1-kuyu plakalarını alın (bkz. adım 1.5).
   2. IPSC kültürünün 1.günden 6.gününe kadar koloni büyümesini izlemek için günlük otomatik birleştirme denetimleri zamanlayın (bkz. adım 2.2).
   3. "Kültür plakalarının medya değişikliği" yöntemini kullanarak her iki günde bir ortamı yenileyin (bkz. adım 2.3). Plaka başına 12 mL orta kullanılır.
   4. 6. günde "Subcultivation" işlemini başlatın (bkz. adım 2.4.).

4. Otomatik farklılaşma

1. Kortikal NGN2 nöronlar için İnsan iPSC
   NOT: Manuel hiPSC hazırlığı. Protokol, teslimat için lentiviral vektörler kullanarak NGN2 aşırı ifade içerir. NGN2 ile transduce hiPSC ile rTTA3 lentivirus bir 1:2 oranı (> ~ 10⁷ TU/mL). Hücreler daha sonra 0.5 μg/mL puromisin içeren bir pasaj için seçilir. Kararlı hiPSC-NGN2 satırları oluşturmak için ayrıntılı bir protokol Ek Dosya 1:adım 2'de yer almaktadır.
   1. Adım 2.4.4 notunda açıklanan tek hücreli dissosiasyon reaktifi kullanılarak açıklandığı gibi "Subcultivation" işlemine devam edin. hiPSC ulaştığında 70\u201280% birleşme
   2. 2,5 g/mL doksisiklin (doks) ve 2 μM tiazovivin içeren 12 mL NGN2 ortam(Malzeme Tablosu)içinde süpernatantı çıkarın ve hücre peletini yeniden askıya alın.
   3. "Plakaların tüplerdenTohumlanması" yöntemini kullanarak farklılaşmaya başlayın (bkz. adım 2.1). iPSC'nin istenilen tohumlama yoğunluğunu 30.000/cm² olarak ayarlayın (tablo 1'e bakın). iPSC, 0.1 mg/mL poli-L-ornitin (PLO) ve 5 μg/mL laminile önceden kaplanmış plakalara kaplanır.
      NOT: RNA ve proteomik temelli çalışmalarda 1-kuyu plakaları tercih edilirken, görüntüleme deneyleri için 96 kuyulu plaka formatı tercih edilmektedir. 48, 24, 12 veya 6-well plakalar gibi diğer ispon plaka biçimleri de kullanılabilir.
   4. Farklılaşmanın birinci gününde, 2.5 μg/mL dox ve 10 μM N-[2S-(3,5-diflorophenyl)asetil]-L-alanyl-2-fenil-glisin, 1,1-dimetil ester (DAPT) ile desteklenen NGN2 ortamını kullanarak "araştırma plakalarının medya değişimi (bkz. adım 2.3) kullanarak ortam yenileyin. İstenilen farklılaşma gününe kadar her 2\u20123 günde bir ortam değişikliklerine devam edin (bkz. adım 2.3).
   5. Farklılaşmanın 4. gününde, olgunlaşmayı artırmak için 10 ng/mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF), 10 ng/mL glial hücre kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) ve 10 ng/mL nörotrofik faktör (NT-3) ile desteklenen NGN2 ortamını kullanarak başka bir medya değişikliği (bkz. adım 2.3.) gerçekleştirin. Deneyin sonunda, alt akım deneyleri için sistemden kültür plakalarını dışa aktarın (bkz. adım 1.6).
2. KÜÇÜK molekül nöral öncühücreleri (smNPC) NGN2 nöronlar için
   NOT: Yayınlanan protokol^12'nin uyarlanmış sürümünü takip eden smNPC türetin (bkz. Ek Dosya 1: adım 5). SmNPC'yi NGN2 ve rTTA3 virüsüyle değiştirin (Bkz. Ek Dosya 1: adım 2). Bir tur NGN2 ve rTTA transdüksiyonistikrarlı bir popülasyon oluşturmak için yeterlidir. Ayrıca canlı hücre izleme gerçekleştirmek için izin pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus ile smNPC değiştirin. GFP lentiviral transdüksiyoniçin 10 enfeksiyon (MOI) çokluğu kullanılır.
   1. Adım 2.4'te açıklandığı gibi tek hücreli dissosyasyon reaktifi kullanılarak biraraya ulaşmada geçiş smNPC. Roman
   2. Otomatik hücre kültür sistemini kullanarak 50.000/cm² hücre yoğunluğunda "Tüplerden tabak ların tohumlanması" yöntemi (bkz. adım 2.) 0.1 mg/mL FKÖ ile önceden kaplanmış plakalara ve NGN2'de 5 μg/mL laminin 2.5 g/mL doks ile desteklenmiştir.
   3. 3. gün, 2,5 g/mL doks ve 10 μM DAPT içeren taze NGN2 ortamını kullanarak bir ortam değişikliği gerçekleştirin (bkz. adım 1.3.). 3. günden sonra, her biri 10 ng/mL'de 2,5 g/mL dox, BDNF, GDNF ve NT-3 içeren taze NGN2 ortamı yla her üç günde bir ortam değişiklikleri gerçekleştirin.
   4. Görüntü hücreleri günlük "Otomatik yüksek içerik, yüksek iş yapma görüntüleme" yöntemini kullanarak (bkz. adım 2.5) neurite outgrowth için okuma olarak GFP kullanarak farklılaşma durumunu izlemek için. Lazer gücünü %80'e ayarlayın ve 30 ms'lik bir pozlama süresi kullanın. 20x hedefini kullanarak çok sayıda alan (örneğin, 25 alan) edinin.
3. Toplu görüntü analizi
   1. Neurite outgrowth şablonu kullanarak görüntü analizi yazılımı 1 ile görüntü analizi gerçekleştirin.
   2. Yazılımı açın. "Veri" seçeneğini seçin ve görüntüleme veri klasörüne göz atın, analiz edilecek verileri yüklemek için tamam'ı tıklatın. Aç'ı tıklatın ve üst menü çubuğundan protokol seçin ve uygulama menüsünden neurite outgrowthseçin. "Algoritmalar" gidin ve çekirdek, hücre gövdesi ve neurite tanımlamak için "488" kanalını kullanın. Her biri için eşik parametrelerini ayarlayın.
   3. Görüntü analizi için kullanılacak kuyuları seçin. Sağ alttaki linke tıklayın ve hücre sayısı ortalaması, toplam iskelet uzunluğu toplamı gibi analiz edilecek özellikleri seçin. "Ön analiz" ve ardından "önizleme" ile devam edin.
   4. Önizleme ayarlarının kabul edilebilir olup olmadığını kontrol edin ve toplu iş modunda çözümlemeye başlayın. Sonuçlar, excel'de açılabilir .csv dosya biçiminde "raporlar" altında ana klasörde kullanılabilir.
      NOT: Görüntü analizi komut dosyası istek üzerine kullanılabilir.
   5. Toplam neurit uzunluğu ile elde edilen arsa ortalama neurit uzunluğu hücre sayısına normalleştirilmiştir.

5. HiPSC'nin orta beyin dopaminerjik (mDA) nöronlara otomatik farklılaşması

1. Manuel hiPSC hazırlığı
   1. Tek hücreli ayrışma reaktifini kullanarak 70\u201280% confluent hiPSC'yi tek hücrelere ayırın. Kısaca, 37 °C'de 30 dakika boyunca tek hücreli ayrışma reaktifi (100 μL/cm²⁾ile inkübasyon hücreleri, konik bir tüp, 200 x g'de 5 dk için santrifüj ve iPSC kültür ortamında hücre peletini yeniden askıya almak için hücre süspansiyonunu toplar.
   2. Hücre dışı matris kaplı 1 kuyulu plakalar üzerinde 200.000 hücre/cm² ve 10 μM Y-27632 ile desteklenen iPSC kültür ortamı. Kültür hücreleri bir gecede 37 °C ve %5 CO_2'de.
2. Otomatik farklılaşma: Faz 1
   1. Adım 1.1\u20121.2'de açıklandığı gibi otomatik kültür sistemini hazırlayın.
   2. Otomatik kültür sisteminin CO₂ kuluçka makinesine hücreleri içeren kültür plakalarını yükleyin (bkz. adım 1.5).
   3. KSR ortamını hazırlayın (bkz. Malzemeler Tablosu)ve küçük moleküllerle tamamlayın (bkz. Tablo 2) farklılaşmanın başlangıç günü 0 için gereklidir. Küçük moleküller ve büyüme faktörleri ile sadece taze hazırlanmış medya kullanın.
   4. 2.3. basamakta açıklandığı gibi kültür plakalarında medya değişikliklerini 0 ve 1 gün farklılaşma günlerini ve ardından 25.
   5. 5. günden itibaren, tablo 3'teayrıntılı olarak açıklandığı şekilde medya formülasyonlarını kademeli olarak kaydırın.
   6. 11. günde, CHIR (13. güne kadar), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 ve DAPT ile desteklenen mDA nöron farklılaşma ortamını ekleyin (Malzeme Tablosunabakın).
   7. 25. günde, plakaları boşaltın (bkz. adım 1.6.)
3. Manuel rekaplama 1
   1. Tek hücreli ayrışma reaktifini kullanarak 25 mDA'lık gün öncüllerini tek hücrelere ayırın. Kısaca, tek hücreli ayrışma reaktifi olan (100 μL/cm²) 37 °C'de 40 dakika boyunca inkübasyon hücreleri, konik bir tüpe hücre süspansiyonu, 5 dk için 200 x g'de santrifüj ve mDA nöron farklılaşma ortamında hücre peletini yeniden askıya alır.
   2. Tohum 400.000 hücre/cm² 1-iyi kültür plakaları önceden kaplanmış 0.1 mg/mL FKÖ, 10 g/mL laminin ve mDA nöron farklılaşma ortamı 2 μg/mL fibronektin ile takviye 10 μM Y-27632 (26 güne kadar) ve küçük moleküller ve büyüme faktörleri Tablo 2açıklanan . Kültür hücreleri bir gecede 37 °C ve %5 CO_2'de.
4. Otomatik farklılaşma: Faz 2
   1. Adım 1.5'te açıklandığı gibi otomatik kültür sisteminin CO₂ kuluçka makinesine mDA nöronları içeren yük kültür plakaları
   2. MDA nöron farklılaştırma ortamı (bkz. Malzemeler Tablosu)ve 26.
   3. Farklılaşmanın 26.
      NOT: Yüksek iş lenme amaçlı olarak, adım 5.5'te açıklandığı gibi, 32.
5. Manuel rekaplama 2
   1. Adım 1.6'da açıklandığı gibi kültür plakalarını boşaltın. Adım 5.3.1'de açıklandığı gibi 32 mDA nöronları tek hücrelere ayırın.
   2. 10 μM Y-27632 (33 güne kadar) ve küçük moleküller ve büyüme faktörleri ile desteklenen mDA nöron farklılaşma ortamında 0.1 mg/mL FKÖ, 10 g/mL laminin ve 2 μg/mL fibronektin ile önceden kaplanmış 96 kuyulu plakalarda 100.000 hücre/cm² tohum (Bkz. Tablo 2). Kültür hücreleri bir gecede 37 °C ve %5 CO_2'de.
   3. Gün 33, taze hazırlanmış DA nöronlar farklılaşma orta küçük moleküller ve büyüme faktörleri ile takviye (Y-27632 olmadan) orta değiştirin. 65. güne kadar her 3\u20124 günde bir orta yı el ile değiştirin.

6. İmmünoboyama, otomatik yüksek iş hacmi görüntü edinimi ve analizi

1. Floresan boyama
   1. Ek Dosya 1:adım 4'te açıklandığı gibi floresan immünoboyama yapın.
   2. Ek Dosya 1'deaçıklandığı gibi görüntü hücreleri : adım 1.2.
   3. 6.2 adımda açıklandığı gibi, daha fazla görüntü analizi için görüntüleme sistemi tarafından oluşturulan görüntüleme dosyalarını görüntü analiz yazılımı 2'ye (bkz.
2. Görüntü analizi yazılımı 2 kullanarak görüntü analizi
   1. Görüntüleme dosyaları görüntü analizi yazılımı 2'ye yüklendikten sonra "görüntü analizi" işlevine gidin ve açılan menüyü kullanarak analiz algoritmasını oluşturun.
   2. Hücre çekirdeğine ait görüntüdeki bölgeleri algılayan "çekirdekleri bul" görevini kullanarak çekirdekleri seçin (burada Hoechst ile boyanmış). Çekirdekleri ölü hücrelerden (pyknotic çekirdekleri) nükleer alan veya çap için bir eşik belirleyerek hariç tutarak.
   3. "sitoplazmayı bul" görevini kullanarak hücre sitoplazmasını seçin. Bu görev hücre sitoplazmasına ait çekirdeklerin çevresindeki bölgeleri algılar. Yalnızca iyi parçalı hücreleri ekleyin. Mitotik, apoptotik ve kötü parçalı hücreleri hariç tinler. Görüntünün kenarlığı dokunan hücreleri kaldırın.
   4. "Morfoloji özelliklerini hesapla" ve "yoğunluk özelliklerini hesapla" görevlerini ekleyin. Morfoloji parametreleri, ilgi çeken bir bölge için alan gibi morfoloji özelliklerinin hesaplanmasını içerir. Yoğunluk parametreleri, bir ilgi bölgesinin ortalama yoğunluğu (örn. nöronların sitoplazması) gibi yoğunluk özelliklerinin hesaplanmasını içerir.
   5. Bir veya daha fazla koşul, morfoloji ve/veya yoğunluk kullanarak giriş popülasyonunun (seçilen tüm sitoplazmalar) bir alt popülasyon (örneğin, TH pozitif nöronlar) seçin.
      NOT: Genellikle nöronlar için yoğunluk seçilir. Negatif kontrollere dayanarak, nöronların TH için pozitif olarak kabul edilen yoğunluk eşiğini yukarıda tanımlamak mümkündür.
   6. Çıktı sonuçlarını tanımlayın. Bu her analizin son yapı taşı. Bir kültür plakasının her kuyusu için tahmon okuma değerlerini tanımlar (kuyu başına sonuçlar).
   7. Toplu iş çözümlemesi çalıştırın ve sonuçları dışa aktarın. Pozitif hücre sayısını toplam çekirdek sayısına normalleştirin ve verileri pozitif hücrelerin yüzdesi olarak temsil edin.

7. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR)

1. Ek Dosya 1:adım 3'te açıklandığı gibi qRT-PCR protokolünü gerçekleştirin.

Results

Otomatik hücre kültürümüz ve görüntüleme sistemimiz, hiPSC ekimini ve kortikal veya orta beyinli dopaminerjik (mDA) nöronlar gibi farklı hücre tiplerine farklılaşmasını standartlaştırmamıza olanak tanıyan insan müdahalesini en aza indirmek üzere tasarlanmıştır. Entegre görüntüleme cihazları ile otomatik hücre kültür sistemimizin şematik bir özeti Şekil 1'degösterilmiştir. Hücre kültürlerinin bu otomatik hücre kültür sistemine ilk girişi ya 50 mL'lik bir tüpten hücreleri otomatik olarak tohumlayarak ya da kültür veya analiz plakalarının ithalatı için "Kültür Plakalarının Yüklenmesi" veya "Assay Plakalarının Yüklenmesi" yöntemi kullanılarak yapılabilir. Sistemimizin merkezi bir bileşeni, ortam değişiklikleri veya alt tarımlar gibi tüm sıvı transfer adımlarının gerçekleştirildiği sıvı taşıma istasyonudur. Sıvı işleyicisinin özel yapım güverte düzeni Şekil 2'detemsil edilmektedir. Sıvı taşıma istasyonu dört pozisyon ile donatılmıştır. En fazla dört plaka paralel ortam değişiklikleri sağlayan, güverteye kuvözden transfer edilebilir. Alt tarım yönteminde hem ebeveyn hem de kız kültür plakalarının güvertede yer alması gerektiği için, paralel olarak işlenen en fazla kültür plakası sayısı iki ile sınırlıdır. Sıvı işleme istasyonunun önemli bir özelliği, hücre kültürünün tamamen kaldırılması için ortam değişimi sırasında plakaları yatırma imkanıdır. Ayrıca, sıvı işleme istasyonu subcultivation protokolünün yürütülmesi sırasında hücrelerin enzimatik dissociation lehine shakers ile donatılmıştır. Otomatik kültür sistemimiz aynı zamanda iki görüntüleme sistemi yle donatılmıştır: hücre sayımı ve birleştirme kontrolleri için parlak alan görüntüleme sitometresi ve bu nedenle zaman içinde hücre büyümesini izlemek ve hücrelerin hızlı, yüksek içerikli ve yüksek çözünürlüklü görüntülemesi için çift dönen disk konfokal mikroskobu.

HiPSC kültürleri brightfield görüntüleme sitometrede büyüme için günlük olarak izlenir ve birleşim yüzdesi için analiz edilir. Sol panelde ve sağ panelde brightfield görüntü sitometre ile elde edilen brightfield görüntü analizinden yeşil bir maske (Şekil 3A). Paralel olarak yetiştirilen ve 1.günden güne 6'ya kadar kesişme kontrollerine tabi tutulan iki hiPSC hattının (n = 4 plaka) birleştiği yüzdelerde gösterildiği gibi, zaman içinde homojen bir hiPSC büyümesi gözlenir(Şekil 3B). Belirlenen eşiğe ulaştıktan sonra hiPSC geçiş yapılır. Hücre hatları elle (m) veya otomasyon (a) sistemi tarafından kültürlenmiş ve tipik kök hücre morfolojisinin en az iki pasaj, temsili brightfield görüntüleri için sürdürülmesi için gözlenmiştir(Şekil 4A). El ile kültürlü hiPSC (gösterilmez) veya otomatik sistemde tipik kök hücre belirteci OCT4 (kırmızı) ve SSEA4 (yeşil), immünororesans analizinde gösterildiği gibi(Şekil 4B)sergilendi. PLuripotency belirteçleri OCT4, NANOG ve REX1 ekspresyonu da qRT-PCR (Şekil 4C) ile mRNA düzeyinde değerlendirildi. Göreli nicelemeler, elle yetiştirilen bir hücre hattından (m) ve otomatik kültür sisteminden (a) yinelenen (1 ve 2 çoğaltma) alınan örneklerle gerçekleştirilmiştir. Otomatik kültür sisteminde ekili çoğaltmalar her üç pluripotency belirteçleri ifade düzeyleri manuel kültür sonra marker ifade benzer. 8. günde (D8), pluripotens belirteçlerinin ekspresyonu hiPSC'den ayırt edilen kortikal nöronlarda (Diff) yoktu.

Otomatik kültür sisteminin önemli bir uygulaması, hiPSC'nin nöronlar da dahil olmak üzere farklı hücre tiplerine farklılaşmasıdır. Burada çok kısa bir süre içinde (yaklaşık 6 gün) saf kortikal nöron kültürü üreten NGN2 stratejisini kullanarak nöronlara hiPSC farklılaşmasını gösteriyoruz. Otomatik kültür sisteminde farklılaşan nöronlar (a) manuel olarak yetiştirilen nöronlar (m)(Şekil 5A)olarak benzer morfoloji ve nöronal ağ organizasyonu sunmuştur. Otomatik diferansiye kortikal nöronlar TUBB3 (nörona özgü Sınıf III β-tubulin, kırmızı) ve BRN2 (üst kortikal tabaka belirteci, yeşil)(Şekil 5B)için pozitifti, manuel olarak farklılaştırılmış nöronlarla karşılaştırılabilir (veriler gösterilmedi). Mikrotübül ilişkili protein 2(MAP2),nöral hücre adezyon molekülü(NCAM1)ve Synapsin-1(SYN1)gibi nöronal belirteçlerin yanı sıra kortikal nöron belirteçleri BRN2 ve CUX1 (üst kortikal tabaka) gibi nöronal belirteçlerin ekspresyonu 8.gün (D8) farklılaşmanın nöronlarda zenginleştirilmiştir (Şekil 5C). HiPSC'de bu belirteçlerin çok düşük veya hiç ekspresyonu gözlenmedi. Göreli nicelemeler, elle yetiştirilen bir hücre hattından (m) ve otomatik kültür sisteminden (a) yinelenen (1 ve 2 çoğaltma) alınan örneklerle gerçekleştirilmiştir. Çoğaltmadaki ifade düzeyleri, el ile ve otomatik farklılaştırmalar arasında benzer varyasyonlar gösterir.

Otomatik kültür sisteminin entegre görüntüleme yeteneği, kültürlerin sağlığı için eller serbest veri toplama olanağı sağlayarak fenotipik okumaların uzun süreli otomatik olarak kazanılmasını sağlar. GFP lentivirus ile transek küçük bir molekül türetilmiş nöral öncül (smNPC) hattına NGN2 yaklaşımını kullanarak, herhangi bir manuel müdahale olmaksızın 11 günlük farklılaşma süresinin ölçüldüğü canlı hücre otomatik neurite outgrowth çıktısı oluşturduk. 1, 3 ve 11. Farklılaşmanın 1.günden 11'e kadar olan nötrit uzunluğundaki artış ölçüldü ve farklı kuyularda benzer bir gelişme gösterdi. Basitlik adına, 96 kuyulu bir plakadan her biri 6 kuyuiçeren sadece 3 sütundan elde edilen veriler temsili grafikte gösterilmiş, ancak tüm iç 60 kuyu analiz edilmiştir(Şekil 6C).

Burada gösterilen otomatik kültür sisteminin bir diğer uygulaması da hiPSC'nin mDA nöronlarına farklılaşmasıdır. Farklılaşma, önceden belirlenmiş bir protokolü takiben medya değişikliklerine dayanır ve 0'dan 65'e kadar otomatik kültür sisteminde gerçekleştirilir. Otomatik ortam değişiklikleri hücre kopması veya farklılaşma da başka bir görsel olarak algılanabilir değişikliklerneden olmadı. Farklılaşmanın sonunda, 65. mRNA düzeyinde, otomatik kültür sisteminde farklılaşan mDA nöronları sırasıyla nöronal ve mDA belirteçleri, MAP2 ve TH (tirozin hidroksilaz) ekspresyonunu göstermektedir(Şekil 7C). Her iki farklılasyon da önemli miktarda TH ve MAP2 pozitif nöron üretilmiştir(Şekil 7D).

Şekil 1: Otomatik hücre kültürü ve görüntüleme platformunun şematik genel bakışı.
Sistem, hücre kültürü uygulamaları için steril bir ortam sağlayan dört UV lambası ile donatılmış iki HEPA davlumbaz (A ve B) ile tasarlanmıştır. Hücre kültürü plakaları ön kapı (C) üzerinden erişilebilen robotik kol önündeki raflara yüklenir. Plakalar 456 plaka kapasiteli CO₂ kuluçka makinesine (D) yüklenir. Bir brightfield hücre sitometresi (E) alt ekim rutinleri sırasında birleştirme kontrolleri ve hücre sayma için kullanılır. Sıvı taşıma istasyonu HEPA davlumbazlarından (B) altındadır. Sıvı işleyicisinin güverte düzeni Şekil 2'deaçıklanmıştır. Sıvı taşıma istasyonunun borulama kolu 96 kanallı pipetleme kafası, sekiz adet 1 mL pipetleme kanalı ve dört adet 5 mL borulama kanalı taşır. 1 mL borulama kanalları nda sıvı transferleri için uçlar veya iğneler kullanılabilir. Tarama amacıyla, test plakalarında tohumlanan hücreler, bu numuneleri ikinci bir kuluçka makinesinde (G) eritildikten sonra otomatik -20 °C depolama sisteminde (F) -20 °C'de saklanan numunelerle tedavi edilebilir. Yüksek iş elde görüntüleme otomatik konfokal mikroskop (H) iki dönen disk veya epifloresan modunda kullanarak konfokal modda görüntü elde etmek için sunan gerçekleştirilir. Mikroskoba entegre edilmiş bir canlı hücre odası kültürlü hücrelerin uzun süreli görüntülenmesine olanak sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Sıvı taşıma istasyonunun güverte düzeni.
İpucu pozisyonları 50 μL ipuçları için "50°L", 300 μL ipuçları için "standart" ile, 1 mL uçlar için "yüksek" ve 5 mL uçlar için "5 mL" ile gösterilir. Güverte bileşenleri: (A) Herhangi bir kültür plakası veya deneme plakası formatı için kullanılabilen dört ısıtmalı shaker pozisyonu (maksimum hız: 2500 rpm). Çalkalayıcı konumları, güverteye yapılan taşımaları takiben plaka hizalaması için de kullanılan kelepçelenebilir kavrayıcılarla donatılmıştır. Ayrıca, shaker pozisyonları sıvı transfer adımları sırasında plakalar için bir kapak park pozisyonu olarak işlev. Temsili amaçlar için, tüm shaker pozisyonları 96 iyi assay plakaları tarafından işgal edilmiştir. (B) Herhangi bir formattaki dört plakayı aynı anda işlemek için dört eğim modülü en üste yerleştirilir. En düşük konum kültür ve deneme plakaları için atık toplama odası ve 96 kanal lı borulama kafasını işaretler. Temsili amaçlar için, tüm eğim modülleri 96-well plakaları tarafından işgal edilmiştir. (C) Üst konumda, hücre sayma için 384 kuyulu plaka bulunur. Aşağıda temsilamaçlı 96 kuyulu plakalar tarafından işgal edilmiş plakalar için iki pozisyon ve dört 50 mL ve dört adet 15 mL tüp için bir raf bulunmaktadır. En düşük konum 5 mL ipucu ile kaplanır. (D) Ortam rezervuarları için konumları olan üç ortam satırı. Ortam hatları, ortam haznesini 250 mL'ye kadar ortamla otomatik olarak doldurmaya olanak tanıyan sıvı seviye sensörlerine sahiptir. (E) Aktif drenajlı iki sıvı atık modülü üst üste, bir konteyner (beyaz) pozisyonu na sahip sıcaklık kontrollü bir modülün altında ve 5 mL uçlu raf bulunur. (F) 1 mL ipucu için beş pozisyon. (G) Sıcaklık kontrollü iki modül alta, bir de kapaklarının üst te stoğa yerleştirilmiş tir. (H) Üstteki iki 50 μL iç içe uçlu uç rafı (NTR) için pozisyonlar ve ardından tek kanallı iki pozisyon ve 300 μL'lik 96 kanallı top alma ve alt kısımda 5 mL uçlu raf. (I) Üstte 384 kuyulu sayma plakaları için bir istifleyici ve ardından üç adet 300 μL NTR ve alt kısmında 5 mL uçlu raf. (J) Sekiz yeniden kullanılabilir metal 1 mL iğneüç set depolama ve yıkama istasyonu. (K) Güvertede taşıma basamakları için kullanılan 1 mL ve 5 mL boru kanalları ve boş NTR (gri) için atık konumu ve 1 ve 5 mL kanallar (beyaz) için bir kavrayıcı bloğu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: hiPSC'nin otomatik kesişme kontrolü.
(A) Hücre sitometresi (solda) tarafından çekilen hiPSC'nin temsili brightfield (BF) görüntüleri ve yeşil deki hücrelerin kapattığı orantılı alanı gösteren otomatik birleşme analizinden (sağda) sonra; (B) Kültür, n = 4 1-iyi plakalar kültür gün 1-6 iki hiPSC satır (iPS #1 ve #2) kaydedilen birleştirme yüzdeleri hücre hattı başına 4 1-iyi plakalar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: HiPSC'nin geçişi.
(A) bir hiPSC hattının BF görüntüsü el ile (solda) ve otomatik kültür sistemi (sağda) kullanılarak büyütülür. Görüntüler ikinci geçişten 6 gün sonra çekildi; (B) Pluripotency belirteçleri OCT4 ve SSEA4 için boyanmış hiPSC temsili görüntüler ve Hoechst 33342 (Nuclei) ile sayaç; (C) Pluripotency belirteçleri OCT4için qRT-PCR sonuçları, NANOG ve REX1 bir hiPSC hattında yinelenen (1 ve 2) manuel olarak yetiştirilen (m) ve otomatik kültür sistemi (a) ve ilgili hiPSC kaynaklı kortikal nöronlar (Diff) gün 8 (D8) farklılaşma. Veriler, referans örneği olarak iPS_a_1 kullanılarak nispi miktar (RQ) olarak temsil edilir. Hata çubukları, qRT-PCR reaksiyonunun 3 teknik çoğaltmasından standart sapmayı (SD) temsil eder. GAPDH, RPL13A1 ve RPLPO temizlik genleri olarak kullanıldı. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: İnsan iPSC kaynaklı kortikal nöronlar.
(A) Brightfield görüntüleri gün 6, manuel (m) ve otomatik (a) benzer nöronal ağları gösteren kortikal nöronlar ayırt; (B) Farklılaşmanın 8. (C) Kortikal nöronların marker genleri için qRT-PCR sonuçları (MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 ve SYN1) gün 8 (D8) farklılaşma zenginleştirilmiş. Veriler, referans örneği olarak iPS_a_1 kullanılarak nispi miktar (RQ) olarak temsil edilir. Hata çubukları QRT-PCR reaksiyonunun 3 teknik çoğaltmasından SD'yi temsil eder. GAPDH, RPL13A1 ve RPLPO temizlik genleri olarak kullanıldı. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Neurite outgrowth için yüksek iş çıkışlı bir çıkış çıktısı.
(A) Farklılaşmanın 1, 3 ve 11. (B) Farklılaşmanın 1, 3 ve 11. Neurite outgrowth yüksek içerikgörüntü analizi yazılımı 1 kullanılarak ölçüldü ve neurite uzunluğu olarak temsil edilir; (B) Grafik NPC türetilmiş NGN2 nöronlarda nörit uzunluğu artış ve yoğun bir ağ oluşumu görüntüler. İç 60 kuyuda bulunan 96 kuyulu üç tabak görüntülenmiş. Basitlik için, 96 kuyulu plaka başına sadece üç kuyu sütunu, sütun başına n = 6 kuyu ile örnek olarak gösterilir. Kuyu başına ortalama 1308 hücre analiz edildi. Hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil eder (S.E.M.). Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: İnsan iPSC kaynaklı mDA nöronlar.
Orta beyin DA nöronlar manuel olarak ayırt (m) ve otomatik (a) kültür sisteminde. (A, B) Tirozin hidroksilaz (TH, mDA nöron belirteci; yeşil), MAP2 (nöronal marker; kırmızı) ve Hoechst 33342 (çekirdekler; mavi); (C) MDA nöronların marker genleri için temsili qRT-PCR sonuçları manuel olarak ve otomatik kültür sisteminde ayırt edilir. TH ve MAP2 ekspresyon düzeyleri, ev tutma genlerine(OAZ1 ve GAPDH)normalleştirilmiş göreli miktar (RQ) olarak gösterilir; (D) Manuel ve otomatik farklılaşma ile oluşturulan TH ve MAP2 pozitif nöronların yüzdeleri. Hata çubukları, iki farklı iPSC satırı (#1 ve #2) ile gerçekleştirilen iki bağımsız farklılaştırmanın SD'sini temsil eder. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hücre tipi	Amaç	Protokol adımı	Hücre yoğunluğu	Plaka biçimi	Hücre numarası/kuyu
NGN2 farklılaşması
iPSC	NGN2 kararlı hat üretimi	S.2.3.	30.000 hücre/cm2	12-iyi	1,17,000
iPSC	NGN2 nöron farklılaşması	3.1.3.	30.000 hücre/cm2	1-iyi	25,20,000
iPSC	NGN2 nöron farklılaşması	3.1.3.	30.000 hücre/cm2	96-iyi	9,600
smNPC üretimi
smNPC	Replating gün 12 ve 16	S5.9. ve S5.11.	70.000 hücre/cm2	6-iyi	6,72,000
smNPC	5. geçitten rekaplama	5.11.	50.000 hücre/cm2	6-iyi	4,80,000
smNPC	ngn2 nöronlar için smNPC	3.2.2	50.000 hücre/cm2	96-iyi	16,000
mDA farklılaşması
iPSC	mDA nöron farklılaşması	4.1.2.	200.000 hücre/cm2	1-iyi	1,68,00,000
DA nöronlar	Gün 25 replating	4.3.2.	400.000 hücre/cm2	1-iyi	3,36,00,000
DA nöronlar	Gün 25 replating	4.5.2.	100.000 hücre/cm2	96-iyi	32,000
Kaplama	Amaç	Protokol adımı	Konsantrasyon/ Seyreltme	Plaka biçimi	Kaplamanın ayrıntıları
iPS kültürü
Hücre dışı matris	iPSC, NGN2 hattı, mDA nöronlar	1.5.7. ve S2.3.	1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12	1-/12-kuyu	8/0.5 mL/kuyu; RT'de 1 saat
NGN2 farklılaşması
Poli-L-Ornitin	NGN2 nöron farklılaşması	3.1.3. ve 3.2.2.	0.1 mg/mL; Pbs	1-/96-kuyu	8/0.1 mL/kuyu; 37°C'de 12 saat; 3x PBS yıkama
Laminin	NGN2 nöron farklılaşması	3.1.3. ve 3.2.2.	5 μg/mL; Pbs	1-/96-kuyu	8/0.1 mL/kuyu; 37°C'de 4 saat
smNPC üretimi
Hücre dışı matris	smNPC üretimi ve kültürü	S5.6., S5.9., S5.11.	1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12	6-iyi	1 mL; RT'de 2 saat
mDA farklılaşması
Hücre dışı matris	mDA farklılaşması	4.1.2.	1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12	1-iyi	12 mL; 37°C'de 12 saat
Poli-L-Ornitin	mDA farklılaşması	4.3.2. ve 4.5.2.	0.1 mg/mL; Pbs	1-/96-kuyu	12/0.1 mL/kuyu; 37°C'de 12 saat; 3x PBS yıkama
Laminin	mDA farklılaşması	4.3.2. ve 4.5.2.	10 μg/mL; Pbs	1-/96-kuyu	12/0.1 mL/kuyu; 37°C'de 12 saat
Fibronektin	mDA farklılaşması	4.3.2. ve 4.5.2.	2 μg/mL; Pbs	1-/96-kuyu	12/0.1 mL/kuyu; 37°C'de 12 saat
*Bu ürünün Analiz Sertifikası'nda bulunan seyreltme faktörü (μL cinsinden) olarak hücre dışı bir matris aliquot olarak tanımlanır.

Tablo 1: Hücre yoğunluğunu ve kaplamayı plaka formatına göre tohumlama.

Gün	Reaktif
Gün 0 - 1	100 nM LDN193189, 10 μM SB431542
Gün 1 - 3	100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorfamin, 100ng/mL FGF-8b
Gün 3 - 5	100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorfamin, 100ng/mL FGF-8b, 3 μM CHIR99021
Gün 5 - 7	100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM Purmorfin, 100ng/mLFGF-8b, 3 μM CHIR99021
7. Gün - 9	100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021
Gün 9 - 11	100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021
Gün 11 - 13	3 μM CHIR99021, 20 ng/mL BDNF, 0.2 mM L-askorbik asit (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT
Gün 13 - 65	20 ng/mL BDNF, 0.2 mM L-askorbik asit (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT

Tablo 2: Dopaminerjik nöron farklılaşması için küçük molekül ilavesi.

Gün	KSR orta	N2 orta	Diferansiyasyon ortamı
Gün 0 - 1	100%	0	0
Gün 1 - 3	100%	0	0
Gün 3 - 5	100%	0	0
Gün 5 - 7	75%	25%	0
7. Gün - 9	50%	50%	0
Gün 9 - 11	25%	75%	0
Gün 11 - 13	0	0	100%
Gün 13 - 65	0	0	100%

Tablo 3: Dopaminerjik nöron farklılaşması için ortam gradyanı.

Ek Dosya 1. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

HiPSC kültürünün standardizasyonu ve nöronal farklılaşma için entegre görüntüleme yeteneklerine sahip otomatik bir hücre kültür sistemi sıyoruz. Minimal kullanıcı müdahalesi nedeniyle, deneysel varyasyon farklılaşma sırasında hücresel fenotiplerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için düşüktür. Takvim tabanlı zamanlayıcı, deneylerin organizasyonunu ve paralelleştirilmesini destekler ve deneylerin gerçekleştirildiği anda yüksek derecede esneklik sağlar. Mevcut yöntemler kolayca uyarlanabilir ve mevcut yöntemlerin spektrumu artırılabilir. Ayrıca, bu sistemin esnekliğini ekleyerek çok sayıda sayma plakası biçimi kullanılabilir. CO₂ kuluçka makinesi, robotik kol, parlak alan hücre sitometresi ve sıvı taşıma istasyonundan oluşan minimal sistem, akademik araştırma laboratuvarlarına uygun maliyetlerle hiPSC kültürü ve farklılaşması için gerekli temel birimi oluşturur. Otomatik hücre kültür sisteminin bileşiklerin, RNAi kütüphanelerinin veya CRISPR/Cas9 kütüphanelerinin depolanması için otomatik -20 °C depolama sistemiyle birleştirilmesi ve yüksek içerikli/yüksek iş itimatmikroskobunun entegrasyonu fenotipik taramaların gerçekleştirilmesini sağlar.

Mevcut çalışmada, otomatik hücre kültürü sistemi tek kullanımlık ipuçları kullanılan ve kültür medya rezervuar içine elle doldurulmuş, böylece medya değişiklikleri ve özellikle bir gecede diğer kültür süreçleri için sıvı işleme istasyonu kullanımını sınırlayan. Bu sınırlamayı aşmak için, yöntemler tek kullanımlık ipuçları yerine iğne kullanımına ayarlanabilir ve ortam hatları ile buzdolabında saklanan ortam torbaları arasında tüp bağlantıları yükledikten sonra, ortam rezervuarları ısıtıcı elemanları tarafından önceden ısıtılan taze ortamla otomatik olarak doldurulabilir. Bu, ipuçlarının, kültür ortamının ve rezervuar alışverişinin manuel olarak doldurulmasından kaynaklanan kullanıcı girişimlerini azaltacaktır.

Otomatik hücre kültürü sistemimiz çeşitli avantajlar sunar. Biri barkod takip sistemi. Sisteme yüklenen plakalar, yöntem infazı sırasında ve sonrasında numunelerin izlenmesine olanak tanıyan sistem tarafından okunan ve kaydedilen benzersiz bir barkod ile tanımlanır. Bir diğer avantajı da kullanıcıya özel projeler oluşturma olanağıdır. Burada, sisteme yüklenen kültür plakaları belirli bir projeye atanabilir ve gruplar halinde gruplandırılabilir. Toplu olarak yapılandırılmak, tek tek plakaların seçilmesine gerek olmadığından, belirli bir toplu işlemin tüm plakalarına aynı işlemin uygulanmasını kolaylaştırır. Ayrıca, bir sıvı sınıf düzenleyici borulama hızı ve yüksekliği yanı sıra aspirasyon ve her sıvı transfer adımı için dağıtım parametrelerini ayarlamak için izin verir. Her işlem, belirli bir kültür veya deneme plakası için hangi görevlerin gerçekleştirildiği retrace izin günlük dosyalarında belgelenir.

Nöronlar ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen diğer hücre tipleri (hiPSC) kişiselleştirilmiş ilaç taramaları için imkanı sunan belirli hasta popülasyonlarında nörodejeneratif hastalıkların mekanizmaları (örneğin Parkinson hastalığı için dopaminerjik nöronlar) çalışma için in vitro araçlar yararlıdır. HiPSC'nin culturing çok zaman yoğun ve genellikle düşük ölçekli üretim ile sınırlı karmaşık farklılaşma protokolleri yürütmek için eğitimli insanlar gerektirir. HiPSC'nin besleyicisiz kültürünü otomatik bir kültüre uyarladık ve iki nöronal farklılaşma protokolü uyguladık, bir tet-on organizatörü 10^altındaNGN2 aşırı ekspresyonuna dayalı hızlı bir kortikal nöron farklılaşma protokolü¹⁰,¹¹, ve orta beyinli dopaminerjik (mDA) nöronların üretimi için uzun vadeli küçük molekül tabanlı protokol¹³. Manuel kültürün ve farklılaşma protokollerinin basit aktarımı ve tekrarlanabilirliği otomatik kültür sistemini çok kullanışlı hale getirir. Otomatik hücre kültür sisteminde kültüre giren insan iPSC tutarlı kök hücre morfolojisi gösterdi ve bağımsız deneyler arasında tekrarlanabilir önemli pluripotency belirteçleri ifade etti. Buna ek olarak, hiPSC kültür protokolünün otomasyonu, paralel olarak daha fazla sayıda hücre hattının kültürünü ve genişlemesini tercih etti. Kullanıcı laboratuvardayken gerçekleştirilen akış aşağı işlem adımları için (örn. hücrelerin hasat edilmesi veya farklılaştırmalar için manuel rekaplama) için gün boyunca sistemden tasarruf sağlayan bir gecede yapılması planlanan otomatik birleştirme kontrolleri. Kullanıcı tarafından tanımlanan birleştirme eşiğine ulaşılırken, hücreler otomatik hücre kültür sisteminin istifleyicisinde bulunan hücre dışı matris kaplı plakalara dönüştürülür ve doldurulır. Her pasaj yuvarlak yaklaşık 70 dakika sürer ve bir ana plaka, bir gün içinde 20 pasajlar kapasitesi anlamına gelir dört 1-iyi plakalar üretir.

NGN2 farklılaşma protokolünün otomasyonu başarılı bir şekilde yapıldı ve farklı pasajlar arasında homojen nöronal hücre popülasyonunun oluşmasına ve manuel farklılaşmalarla karşılaştırılabilir bir popülasyonun oluşmasına olanak sağladı. Ayrıca, birden fazla hücre hattı veya binlerce test koşulları/bileşikiçeren tarama deneylerini içeren büyük ölçekli tarama çalışmalarının deneysel maliyetleri, hızlı farklılaşmalar nedeniyle azalacaktır. Canlı hücre neurite outgrowth ölçümleri de dahil olmak üzere maliyet-etkin ve yüksek iş çıkışlı okumalar kolayca geliştirilebilir, uygulanabilir ve hastalık modelleme için henotypic okumalar olarak kullanılabilir, daha önce gösterildiği gibi^14,15,16. Böylece NGN2 protokolünü, gfp'yi aşırı ifade eden küçük molekül türemiş nöral öncül (smNPC) hücreleri kullanarak da uyarladık. SmNPC hücreleri, kültür medyasıyla daha az maliyet (iPSC kültürüne sahip maliyetin üçte biri) ve deneyleri ölçeklendirmek için gereken süre dahil olmak üzere daha fazla avantaj sunar. SMNPC'den alınan hücre verimleri iPSC ile elde edilenden 7 ila 10 kat daha yüksektir. Ayırt edici nöronlar, manuel antikor boyamalarına veya kimyasal etiketlemeye ihtiyaç duymadan tam otomatik görüntüleme işlemi kullanılarak birkaç gün boyunca başarıyla izlendi ve görüntülendi, maliyetlerden ve tek başına görüntüleme de dahil olmak üzere manuel işlemler için gereken zamandan tasarruf edildi. 96 kuyulu bir plakanın iç 60 kuyunun mevcut görüntülemesi, kuyu başına 25 alan görüntülendiğinde plaka başına yaklaşık 16 dakika sürer, bu da 1000 bileşik için görüntüleme tabanlı tarama verilerinin bir günde elde edilip analiz edilebildiği anlamına gelir. Gelecekte, bu okuma nötrit büyüme kusurları nın kurtarılması için bileşik tarama çalışmalarında kullanılabilir.

Ayrıca, biz de iPSC orta beyin dopaminerjik (mDA) nöronlar üretmek için manuel bir diferansiyasyon protokolü transferi göstermektedir. Bu küçük molekül tabanlı farklılaşma protokolü 65 gün sürer ve birden fazla replating adımları ve sık medya değişiklikleri nedeniyle emek yoğun, çoğunlukla her 2 gün, aynı anda birkaç iPSC hatları için mDA nöronların üretimini sınırlar. Otomatik mDA farklılaştırma protokolü, düzinelerce iPSC satırına farklılaşmayı ölçeklendirme nin büyük avantajına sahiptir. 30 hücre hattına kadar paralel olarak ayırt edilebilir. Farklılaşma çoğunlukla medya değişikliklerine dayandığı için, neredeyse tüm farklılaşma süreci insan müdahalesi olmadan yürütülebilir. Otomatik sistemin takvim tabanlı zamanlayıcısı'nı kullanarak, ortam değişikliklerini farklılaşma adımlarına göre planlayabiliriz. Bu kadar çok sayıda hücre hattı ve kültür plakasıyla çalışmanın bir sınırlaması, bir gecede medya değişiklikleri gerçekleştirmek imkansızlıktı. Bunun temel nedeni, sistemimizin tek kullanımlık ipuçları nı kullanmak ve bu manuel adımı yürütmek için laboratuvarda bir kullanıcıgerektiren kültür ortamının manuel olarak doldurulması için kurulmuş olmasıdır. Ortam değiştirme işlemini kolaylaştırmak için, sisteme yüklenen plakalar bir projeye atanmış ve gruplar halinde gruplandırIlmiştir. Toplu iş boyutu daha sonra tek kullanımlık ipuçları ve mevcut kültür ortamının hacmi sayısına uyarlanmıştır. Yukarıda da belirtildiği gibi, bu sınırlama kolayca yeniden kullanılabilir / yıkanabilir iğneler ve medya otomatik dolum uygulanması ile aşılabilir. iPSC için gösterildiği gibi, hücrelerin otomatik geçişi/rekaplaması, otomatik hücre kültür sistemimiztarafından sunulan kolaylıklardan biridir. MDA nöronlarının otomatik rekaplamasını 25. Ancak, mDA nöronların ayrışması iPSC (8 dk) daha dissociation enzimi ile daha uzun (40 dk) kuluçka gerektirir hücre hatları başına 1 saat daha fazla otomatik replating süreci uzanan. Sonuç olarak, aynı gün içinde 30 hücre hattının otomatik rekaplaması imkansız hale geldi. Otomatik rekaplama (plakaların taşınması, pipetleme) sırasında diğer adımların hızlandırılmasını hızlandırmak ve sistemin bir gecede çalışmayı mümkün kılan iğne ve medya hattının kullanımına uyarlanması bu sınırlamayı çözecektir. Sakıncalarına rağmen, manuel protokolü önemli miktarda MAP2 (nöron) ve TH (mDA nöron) pozitif hücrelerle kültür üreten mDA nöronların otomatik bir farklılaşmasına başarıyla aktarabildik.

Düzinelerce iPSC hücre hattını paralel olarak ayırt etmek, Parkinson hastalığı da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların moleküler mekanizmalarını araştıran projelerde büyük ilgi görüyor. Ancak, görevleri daha az hata ve daha düşük maliyetlerle daha hızlı tamamlamak büyük bir sorundur. Burada sunulan protokollerin otomasyonu (iPSC, smNPC ve mDA nöron) sayesinde, projelerimizde hızlanabilir, maliyetleri azaltabilir ve tekrarlanabilirliği artırabiliriz. FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) gibi yüzlerce hasta hücre hattını içeren projelerin geliştirilmesi, otomatik kültür ve farklılaşma protokollerine duyulan ihtiyacı göstermektedir. Gelecekteki bakış açılarımız manuel 3 boyutlu (3D) hücre kültürü modellerinin otomatik sisteme aktarılmasını içerir. Plaka tanım ayarlarındaki küçük uyarlamalar ve adaptörlerin kullanımı, 3B kültürler için gerekli olan ticari veya özel yapım plakaların ve mikroakışkan odaların kullanılmasına olanak sağlayacaktır. Ayrıca, otomatik bir etiketsiz görüntüleme modelinin uygulanması bize gerçek zamanlı olarak nöronal büyüme izlemek ve neurite outgrowth değişiklikleri çevirmek sağlayacak, nöron organizasyon ve hücre ölümü hastalık mekanizmaları daha iyi anlaşılması içine.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antikorlar< / güçlü >	< güçlü > Dağıtıcı< / güçlü >	< güçlü > Katalog Numarası< güçlü >	< güçlü >Seyreltme< / güçlü >
< güçlü >iPSC pluripotens belirteci< / güçlü >
Fare anti-SSEA4	Abcam	ab16287	1 ila 33
Tavşan anti-Oct3 / 4	Abcam	ab19857	1 ila 200
NGN2 nöron belirteçleri
Fare anti-TUBB3	R & D	MAB1195	1 ila 500
Tavşan anti-BRN2	NEB	12137	1 ila 1.000
< güçlü>mDA nöron belirteçleri< / güçlü >
Tavuk anti-TH	Pel-Freez Biyolojikleri	12137	1 ila 750
Fare anti-MAP2	Santa Cruz	sc-74421	1 ila 750
< güçlü > İkincil antikorlar< / güçlü>
Keçi anti-tavuk IgY, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11039	1 ila 2.000
Keçi anti-fare IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029	1 ila 2.000
Keçi anti-fare IgG, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11032	1 ila 2,000
Keçi anti-tavşan IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1 ila 2,000
Keçi anti-tavşan IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1 ila 2.000
Keçi tavşan önleyici IgG, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11012	1 ila 2.000
Çekirdek karşı boyama
Hoechest 33342	Invitrogen	H3570	1 ila 8.000
Instruments	Distributor	Katalog Numarası	Tanım/Uygulama
>Agilent TapeStation sistemi	Agilent teknolojileri	4200	Otomatik elektroforez
Otomatik -20 &°; C depolama sistemi	Hamilton Storage Technologies	Örnek Erişim Yöneticisi (SAM -20C, 3200 serisi)	Reaktiflerin depolanması
Barkod okuyucu	Honeywell	Barkod Okuyucu Orbit	Barkod tarayıcı
Brightfield hücre sitomatı	Nexcelom	Celigo	Birleşme kontrolü ve hücre sayımı
CellVoyager 7000	Yokogawa	CellVoyager 7000	Hücre kültürleri için otomatik konfokal mikroskobu
	Cytomat Thermo Fisher Scientific	Cytomat 24 C, CU	12 istifleyici aralığı 28 mm, 12 istifleyici aralığı 23 mm (toplam 456 plaka)Numunelerin
çözülmesi için sitomat	Thermo Fisher Scientific	Cytomat 2-LIN, 60 DU (Kurutma Ünitesi)	2 istifleyici aralığı 28 mm (toplam 42 plaka)
HEPA filtreler	Hamilton Robotics	Hamilton Robotics tarafından modifiye	Hood Flow Star
Sıvı işleme istasyonu	Hamilton Robotics	Microlab Star	Kanalları: 8x 1 ml, 4x 5 ml ve 96 Kanal MPH
Medya rezervuarı	Hamilton Robotics	188211APE	Medya/reaktif rezervuarı
Saf su sistemi	Veolia Water	ELGA PURELAB Classic	iğne yıkama istasyonu için saf su sağlar
QuantStudio 12K Flex Gerçek Zamanlı PCR Sistemi	Thermo Fisher Scientific	QSTUDIO12KOA	Gerçek zamanlı PCR makinesi
Robotik kol	Hamilton Robotics	Rackrunner	Plakaların taşınması Tablayı
çevir	Hamilton Robotics	Döner Tabla	Plaka oryantasyonunu ayarlayın
Kesintisiz güç kaynağı	APC	Smart UPS RT Ünitesi, 10000 VA Güç besleme	Yedek güç kaynağı
VIAFLO-pipetler	Integra	4500	Elektronik pipet
ViiA 7 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi	PCR makinesi
Malzemeler	Dağıtıcı	>güçlüKatalog Numarası<	güçlü>Notlar
1 oyuklu kültür plakası (84 cm2)	Thermo Fischer Scientific	165218	Nunc OmniTray
6 oyuklu kültür plakaları (9,6 cm2)	Greiner Bio-One	657160	TC kapaklı işlem görmüş
12 oyuklu kültür plakası (3,9 cm2)	Greiner Bio-One	665180	TC kapakla işlenmiş
96 oyuklu kültür plakası (0,32 cm2)	Perkin Elmer	6005558	CellCarrier-96 Siyah
plaka Uçları, 50-&mikro; L	Hamilton Robotics	235987	50-uL uçlar
Uçlar, 300-&mikro; L	Hamilton Robotik	235985	300-&mikro; L ipuçları
İpuçları, 1000-&mikro; L	Hamilton Robotik	235939	1000-&mikro; L uçlar
Uçlar, 5 mL	Hamilton Robotics	184022	5 mL uçlar
Tüpler, 15 mL	Greiner Bio-One	188271	15 mL tüpler
Tüpler, 50 mL	Greiner Bio-One	227261	50 mL tüpler
Nalgene kriyojenik 2.0 mL şişeler	Sigma Aldrich	V5007	Cryovials
Plasmids	Distributor	Katalog Numarası	Notes
pLV_hEF1a_rtTA3	Addgene	61472	Ron Weiss'tan nazik hediye
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro	Addgene	61474	Ron Weiss'tan nazik hediye
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus	Takara Bio	631983
Primers	Sıra (ileri)	Dizi (ters)	Kaynak<>
güçlüiPSC çoğul gücü
OCT4 (Kimlik: 4505967a1)	CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG	GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC	PrimerBank
NANOG (ID 153945815c3)	CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA	CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC	PrimerBank
REX1 (ID 89179322c1)	AGAAACGGGCAAAGAAGAC	GCTGACAGGTTCTATTTCCGC	PrimerBank
NGN2 nöronları
MAP2 (ID 87578393c1)	CTCAGCACCGCTAACAGAGG	CATTGGCGCTTCGGACAAG	PrimerBank
BRN2 (ID 380254475c1)	CGGCGGATCAAACTGGGATTT	TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT	PrimerBank
CUX2 (ID 291045458c2)	CGAGACCTCCACACTTCGTG	TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG	PrimerBank
NCAM1 (ID 336285437c3)	TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC	CTCACAGCGATAAGTGCCCTC	PrimerBank
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)	TGCTCAGCAGTACAACGTACC	GACACTTGCGATGTCCTGGAA	PrimerBank
mDA nöronları
TH	CGGGCTTCGGACCAGGTGTA	CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA	NCBI PRIMER-BLAST
MAP2	GGATCAACGGAGAGCTGAC	TCAGGACTGCTACAGCCTCA	NCBI primer-BLAST
strong>Housekeeping genleri
GAPDH	GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG	GAGCCCCAGCCTTCTCCATG	NCBI astar-BLAST
OAZ1	AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT	ATGAAGACATGGTCGGCTCG	NCBI astar-BLAST
RPLPO	CCTCATATCCGGGGGAATGTG	GCAGCAGCTGGCACCTTG	NCBI PRIMER-BLAST
RPL13A	GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC	TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC	NCBI astar-BLAST
Medya ve Reaktifler< / güçlü >	< güçlü > Dağıtıcı< / güçlü >	< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >	< güçlü > Kullanım konsantrasyonu< / güçlü
> < güçlü > Kaplama matrisi< / güçlü >
hücre dışı matris (Matrigel)	Corning	354277	10 &; g / mL
Fibronektin	Corning	356008	2 & mu; g/mL
Laminin	Sigma	L2020	5 - 10 μ g/mL
Poli-L-Ornitin (PLO)	Sigma	P3655	0.1 mg/mL
Kültür ortamı
iPSC kültür ortamı (Temel 8 Flex ortam)	Gibco	A2858501
NGN2 nöronları - NGN2 orta
2-merkaptoetanol	Gibco	21985023	0.909 mL (50 & mikro; M)
B27 takviyesi	Gibco	12587010	10 mL (% 1)
DMEM / F-12, GlutaMAX	Gibco	31331093	484.75 mL
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL (2 mM)
İnsülin	Sigma	I9278	0.25 mL (2.5 ve mikro; g/mL)
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler	Gibco	11140050	5 mL (% 0.5)
N2 takviyesi	Gibco	17502048	5 mL (% 0.5)
Nörobazal ortam	Gibco	21103049	485 mL
mDA nöronlar - SRM orta< / güçlü>
2-merkaptoetanol	Gibco		21985023 0.5 mL (55 &mikro; M)
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL (2 mM)
Nakavt DMEM/F-12	Gibco	12660012	409.5 mL
Nakavt serum replasmanı (serum replasmanı)	Gibco	10828028	75 mL (% 15)
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler	Gibco	11140050	5 mL (% 1)
Penisilin-Streptomisin	Gibco	15140122	5 mL (% 1)
< güçlü > mDA nöronları - N2 orta< / güçlü >
B27 takviyesi	Gibco	12587010	10 mL (% 2)
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL (2 mM)
N2 takviyesi	Gibco		17502048 5 mL (% 1)
Nörobazal ortam	Gibco		21103049 475 mL
Penisilin-Streptomisin	Gibco	15140122	5 mL (% 1)
< güçlü > mDA nöronları - Farklılaşma ortamı< / güçlü >
B27 takviyesi	Gibco	12587010	10 mL (% 2)
Nörobazal ortam	Gibco	21103049	485 mL
Penisilin-Streptomisin	Gibco	15140122	5 mL (% 1)
NGN2 nöronları - Takviyeler
Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör (BDNF)	Peprotech	450-02	10 ng/mL
CHIR99021 (CHIR)	R& D	4423/10	2 μ M
Doksisilin (dox)	Sigma	D9891	2.5 & mu; g/mL
Glial Kaynaklı Nörotrofik Faktör (GDNF)	Peprotech	450-10	10 ng/mL
L-askorbik asit 2-fosfat magnezyum (AA2)	Sigma	A8960	64 mg/L
Nörotrofik faktör-3 (NT-3)	Peprotech	450-10	10 ng/mL
Purmorfamin (PMA)	Cayman	10009634	0.5 μ M
Puromisin	Sigma	P8833-10MG	0.5 & mu; g / mL
Tiazovivin	Merk Millipore	420220-10MG	2 & mu; M
mDA nöronları - Takviyeler
Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör (BDNF)	Peprotech	450-02	20 ng/mL
CHIR99021 (CHIR)	R& D	4423/10	3 μ M
DAPT	Cayman	13197	10 ve mikro; M
Dibutiril-cAMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	1
mM Fibroblast Büyüme Faktörü 8B (FGF-8b)	Peprotech	100-25	100 ng/mL
Glial Kaynaklı Nörotrofik Faktör (GDNF)	Peprotech	450-10	20 ng/mL
L-askorbik asit (AA1)	Sigma	A4403	0.2 mM
LDN193189 (LDN)	Cayman	11802	100 nM
Purmorfamin (Purm)	Cayman	10009634	2 & mu; M
Sonic Kirpi/Şş (C24II) N-Terminali (SHH)	R& D	1845-SH	100 ng/mL
SB431542 (SB)	Cayman	13031	10 μ M
Dönüştürücü Büyüme Faktörü tipi ß 3 (TGFß 3)	R ve Ge D	243-B3	1 ng/mL
Y-27632	Cayman	10005583	10 ve mikro; M
ayrışma reaktifleri
Tek hücreli ayrışma reaktifi (StemPro Accutase)	Gibco	A1110501	1x
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Gibco	11575020	0.5 mM
RNA izolasyonu ve cDNA kiti
RNA izolasyon kiti	Qiagen	74106	Rneasy MiniKit
RNA lizis tamponu	Thermo Fisher Scientific	15596018	Trizol lizis tamponu (RNA lizis tamponu)
Ters transkriptaz (kit)	Thermo Fisher Scientific	18080-085	SuperScript III Ters Transkriptaz
Yazılım	Company	Katalog Numarası	Tanım/Uygulama
Cell Culture Framework (CCF) (Grafik kullanıcı arayüzü, GUI)	Hamilton Robotics	Otomatik sistem için	özel yapım
CellPathFinder yazılımı (görüntü analiz yazılımı 1)	Yokogawa	CellPathFinder HCS Yazılımı	Görüntü analiz aracı
CellVoyager Ölçüm Sistemi	Yokogawa	Şunlarla birlikte verilir CellVoyager 7000	Mikroskop kontrol yazılımı
Columbus yazılımı (görüntü analiz yazılımı 2)	Perkin Elmer	Columbus	Görüntü analiz aracı
Bulut tabanlı qPCR uygulaması	Thermo Fisher Scientific	Themo Fisher bulut	qRT-PCR verileri Venüs için analiz yazılımı
yazılım	Hamilton Robotics	VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Yazılım	otomatik sistem için kontrol yazılımı