Bu protokol, bir doku kültürü çipinde bir sferoidden uzatılan sağlam bir akson demetinin kendiliğinden montajı yoluyla insan iPS hücre türevi motor sinir organoidini imal etmek için kapsamlı bir prosedür sağlar.
Akson fasikülleri sinir sisteminde gözlenen başlıca yapısal motiflerden biridir. Akson fasiküllerinin bozulması gelişimsel ve nörodejeneratif hastalıklara neden olabilir. Her ne kadar çok sayıda akson çalışması yapılmış olsa da, sağlam üç boyutlu in vitro modellerin eksikliği nedeniyle akson fasiküllerinin oluşumu ve işlev bozukluğu anlayışımız hala sınırlıdır. Burada, mikroakışkan tabanlı bir doku kültürü çipinde insan kaynaklı pluripotent sap (iPS) hücrelerinden bir motor sinir organoidinin (MNO) hızlı üretimi için adım adım bir protokol açıklıyoruz. İlk olarak, yöntem için kullanılan çiplerin imalatı açıklanmaktadır. İnsan iPS hücrelerinden motor nöron sferoid (MNS) oluşur. Daha sonra, farklılaştırılmış MNS çipe aktarılır. Bundan sonra, aksonlar kendiliğinden küreselden büyür ve çipte bulunan bir mikrokanal içinde bir fasikül haline gelir ve bu da küreselden uzatılmış bir akson demeti taşıyan bir MNO dokusu oluşturur. Aşağı akış analizi için, MNO’lar morfolojik analizler için sabitlenecek çipten çıkarılabilir veya biyokimyasal analizlerin yanı sıra kalsiyum görüntüleme ve çoklu elektrot dizi kayıtları için incelenebilir. Bu protokol ile oluşturulan MNO’lar ilaç testini ve taramasını kolaylaştırabilir ve aksion fasiküllerinin gelişiminin ve hastalıklarının altında kalan mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Spinal motor nöronlar (MN), vücut hareketini kontrol etmek için aksonları iskelet kaslarına uzatır. Aksonal yörüngeleri gelişim sürecinde son derece organize ve düzenlenmiştir. Axon uzatma ve rehberlik1ile ilgili birçok çalışmaya rağmen, organize akson demeti oluşumu için mekanizmalar hala incelenmektedir. Motor nöronların aksonları genellikle amyotrofik lateral skleroz (ALS)2gibi nörodejeneratif hastalıklardan zarar görür, ancak akson fasiküllerindeki hasarın patofizyolojik mekanizmaları iyi anlaşılmaz. Bu nedenle, alanda akson demeti oluşumunu ve gerilemesini rekapitüle etmek için fizyolojik ve patolojik bir model gereklidir.
İnsan kök hücre türevi motor nöron, ALS3gibi gelişimi ve hastalıkları anlamak için umut verici bir platformdur. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPS hücreleri) hasta kaynaklı hücreler kullanılarak hastalıkları modellemek için kullanılabilir. Bugüne kadar pluripotent kök hücrelerden MN’ye çeşitli farklılaşma yöntemleribildirilmiştir 4,5,6. Bununla birlikte, iki boyutlu kültürdeki nöronların aksonları rastgele yönlendirilir ve aksonların yoğun axo-aksonal etkileşimler yoluyla tek yönlü olarak bir araya getirildiği gelişen sinirler içinde in vivo mikroçevriciliği rekapitüle etmez7. Bu sorunun üstesinden gelmek için, insan iPS hücrelerinden motor sinire benzeyen üç boyutlu bir doku oluşturmak için bir teknik geliştirdik8ve dokuyu motor sinir organoidi (MNO) olarak adlandırdık. MNO, bir motor nöron sferoidinde (MNS) bulunan hücre gövdelerinden ve sferoidden uzatılmış bir aksonal fasikülden oluşur. Fasiküldeki aksonlar, motor sinirlerin gelişimindeki aksonlara benzeyen tek yönlüdür. Bu nedenle, MNO’lar benzersiz olarak, daha önce geliştirilen diğer nöronal kültür yöntemleri tarafından yapılmayan fizyolojik bir aksonal mikroçevronment sağlar.
Bu protokolde, geliştirilen çiplerde doku kültürü yongaları imalatı, hızlı motor nöron farklılaşması ve motor sinir organoid oluşumu için yöntemler açıklanmaktadır. Doku kültürü çipimiz çok basittir ve sadece bir küresel kabul etmek için bir bölme, bir akson demeti oluşturmak için bir mikro kanal ve axon terminallerini muhafaza etmek için bir bölme içerir. Cihaz, genellikle aksonları ve hücre gövdelerini9,10boyutuna göre ayırmak için kullanılan mikrogroovlar veya mikropor filtreleri de dahil olmak üzere karmaşık yapılar içermez. Bu nedenle, bir fotolithografi kurulumu mevcutsa, cihazlarımız bu protokolde açıklanan adımları izleyerek kolayca üretilebilir.
İnsan iPS hücrelerinin hızlı farklılaşması, indükleme ve desenleme faktörlerinin (SB431542, LDN-193189, retinoik asit (RA) ve yumuşatılmış agonist (SAG)) ve ivme faktörlerinin (SU5402 ve DAPT) optimize edilmiş bir kombinasyonu ile elde edilir. SU5402 ve DAPT kombinasyonunun periferik nöronların ve nöral kret hücrelerinin farklılaşmasını hızlandırdığı bildirilmiştir11. Bu protokolde, okuyucuların ihtiyaçlarına en uygun bir yönteme karar verebilmeleri için MNO’lar oluşturmak için üç farklı yöntem sunuyoruz. Farklılaştırılmış MNS doğrudan bir doku kültürü çipine aktarılabildiğinden, bir küresel (3D yöntem) oluşturduktan sonra insan iPS hücrelerinin farklılaştırılmasını öneririz. Alternatif olarak, insan iPS hücreleri monolayer (2D) kültüründe motor nöronlara ayırt edilebilir ve daha önce bildirdiğimiz gibi üç boyutlu motor nöron küresellere oluşturulabilir8. Protokolü güncelledik ve bu protokolde açıklanan üç boyutlu farklılaşma yöntemi ile 2D’den 3D’ye geçiş önlenebilir ve MNO’lar ayrışma adımı olmadan daha kısa farklılaşma süresi, daha az adım ve azaltılmış teknik risklerle elde edilebilir. Piyasada bulunan nöronlar, farklılaşma süresini azaltmak için MNS üretmek için de kullanılabilir.
Bir MNO oluşturmak için, doku kültürü çipinde bir MNS kültürü yaptık. Aksonlar küreselden uzaklaşır ve aksonların tek yönlü olarak toplandığı ve hizalandığı mikro kanala uzanır. Bu, mikrokanalde sıkıca monte edilmiş tek yönlü akson demet dokusunun axo-aksonal etkileşimini ve kendiliğinden oluşumunu kolaylaştırır, bu protokolle benzersiz bir şekilde elde edilirken, spontan demet oluşumu veya kılavuzlu aksonal yönelim tek başına diğer protokoller12 , 13,14ile elde edilebilir. Tipik bir deneyde, çok az hücre küresellerden mikro kanallara göç eder ve çoğu hücre sferoidlerin yakınında kalır. Bu yöntem, aksonları hücre gövdelerinden ayırmak için boyuta bağımlı fiziksel bariyerler (örneğin, mikrogroovlar veya mikropore filtreleri) kullanmadan aksonların sferoidlerden kendiliğinden ayrılmasını sağlar.
Ortaya çıkan MNO morfolojik, biyokimyasal ve fiziksel analizler de dahil olmak üzere çeşitli incelemelere tabi tutulabilir. Hücre gövdesi ve genişletilmiş akson demeti kesilerek fiziksel olarak izole edilebilir ve biyokimyasal tahliller gibi aşağı akış deneyleri için ayrı ayrı analiz edilebilir. RNA ve protein gibi biyolojik malzemeler, RT-PCR ve batı şişkinliği de dahil olmak üzere düzenli biyokimyasal tahliller için sadece birkaç akson demetinden izole edilebilir. Burada, akson fasiküllerinin gelişiminin ve hastalığının altında kalan mekanizmayı incelemek için çekici bir fizyolojik ve patolojik model sunan iPS hücrelerinden motor sinir organoidi üretmek için bir protokol açıklıyoruz.
Bu protokol, insan iPS hücrelerinden üretilen bir motor nöron küreselden uzatılmış bir akson demetine sahip bir motor sinir organoidinin (MNO) oluşumunu açıklar. Oluşan akson demeti kalın, esnek ve tek yönlü yapılarda iyi organize edilmiş. Akson demetinin diseksiyonu ile biyokimyasal analizler için yüksek saflıkta aksonal protein ve RNA elde edilebilir. Nöronal aktivite kalsiyum görüntüleme ile akson demetleri ve sferoidlerde ölçülebilir. Aksonal lisattaki nükleer ve dendritik proteinlerin kirlenmesi batı şişkinliği ile tespit edilmedi ve yöntemimizin aksonları hücre gövdelerinden ve dendritlerden verimli bir şekilde ayırdığını gösterdi.
Bu protokolün avantajlarından biri, tüm işlemlerin 3D protokol ile 4 haftada ve 2D protokol kullanılarak 5-6 haftada yapılabileceği bir akson demeti ile donatılmış MNO’nun hızlı farklılaşması ve üretilmesidir. Bu, embriyonik kök hücrelerden ve iPS hücrelerinden 17’ye MN’ye ayırt edilmesi tipik olarak3-4 hafta süren diğer protokollere kıyasla kısadır ve aksonal uzama elde etmek 2-4 hafta daha sürer. 3D protokolü, 2D protokolüne kıyasla ayrışma adımı olmadan daha kısa farklılaşma süresi, daha az adım ve azaltılmış teknik riskler nedeniyle genellikle 2D protokole göre tercih edilir. Mikroakışkan tabanlı doku kültürü çipi, MNS’nin aksonlarının mikrokanal aracılığıyla diğer bölmeye doğru uzaması için tasarlanmıştır, bu da aksonlar arasında akson etkileşimleri ve benzeşimi teşvik ederek bir akson demetinin oluşumunu kolaylaştırır. Basit deneysel kurulum nedeniyle, burada açıklanan tüm protokoller sadece bir doku kültürü çipinin manipülasyonuna aşina olan biyomühendisler tarafından değil, aynı zamanda mikroakışkanlara ve mikrofabrikasyon tekniklerine aşina olmayan biyologlar ve sinirbilimciler tarafından da gerçekleştirilebilir. Adım 1 ve 2’nin harici bir imalat hizmeti kullanılarak da gerçekleştirilebileceği unutulmamalıdır.
Protokolü gerçekleştirmek için kritik adımlardan biri, kültür ortamının sıralı bir değişimidir. Harcanan ortamdaki faktörlerin MN farklılaşmasını bozmaması için farklılaşma sırasında her adımda kültür ortamının tamamen değiştirilmesi önerilir. Bu protokolün bir diğer kritik noktası, farklılaşmamış iPS hücrelerini iyi kalitede tutmaktır. İlk iPS hücre kültürünün kalitesi, motor nöronlar ve MNO elde etme verimliliğini önemli ölçüde etkiler. Başka bir nokta, MNS çapının talaşın deliğinin boyutundan (1,5 mm) daha küçük olması gerektiğidir. Daha büyük küreseller odaya giremez ve potansiyel olarak orta kısımda şiddetli hipoksik nekroz yaşarlar. MNS’lerin boyutu, iPS hücrelerinin (3D protokolde) veya motor nöronların (2D protokolde) ilk tohumlama sayısı değiştirilerek kontrol edilebilir. Hücrelerin tohumlama yoğunluğu her iPS hücre hattı için optimize edilmelidir.
Mikrogroovlar ve küçük gözenek filtreleri ile bölmeli mikroakışkan cihazlar, aksonları hücre gövdelerinden ve dendritlerden ayırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu teknik ayrıca aksonları hücre gövdelerinden ve dendritten ayırabilir, demetlenmiş dokularda üstün akson bolluğu ile. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntemin önemli bir sınırlaması, doku kültürü çipinin mevcut tasarımında iki farklı kültür medyasını ayıramamasıdır, bu da iki farklı ortam gerektiren iki farklı hücrenin ortak kültür yeteneğini engeller. Diğer bir sınırlama, PDMS çipinin dokunun boyutuna önceden belirlenmiş bir kısıtlama koymasıdır. Delikten daha büyük bir küresel odaya giremez ve akson demeti mikroakışkan kanalın genişliğinden daha kalın büyüyemez.
Bu yöntem diğer nöron türlerine de uygulanabilir. Grubumuz serebral organoid teknikleri ile birlikte modifiye bir yöntem kullanarak serebral sistemi modelleme yeteneği göstermiştir18. Kortikal sferoidler her iki bölmeye de sokuldu ve aksonlar her bir küreseloide doğru karşılıklı olarak kendiliğinden uzadı ve daha sonra kendiliğinden bir akson demeti oluştu. Sonuç olarak, iki kortikal sferoid bir akson demeti ile bağlanabilir ve doku tek parça olarak elde edilebilir. Bu, nöronal hücre türlerinden bağımsız olarak akson demet dokuları oluşturmak için yaklaşımın çok yönlü olduğunu göstermektedir. Bu protokolde insan iPS hücreleri kullanılmıştır, ancak sunulan protokolde yapılan değişikliklerle insan ES hücreleri ve insan sinir kök hücreleri de dahil olmak üzere diğer kök hücreler kullanılabilir. Nöronların 3D sferoidleri çeşitli protokoller19,20ile üretilebilir. Bir akson demeti ile doku yapma bu yöntem potansiyel olarak gelecekte 3D MN sferoid yapmak için diğer farklılaşma protokolleri ile kombine edilebilir. Ek olarak, akson demetinin kalınlığı ve uzunluğu, gelecekteki gelişmeler için doku kültürü çipinin mikrokanellerinin genişliği ve yüksekliği değiştirilerek kontrol edilebilir.
Bu protokolün ilaç testi ve taraması için kullanılabileceğine ve akson fasiküllerinin gelişiminin ve hastalıklarının altında kalan mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunabileceğine inanıyoruz.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Japonya Bilimi Teşvik Derneği (JSPS) Bilimsel Araştırmalar için Yardım Hibeleri 17H05661 ve 18K19903, Core-2-core programı ve Beyond AI enstitüsü tarafından desteklendi.
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma | 440302 | |
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
200µl Wide Bore Pipet Tips | BMBio | BMT-200WRS | |
6-well plates | Violamo | 2-8588-01 | |
Accutase | ICT | AT104 | |
B-27 Supplement (50X) | Gibco | 17504044 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A6003 | |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Wako | 020-12913 | |
CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AIC | |
Cryostor CS10 | Stem Cell Technologies | 07959 | |
DAPT | Sigma | D5942 | |
DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
Fluo-4 AM | Dojindo Laboratories | CS22 | |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | |
Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) | Corning | 354230 | |
HB9 Antibody | Santa Cruz | sc-22542 | |
HBSS | Wako | 085-09355 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) | Cellular Dynamics | R1051 | |
Isopropyl alcohol (IPA) | Wako | 166-04836 | |
Knock Out Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Sigma | SML0559 | |
MEA probe | Alpha MED Scientific inc | MED-P5004A | |
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) | Sigma | M7145 | |
Microscope Glass | Matsunami | S9111 | |
mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 05825 | |
N2 supplement | Wako | 141-08941 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Photoresist SU-8 2100 | Microchem | #SU-8 2100 | |
Prime surface 96U | Sumitomo Bakelite | MS-9096U | |
ReLeSR (passaging reagent) | Stem Cell Technologies | 05872 | |
Retinoic acid | Wako | 186-01114 | |
SAG | Sigma | SML1314 | |
SB431542 | Wako | 192-16541 | |
Silicon wafer | SUMCO | PW-100-100 | |
Silpot 184 w/c kit | Dow Toray | Silpot 184 w/c kit | |
Smi32 Antibody | Biolegend | 801701 | |
SU5402 | Sigma | SML0443 | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
Synapsin I Antibody | Millipore | Ab1543 | |
TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) | Gibco | 12604-021 | |
Tuj1 Antibody | Biolegend | 801202 | |
Y-27632 | Wako | 030-24021 |